JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Forward Genetik skærme med makrofager til at identificere<em> Toxoplasma gondii</em> Gener Vigtigt for Modstand mod IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immunitet

Published: March 12, 2015
doi:
10.3791/52556
, , , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,New York Medical College

Summary

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Abstract

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in naïve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) er en obligat intracellulær, protozoal patogen. Det er det agens af toxoplasmose, en sundhedsfare i immunsvækkede personer. Det er også den model for andre Apicomplexan patogener, der inficerer mennesker, herunder Cryptosporidium og Cyclospora. Toxoplasmose er mest almindeligt erhvervet gennem indtagelse af mad eller vand forurenet med bradyzoite eller oocyst etape af parasitten. Ved indtagelse, disse stadier konvertere til tachyzoite fase af parasitten, der replikerer i værtsceller og formidler systemisk. T-celler, IFN-γ og, i mindre omfang, nitrogenoxid 1-4, er vigtige til kontrol af infektion, men er ikke i stand til at eliminere sygdommen, som en andel af tachyzoitter konverteres til bradyzoite fase der er beskyttet inden vævscyster hvilket resulterer i en lang levetid kronisk infektion. I virkeligheden er der ingen terapeutiske effektive mod kronisk cyste sTage af sygdommen. Svær toxoplasmose er oftest på grund af reaktivering af vedvarende infektion med bradyzoite etape af parasitten konvertere tilbage til den hurtigt replikerende tachyzoite fase karakteristisk for primær og akut infektion.

Tidlig overlevelse i lyset af den medfødte immunreaktion er vigtigt at give parasitten til opnå tilstrækkelige parasit numre, samt at nå distale steder, for at muliggøre etablering af kronisk infektion. T. gondii har udviklet strategier til at modvirke værtsforsvarsmekanismer, der sandsynligvis bidrager til dets evne til at replikere og sprede tidligt i infektionen. Først T. gondii danner en unik PV under parasit invasion, der stort set er adskilt fra endocytiske og eksocytiske processer i værtscellen sammenlignet med andre intracellulære patogener 5-9. Også, ligesom alle succesfulde intracellulære patogener T. gondii ændrer sin værtscelle for at skabe et tolerant miljø feller vækst. Dette omfatter omprogrammering værtscelle genekspression ved ændring værtscelle transkriptionsfaktorer herunder vigtige for regulering celleaktivering 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20 GRA16 21 og GRA24 22 har alle vist sig at være vigtige i reguleringen af transkriptionel respons og cellesignalerende kaskader af værtsceller inficeret med T. gondii. Nylige undersøgelser der anvender genetiske krydsninger mellem parasit stammer med forskellige fænotyper har været meget produktiv i at identificere parasit gener, der ligger til grund for parasit genotype-afhængige egenskaber, herunder unddragelse af immunitetsrelaterede GTPaser (IRGs) 16,19,23-26. Hos mus immunitetsrelaterede GTPaser (IRGs) er afgørende for bekæmpelse af type II og III genotyper af parasitten, mens den meget virulente Type I genotyper har udviklet mekanismer til at unddrage sig de murine IRGs. Det er imidlertid også klart, at parasitten har udviklet mekanismer til at unddrage sig antimikrobielle mediertorer ud over de IRGs og at nogle af disse mekanismer kan bevares på tværs af parasit genotyper 27,28. Desuden er meget lidt kendt om de kritiske formidlere af celle autonom immunitet mod T. gondii under human toxoplasmose. Parasite gener vigtige for resistens over for mediatorer af celle autonom immunitet kan også være vigtigt for overlevelse under tachyzoite at bradyzoite konvertering, som også kan udløses af værtens immunrespons. For eksempel kan nitrogenoxid på høje niveauer undertrykke parasit replikation i inficerede makrofager, men det kan også stimulere tachyzoite at bradyzoite omdannelse resulterer i cyste produktion 30-32.

ToxoDB er en funktionel genomisk database for T. gondii, der fungerer som en kritisk ressource for området i form af at give sekvens information for parasitten genom og adgang til offentliggjorte og ikke-offentliggjorte genomisk skala data, herunder community anmærkninger, gen exp undgå recidiv og proteomics data 33. Ligesom mange protozoiske patogener, at størstedelen af ​​genomet består af hypotetiske gener med ingen oplysninger baseret på gen-homologi at give indsigt i deres potentielle funktioner. Således forward genetik er et kraftfuldt værktøj til at identificere nye parasit gener er vigtige for immunforsvaret svig, cyste konvertering og andre funktioner kritiske for parasit patogenese samt ved omregning mellem forskellige udviklingsstadier. En yderligere styrke fremadgående genetik er, at det kan anvendes som et relativt ikke-forspændt tilgang at forespørge parasitten som de gener, der er vigtige for specifikke opgaver i patogenese, herunder immune unddragelse og cystedannelse. De seneste forbedringer i næste generation sekventering for mutational profilering har gjort det til en foretrukne metode til at identificere de ansvarlige parasit gener fra forward genetik studier ved hjælp af både kemiske og insertionsmutagenese 34-37.

ntent "> Det er vigtigt at identificere sårbarheder i T. gondii, der kan udnyttes til at øge effektiviteten af celle autonome immunmekanismer mod parasitten især dem, der kan også være aktiv over for resistente cyste scenen. Mod dette mål, en in vitro murine makrofag infektion og aktivering model blev udviklet til at identificere mutationer i parasitten, som specifikt forringe T. gondii fitness efter aktivering af inficerede makrofager, men ikke i naive makrofager. Denne makrofag skærm blev anvendt til at forespørge et bibliotek af T. gondii insertionelle mutanter for endeligt identificere T. gondii gener er vigtige for resistens over for nitrogenoxid 27,28. Isoleringen af et panel af T. gondii-mutanter med nedsat resistens over for aktivering af inficerede makrofager, især en markant følsomhed over for nitrogenoxid, viste anvendeligheden af skærmen for at identificere parasit gener vigtige for resistenstil mediatorer af celle autonom immunitet andre end resistensmekanismer beskrevet for de murine IRGs 28. Insertionsmutagenese har fordele i forhold til kemisk mutagenese til at generere et begrænset antal tilfældige mutationer i hver parasit klon og i teorien, lettere identifikation af stedet for mutation. Men identificere genomiske stedet i plasmid insertion i T. gondii insertionelle mutanter i praksis har været overraskende vanskelig i mange tilfælde 37. Insertion af et plasmid i et gen er også sandsynligt, at forstyrre funktionen af ​​et gen i modsætning til kemisk mutagenese, der typisk resulterer i enkelte nucleotidændringer. Imidlertid kemisk mutagenese med enten N-ethyl-N-nitrosourinstof (ENU) eller ethylmethansulfonat (EMS), kan tilbyde en øget evne til at analysere en større del af parasitten genomet sammenlignet med insertionsmutagenese, da det skaber flere enkelt nucleotid polymorfismer ( anslås til 10 -100) pr mutant 3438. Desuden har de seneste fremskridt inden hele genomet profilering gjort det muligt at bruge næste generation sekventering for at identificere den mest sandsynlige kandidat gener, der er ansvarlige for den identificerede fænotype af en muteret parasit 34,38. Uanset mutagenese fremgangsmåde, i sidste ende kræver bekræftelse af den rolle parasitten genet i resistens over for makrofagaktivering gendeletion og komplementering at opfylde molekylær Kochs postulater.

Evnen til at dissekere funktionen af et gen ved genetisk manipulation af både parasitten og makrofagen er vigtigt, da mange af generne identificeret via forward genetik i T. gondii, såvel som andre patogener, der stadig karakteriseres som hypotetiske gener med lidt at ingen sekvenshomologi med andre proteiner med kendte funktioner. Den aktuelle papir skitserer en generel fremgangsmåde, der kan anvendes til at identificere, om det afbrudte gen i en mutant er vigtigt for resistens over for et kendt ellerukendt mediator af celleautonom immunitet. Den indledende analyse af værten antimikrobielle faktorer udføres ved at vurdere overlevelsen af ​​vildtype og mutant parasitter i makrofager fra vildtypemus versus dem med specifikt gen deletioner i inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS), GP-91 phOx (NADPH oxidase), og specifikke immunitetsrelaterede GTPaser (IRGs). Dette vil afgøre, om de identificerede parasit gener er vigtige for resistens over for nitrogenoxid, reaktive oxygen mellemprodukter eller immunitetsrelaterede GTPaser 28 henholdsvis, eller hvis en ukendt immun mekanisme er involveret. Aktivering af inficerede makrofager med både IFN-γ og LPS, der er beskrevet i den nuværende protokol, resulterer primært i isoleringen af parasitten gener vigtige for resistens over for nitrogenoxid 28. Anvendelsen af ​​farmakologiske midler, der inducerer nitrogenoxid i fravær af makrofagaktivering (nitrogenoxiddonorer) bekræftede, at de fleste af de identificerede gener var vigtige for rekomststödets til nitrogenoxid snarere end nitrogenoxid i forening med yderligere mediatorer forbundet med makrofagaktivering 28.

Trin et og to beskrive en fremad skærm designet til at isolere parasit mutanter med en fitness defekt efter aktivering af inficerede knoglemarv-afledte makrofager in vitro genetik. Trin man beskriver en dosistitrering analyse empirisk bestemme en dosis af IFN-γ og LPS til brug for makrofagaktivering, der reducerer parasit replikation, men ikke helt inhibere replikation af vildtype T. gondii parentale stamme, der anvendes til oprettelse af et bibliotek af parasitten mutanter. Trin to beskriver fremad genetiske skærm af den mutante kloner i makrofager i 96-brønds plader. Trin tre skitserer en tilgang for at bekræfte fænotype hver mutant identificeret i skærmen af ​​de 96 brønde og at vurdere, om defekt i hver mutant påvirker parasit overlevelse, replikering,eller cyste produktion til makrofagaktivering. Trin fire beskriver anvendelsen af ​​knoglemarv-afledte makrofager fra mus med deletioner i specifikke antimikrobielle veje til at identificere de immunmediatorer som parasitten mutanten specifikt modtagelige. Trin fem skitserer en tilgang for at afgøre, om en parasit mutant også kompromitteres til in vivo patogenese som vurderet af cyste produktion i hjernen hos inficerede mus.

Protocol

BEMÆRK: Alle protokoller, der indebærer anvendelse af dyr blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og regler, der er fastsat ved New York Medical College Animal Care og brug Udvalg. BEMÆRK: detaljerede protokoller for kemisk mutagenese 38, isolering af parasitter ved begrænsende fortynding 38, isolering af murine knoglemarv afledte makrofager 39, væksten af T. gondii i human forhud fibroblast (HFF) celler og cyste produktion i makrofager og grundlæggend…

Representative Results

Toxoplasma gondii replikerer frit i naive makrofager og har en fordobling tid mellem 6-12 timer afhængig af stammen af parasitten. Figur 1 viser repræsentative parasitter i naive versus aktiverede knoglemarv-afledte makrofager. Figur 2 viser den generelle morfologi af parasitter i HFF værtsceller ved 2, 4, 8, 16 og 32 parasitter / PV. I den nuværende protokol, er parasitten lov til at invadere naive makrofager og etablere en spirende parasitophore vakuole (PV) før levering…

Discussion

Den beskrevne protokol giver en ikke-partisk tilgang, der bruger aktivering af murine knoglemarvafledte makrofager og forward genetik at isolere T. gondii mutanter med en defekt i deres evne til at overleve aktivering af inficerede makrofager. Fænotypen af ​​mutanter efter makrofagaktivering typisk falder ind under en af ​​to brede kategorier: 1) Parasitterne synes intakt, men undlader at replikere over 1 parasit pr PV; 2) parasitter forekommer nedbrudt og kan være i rummelige, amorfe solceller. Den o…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

Materials

Name of the material Company Catalog number Comments
DMEM Hyclone SH3008101 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBS Thermo SH3091003 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBS Thermo SH3002802  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamine Thermo SH3003401  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strep Thermo SV30010  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSS Thermo SH3003002 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPS LIST biologicals 201 http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-g Pepro Tech Inc 50-813-664 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slides Thermo 177402 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical plates Thermo 165306 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture plates 353072 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25 156367 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehyde 18505 http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100 Fisher BP151 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 – protein conjugation kit Life Technologies A20181 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serum MP Biomedicals ICN19135680 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting media Vector Labs H1200 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichos Vector Labs FL-1031 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTracker Life Technologies L-7526 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 mice Jackson Laboratories 664 http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out mice Jackson Labaoratories 2365 http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out mice Jackson Laboratories 2609 http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprusside ACROS Organics AC21164-0250  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOate ACROS Organics AC32865-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236 (2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Tags

Toxoplasma GondiiMacrophagesForward Genetics ScreenIFN-γCell Autonomous ImmunityParasite MutantsParasite GenesChronic InfectionTachyzoiteBradyzoite

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image