Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52556
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College
* These authors contributed equally

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) zorunlu hücre içi, protozoa patojendir. Bu toksoplazmozis etkeni, bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde bir sağlık tehlikesi olduğunu. Ayrıca Cryptosporidium ve Cyclospora dahil insanları enfekte diğer apicomplexan patojenlerin model sistemidir. Toksoplazmozis en yaygın parazit bradyzoite veya Ookist sahne ile kontamine yiyecek veya su yenmesi yoluyla elde edilir. Yemeye bağlı olarak bu aşamalar konakçı hücreler içinde replike ve sistematik olarak yaymaktadır parazitin tachyzoite aşamasına dönüştürün. T-hücreleri, IFN-γ ve daha az bir ölçüde, nitrik oksit 1-4'e, enfeksiyonun kontrol edilmesi için önemlidir, ancak takizoit bir bölümü olarak, hastalık yok etme yeteneğine sahip değildir doku kistlerinin içinde korunur bradyzoite aşamasına dönüştürmek Uzun ömürlü bir kronik enfeksiyon ile sonuçlanır. Aslında, hiçbir terapötik kronik kist s karşı etkili vardırHastalığın tage. Şiddetli toksoplazmozis birincil ve akut enfeksiyon hızla kopyalayan tachyzoite sahne özelliğine geri dönüştürme parazitin bradyzoite aşamasına nedeniyle kalıcı enfeksiyon reaktivasyonuna en sık olduğunu.

Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının karşısında Erken yaşam parazit yeterli parazit numaralarını ulaşmak için, yanı sıra kronik enfeksiyon kurulmasını sağlamak için, uzak sitelere ulaşmak için izin önemlidir. T. gondii olasılıkla çoğaltmak ve enfeksiyon erken yaymak için onun yeteneğine katkıda konak savunma mekanizmaları ile mücadele stratejilerini gelişti. İlk olarak, T. gondii diğer hücre içi patojenlere 5-9 kıyasla konak hücrenin endositik ve ekzositik süreçler büyük ölçüde ayrılmış olan parazit işgali sırasında benzersiz bir PV oluşturur. Ayrıca, tüm başarılı hücre içi patojenler T. gibi gondii f hoşgörülü bir ortam yaratmak için konak hücreye değiştirirya da büyüme. Bu hücre aktivasyonunu 10-15 düzenleme için önemli olanlar da dahil olmak üzere, konakçı hücre transkripsiyon faktörlerinin değiştirerek yeniden programlama konakçı hücre gen ekspresyonunu içerir. ROP16 16-19 GRA15 20 GRA16 21 ve GRA24 22 tüm T ile enfekte olmuş konakçı hücrelerin kaskadlar transkripsiyon yanıtı düzenlemek ve hücre sinyal önemli olduğu gösterilmiştir gondii. Farklı fenotip ile parazit suşları arasındaki genetik haçlar kullanarak Son çalışmalar bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS) 16,19,23-26 kaçırma da dahil olmak üzere parazit genotip-bağımlı özellikleri altında yatan parazit genlerin belirlenmesi oldukça verimli olmuştur. Çok virulent Tip I genotip sıçangil IRGS kaçınmak için mekanizmalar geliştirmiştir ise farelerde, bağışıklıkla ilgili GTPazlar (IRGS) Tip II ve kontrol parazit III genotip için önemlidir. Ancak, parazit antimikrobiyal medya kaçmasına mekanizmaları gelişti olduğu da açıktırbu mekanizmaların bazıları IRGS ve buna ek olarak ları parazit genotipleri 27,28 boyunca muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, çok az T. karşı hücre otonom bağışıklık kritik aracılarının hakkında bilinen İnsan toksoplazmozis sırasında gondii. Tachyzoite konukçu bağışıklık yanıtları ile tetiklenebilir dönüşüm bradyzoite için sırasında hücre otonom bağışıklık aracılarının direnç için önemli bir Parazit genler de hayatta kalmak için önemli olabilir. Örneğin, yüksek düzeyde nitrik oksit edilen enfekte olmuş makrofaj parazit kopyalanmasını bastırdığı, ancak, aynı zamanda kist üretimi 30-32 sonuçlanan dönüşüm bradyzoite için tachyzoite uyarabilir.

ToxoDB T. için fonksiyonel bir genomik veritabanı gondii o topluluk açıklamaları da dahil olmak üzere yayınlanmış ve yayınlanmamış genomik ölçekli veri dizisi parazit genomunun için bilgi ve erişim sağlanması açısından alan için kritik bir kaynak olarak işlev, gen exp ression ve proteomik verileri 33. Birçok Protozoal patojenlere benzer, genomun çoğunluğu potansiyel fonksiyonları içgörü sağlamak için gen homoloji dayalı hiçbir bilgi varsayımsal genlerin oluşur. Böylece, ileri genetik bağışıklık kaçırma, kist dönüşüm ve parazit patogenezinde yanı sıra farklı gelişim evreleri arasındaki dönüşüm için kritik diğer işlevler için önemli yeni parazit genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ileri genetik ek kuvveti bağışıklık kaçırma ve kist oluşumuna sahip patojenezindeki özgül görevler için önemli olan genler için bir parazit sorgulamak için göreceli olarak önyargılı bir yaklaşım olarak kullanılabilir olmasıdır. Mutasyon profil için yeni nesil dizileme son gelişmeler kimyasal ve sokma hem mutajenezin 34-37 kullanarak ileri genetik çalışmalar sorumlu parazit genlerin belirlenmesi için seçim yöntemi yaptık.

ntent "> Özellikle de dirençli kist aşamasında karşı aktif olabilir bu. Bu amaçla doğru, in vitro kemirgen parazite karşı hücre özerk bağışıklık mekanizmalarının etkinliğini artırmak için kullanılabilir T. gondii güvenlik açıklarını tespit etmek önemlidir makrofaj enfeksiyonu ve aktivasyon modeli, özellikle saf makrofajlarda edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu, ancak şu T. gondii, uygunluk olumsuz parazit mutasyonlara tanımlamak amacıyla geliştirilmiştir. Bu makrofaj ekran için T. gondii, sokma mutantlan bir kütüphane sorgulamak için kullanılmıştır, sonuçta nitrik oksit 27,28 direnç için önemli bir T. gondii, genlerin belirlenmesi. enfekte makrofajlar, nitrik oksit, özellikle belirgin bir duyarlılık aktivasyonuna bozulmuş dirençli T. gondii, mutantlarının bir panelinin izolasyon, tespit için ekranın yardımcı oldu direnç için önemli parazit genlerkemirgen IRGS 28 için açıklanan direnç mekanizmaları dışında diğer hücre özerk bağışıklığın arabulucular için. Araya sokulan mutajenez teorik olarak rastgele her paraziti klonu mutasyonlar ve mutasyon site daha kolay tanımlama sınırlı sayıda üretilmesi açısından kimyasal mutagenez fazla avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, T plasmid ekleme genomik yerinin tanımlama gondii sokma mutantlan, uygulamada, bir çok durumda 37 şaşırtıcı bir şekilde zor olmuştur. Bir genin bir plasmid yerleştirilmesi aynı zamanda, tipik olarak, tek nükleotid değişiklikleri ile sonuçlanan kimyasal mutagenez aksine bir genin işlevini bozması muhtemeldir. Birden fazla tek nükleotid polimorfizmini oluşturur Ancak, kimyasal mutagenez, N-etil-N-nitroso üre (TRK) ya da etilmetan sülfonat (EMS) ya sahip (araya sokulan mutajenez ile karşılaştırıldığında, parazit genomunun büyük bir kısmının, daha yüksek bir yetenek sunabilir mutant 34 başına 10 -100) tahmin, 38. Ayrıca, tüm genom profili son gelişmeler mümkün mutasyona uğramış bir parazitin 34,38 tanımlanmış fenotip sorumlu en olası aday genleri tanımlamak için yeni nesil sıralama kullanmaya yaptı. Ne olursa olsun mutagenez yaklaşımı, makrofaj aktivasyonu direnç parazit geninin rolü onay sonuçta moleküler Koch önermeleri yerine getirmek için gen silme ve tamamlanmasını gerektirir.

parazit ve makrofaj hem genetik manipülasyonu vasıtasıyla bir genin işlevini incelemek yeteneği T. ileri genetik ile tanımlanan genlerin çoğu önemlidir gondii, hem de diğer patojenler halen bilinen fonksiyonlar ile başka proteinler için bir dizi homolojisi için çok az varsayımsal genler olarak karakterize edilir. Bu yazı, bir mutant içinde kesintiye uğramış gen, bir bilinen ya da direnç için önemli olup olmadığını tespit etmek için kullanılabilir, genel bir yaklaşımın ana hatlarıHücre özerk dokunulmazlık bilinmeyen aracısı. Ev sahibi antimikrobik faktörler ilk analiz, vahşi tip ve uyarılabilir nitrik oksit sintaz (iNOS), gp-91 pHOx (NADPH oksidaz) özel gen silme olanlara karşı vahşi tip farelerden makrofajlar mutant parazitlerin yaşam değerlendirilerek yapılır ve Belirli bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS). Belirlenen parazit genler nitrik oksit, reaktif oksijen ara veya bağışıklıkla ilgili GTPases 28 sırasıyla veya bilinmeyen bağışıklık mekanizması dahil olup olmadığını direnç için önemli olmadığını gösterecektir. Mevcut protokolde tarif edildiği, IFN-γ ve LPS, her iki ile enfekte makrofajlar, aktivasyonu, öncelikle nitrik oksidin 28 direnç için önemli parazit genin izolasyonu ile sonuçlanır. makrofaj aktivasyonunun yokluğunda nitrik oksit neden farmakolojik ajan (nitrik oksit donörleri) tarafından tanımlanan genlerin çoğu yeniden önemli olduğunu gösterdinitrik oksit yerine makrofaj aktivasyonu 28 ile ilişkili ek arabulucular ile uyum içinde nitrik oksit direncin.

Bir ve iki in vitro enfekte olmuş kemik iliğinden türetilmiş makrofaj aktivasyonu takiben spor defektli parazit mutantlarını izole etmek için tasarlanmış bir ön genetik ekran tarif Adım. Bir parazit, çoğaltma azaltır, ancak tam olarak vahşi tip T replikasyonunu inhibe etmez makrofaj aktivasyonu için kullanımı deneysel olarak IFN-γ ve LPS'nin dozu belirlemek için bir doz titrasyon analizi tarif Adım Parazit mutantların kütüphanenin oluşturulması için kullanılan gondii ebeveyn suşu. İkinci adım 96 oyuklu plakalar içinde makrofajlar mutant klonların ileri genetik ekran tarif etmektedir. Üçüncü adım, her mutant kusur parazit yaşam etkileyip etkilemediğini, çoğaltma değerlendirmek ve 96 gözlü levhalar bir taramada tespit edilen her bir mutantın fenotipi teyit etmek için bir yaklaşım anahatlarımakrofaj aktivasyonuna karşılık olarak ya da kist üretimi. Dördüncü adım, parazit mutan özellikle hassas olan bağışıklık mediatörleri tanımlamak üzere, belirli antimikrobiyal yollarındaki delesyonu olan farelerin kemik iliği türevli makrofajlar kullanımını tarif eder. Adım beş enfekte farelerin beyinlerinde kist üretiminin tarafından değerlendirilir gibi bir parazit mutant da in vivo patogenezinde tehlikeye olup olmadığını belirlemek için bir yaklaşım özetlemektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Hayvanların kullanımını içeren tüm protokoller New York Medical College Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.
NOT: seyreltme 38, fare kemik iliği kökenli makrofajlar 39 izolasyonunu, T. büyümesini sınırlayıcı kimyasal mutagenez 38, parazitlerin izolasyonu için Ayrıntılı protokoller İnsan sünnet derisi fibroblast gondii (HFF) makrofajlar hücreler ve kist üretim ve temel immünoflüoresans analizi (IFA) 32 başvurulur. (% 10 fetal dana serumu, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Yüksek Glikoz Kartal Ortamı) D10 ortam içinde% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de, tüm hücre kültünü gerçekleştirmek . Hücre izolasyonların ve hücre kültürü boyunca steril tüm reaktifleri tutun.

IFN-γ ve Concentr belirlemek için LPS 1. doz titrasyonuations İleri Genetik Ekran için infekte makrofajların aktivasyonu için kullanın

  1. Kültür fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar O / N bölme başına D10 ortam 250 ul içinde 3 x 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda, sekiz bölme cam slaytlar. Kemik iliğinden izole sonra makrofajlar iki hafta birini kullanın.
    NOT: Oda slaytlar arttırıcı RS yıkama bir büyüme var satın alınır.
  2. Bir T25 doku kültürü şişesi içinde yetiştirilen insan sünnet derisi fibroblast (HFF) hücrelerinden elde edilen yabani tip parazitler saymak için bir hemasitometre kullanarak. D10 ortam içinde, ml başına 5 x 10 5 vahşi tip parazitler bir konsantrasyonda yeniden süspanse parazitleri. Makrofajlar O / N çoğaldı gibi 1: Bu konsantrasyon yaklaşık 1 enfeksiyon çokluğunda neden olur. Polipropilen parazit sopa gibi parazitler ile tüm manipülasyonlar için polistiren ya da PET tüpleri kullanın.
  3. Odacık slaytlar D10 ortamları çıkarın ve 250 ul ile değiştirinvahşi tip parazitlerin süspansiyon. Yavaşça her odanın iç yüzü aşağıya bakacak şekilde akmasına olanak sağlayarak sürgünün her bölmeye parazit süspansiyonu ekleyin. Makrofajlar protokol sırasında herhangi bir noktada kurumasına izin vermeyin.
  4. 4 saat boyunca% 5 CO 2 37 ° C'de bir kuluçka odası slayt kapağı ve yer ile parazit ile enfekte Kapak odası slaytlar istila ve bir PV kurmak parazit için zaman tanımak için.
  5. Doz titrasyon için steril tüplerde D10 ortam 1 ml LPS ve IFN-γ-yonunun seyreltileri yapmak. Doz için titrasyonlar LPS ya da IFN-y konsantrasyonu sabit ya da tutmak için diğer uyarıcı 40 değişir.
    1. Örneğin, mi başına 10 ng LPS LPS sabit tutmak ve IFN-γ (0, 1 ünite / mi, 10 birim / ml, 100 birim / ml, 1000 birim / ml) konsantrasyonu değişebilir. IFN-y mi, 100 birim / sabit γ ve LPS (0, 0.1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml) konsantrasyonu değişebilir tutun. 2 dakika olmadan için kısaca sonikat LPS stokseyreltme öncesinde bir banyo sonikatör (değil bir ucu sonikatör) ısıtma.
      Not: Sonikasyon hücreleri barındırmak için uygun şekilde bağlanan olmayabilir LPS tarafından oluşturulan misel agrega bozmak için tavsiye edilir.
  6. 4 saat odası slayt parazitler ve yapışık makrofajlar arasındaki ko-kültür başladıktan sonra, her odasında D10 ortamı atmak ve D10 medyada IFN γ ve LPS uygun dilüsyonlarının 300 ul ile değiştirin. Makrofaj aktivasyon üstü yokluğunda, parazit çoğaltma değerlendirmek için tek D10 ortamı ile bir kontrol içerir.
  7. 24-30 ilave saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde oda slayt kapak ve yer ile yeniden kapak bölme kayar.
    NOT: İnkübasyon süresi parazit gerginlik bağlı olarak 6-12 saat arasında değişebilir vahşi tip parazit ırkının iki katına süresine bağlıdır. Bir zaman noktası Naif makrofajlar erimesini asalak önce seçilir ama yeterince uzun, en az 3-4 dou etkinleştirmek içinBling süreleri.
  8. Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir% 2.5 formaldehid çözeltisi olun. Slaytı ortamı atılır ve% 2.5 formaldehid çözeltisi 300 ul ile değiştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika için düzeltildi.
  9. Iki odasının başına PBS 300 ul ile durulayın slayt (ler). Her durulama için, slayt PBS atmak ve slayt yapıştırılır makrofajlan bozmamak için her slayt odasının iç yüzü aşağı yavaşça yeni PBS ekleyin. Boyamadan önce kurumasını slaytlar önlemek için hazne slaytta odası ve yer kapağının başına PBS 300 ul ekleyin.
    Not: Slaytlar boyamadan önce, bu noktada 3 gün 4 ° C'de yerleştirilebilir.
  10. T. boyama protokolü mikroskobik (IFA) tarafından gondii algılama.
    1. PBS içinde% 0.2 Triton X-100 çözeltisi (permeabilizasyon tamponu) olun. Triton X-100 çözeltisi içine hareket etmesini sağlamak için 37 ° C su banyosu ve kısa bir süre için girdap bunun bir tüp içinde çözelti yerleştirin. IskartaPBS odası slaytlar ve permeabilizasyon tamponu 300 ul ile değiştirin. 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
    2. PBS (engelleme çözeltisi) içinde% 10 keçi serumu ihtiva eden bir çözelti yapmak. Slayt permeabilizasyon tampon atın ve odasına başına çözüm engelleme 300 ul ile değiştirin. 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
      Not: fetal buzağı serumu, tüm boyama protokollerinde keçi serumu ile ikame edilebilir.
    3. T., flüoresan-konjuge antikor 1000 seyreltme: bir aşamalı İFA boyama protokolü, bir 1 yapmak çözümü engelleme gondi. Slayt engelleme çözüm çıkarın ve odasına başına antikor çözeltisi 150 ul ekleyin. Kurumasını önlemek için hücrelerin slaytı üzerinde kapak slayt değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
      Not: Antikor konsantrasyonu deneysel kaynağına bağlı olarak belirlenmelidir. Antikor doğrudan bir florokrom konjuge veya kullanıcı tarafından bir florokrom konjuge satın alınan edilir.
      1. Iki aşamalı bir İFA boyama içinT. bir konjuge olmayan bir antikor ile protokol Toxoplasma gondii ve floresan konjuge sekonder antikor, T. karşı konjüge edilmemiş birincil antikor, 150 ul leke slaytlar oda sıcaklığında 1 saat süre ile blokaj tamponu içinde gondii vardır. 300 PBS ul artı% 1 keçi serumu (yıkama tamponu) ile 3x durulayın.
      2. Birincil antikor için kökenli türleri için özel floresan-konjuge sekonder antikor, 150 ul ekle. Kurumasını önlemek için hücrelerin slaytı üzerinde kapak slayt değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
    4. Durulayın slaytlar PBS artı% 1 keçi serumu (yıkama tamponu) ile 3x. Her durulama için, onun içeriğini boşaltarak odası slaytlar çözüm kaldırmak ve yıkama tamponu 300 ul ile değiştirin.
    5. Durulayın slaytlar PBS 300 ul 2x.
    6. Üreticinin talimatlarına göre bölme slayt odasına çıkarın.
    7. Montaj DAPI içeren ortam montajı (4'6-diamidino-2-fenil slaytlarindol, dilactate) ve 22 mm x 50 mm örtücü kısım.
  11. Faz kontrast ve floresan mikroskobu kullanarak slaytları inceleyin. Iyi odasının başına 100 PV'lerinin az inceleyerek vakuol başına parazitlerin ortalama sayısını belirler. ekran için IFN γ ve LPS seçilen doz, vahşi tip parazit (Şekil 1) çoğaltma bastırmak için yeterli olması gerekir, ama engel değil.

Enfekte Makrofagların Spor Hata ardından Aktivasyon ile Parazit Mutantlarının 2. izolasyonu

NOT: rastgele T. bir kütüphane gondii mutantlar ileri genetik ekran için gereklidir. T. rastgele mutajenezi gondii kimyasal (TRK / EMS) veya araya sokulan mutajenez 27,28,38 tarafından gerçekleştirilebilir. Sınırlayıcı seyreltme ve D10 ortam 32,38 200 ul bir hacim içinde yapışık HFF hücreleri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar içinde tek tek klonlar büyümesi mutagenez, klon parazitler et.Bu mikroskop ile makrofajlarda parazit elenmesi için 96-yuvalı plakalar mikroskopik olarak elenmesini sağlamak için optik taban sahip olması kritiktir. Tarama için Faz kontrast ve floresan mikroskobu, 96 gözlü levhalar faz kontrast 4, 10, 20 ya da uzun bir çalışma mesafesi için donatılmış 40X objektif bir ters flüoresan mikroskop gerektirir boyandı. Bir 4X objektif tüm çok iyi görülebilen, ancak parazitlerin iyi çözünürlük 20X objektif ile elde edilir için yararlıdır.

  1. Ikiye 96 oyuklu doku kültür plakaları içinde birleşik HFF hücreleri içinde büyür tachyzoite mutantlarının başına 50 ul D10 ortam 100 ul (1-2 hafta yalıtılmasından sonra) fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar içeren 96 gözlü levhalar çoğaltırlar.
    Not: her bir her transfer parazit sayısını zorunda kalmamak için, parazit kültür hacmine göre parazit 96 oyuklu plakalar içinde başlangıç ​​ekranını yapın. Bu nedenle, 2.6 mikroskopi analizi wheth üzerinde nitel dayanırer parazitler genellikle çoğaltılmış çoğaltılmış veya değil. Adım 3 makrofajları enfekte vahşi tip veya mutant parazitlerin eşit sayıda kullanılarak oda slaytlar mutantların fenotipi teyit etmek için bir yaklaşımı tarif eder.
    1. Doğrudan de her zaten D10 medya parazitleri ekleyin. Parazit çoğalması için bir pozitif kontrol olarak yabani tip takizoit iki kuyu Infect.
  2. Parazitler hücreleri istila ve PV oluşturmak için zaman tanımak için 4 saat boyunca bir inkübatör (37 ° C ve% 5 CO 2) içine enfekte hücreleri yerleştirin.
  3. Plaka içeriğini boşaltarak bir plaka ortamı çıkarın. Parazitler için bir deterjan cidal içeren bir ıskarta havzası içine plaka ortamı dökümü bilek tek kapağı kullanın.
    1. Medya ve bir çok kanallı pipet için steril bir havzayı kullanarak "makrofaj aktivasyon medya" 100 ul ekleyin. For Kademe 1 de tespit edilen optimal LPS konsantrasyonu ve IFN-γ kullanınrophage aktivasyon medya. Benzer şekilde yinelenen kontrol plaka ortamı çıkarın ve D10 medya 100 ul ile değiştirin.
  4. Ek 24-30 saat için bir kuluçka makinesi (2, 37 ° C ve% 5 CO) içine enfekte hücreleri yerleştirin.
  5. IFA için 96-yuvalı plakalar için boyama protokolü.
    1. Plaka ortamı atılır ve PBS içinde% 2.5 Formaldehit 100 ul ile değiştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Formaldehid ve çok kanallı bir pipet için steril bir havza kullanın.
    2. Plaka formaldehit çözüm atın ve plaka formaldehit durulama 100 ul PBS ekleyin.
    3. Plaka çözümü atın ve her kuyuya (% 0.2 Triton X-100 ile PBS) permeabilizasyon tamponu 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
    4. Plaka çözümü atın ve her kuyuya (% 10 keçi serumu ile PBS) çözümü engelleme 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
    5. P çözüm atınGeç. Ekleme / oyuk bir floresan-konjuge anti-T, 50 ul gondii antikorunun sulandırılmış 1: 1000 artı% 1 keçi serumu. Ve bir rocker plaka kapağı ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
      1. Alternatif olarak T karşı bir konjüge edilmemiş birincil antikor kullanımı gondii 1.10.3.1 tarif edildiği gibi bir floresan-konjuge sekonder antikor ile boyanarak, ardından.
    6. Plaka antikor çözeltisi atılır ve 100 ul / göz PBS artı% 1 keçi serumu ile değiştirin. Yalnız PBS ile 2 ek durular ardından bu durulama 3x gerçekleştirin. Her çukurdaki PBS içinde 200 ul boş ve kurutma kuyu önlemek için 96 oyuklu bir plaka üzerinde kapağı yerine takın.
      Not: parafilm sarılmış ve mikroskopi ile analizden önce 3 güne kadar 4 ° C 'de yerleştirilebilir kapaklı plaka.
  6. Bir 20-40X objektif kullanarak bir ters flüoresan mikroskop altında hücre inceleyin. Na & çoğaltmak Seç mutantlar# 239; makrofaj plaka ettik ama ağırlıklı olarak "aktif makrofajlar" bir parazit / vaküole ötesine çoğaltmak için başarısız veya amorf veya "aktive makrofajlar" parçalanır görünür.
    Not: vakuol başına vahşi tip parazit sayısı, ideal IFN-γ ve kullanılan LPS'nin dozu bağlı olacaksa da vakuol başına yaklaşık 4 parazitler olduğu; büyüme bastırma ancak aktivasyon uyaran çoğaltma tam inhibe yansıtan bir sayı.

Hata Enfekte Makrofagların Aktivasyonu takiben Parazit Survival Düzeyi veya çoğaltma de ise 3. belirleme Mutantlarına değerlendirin

  1. Aktarım HFF hücreleri ihtiva eden T25s 96 oyuklu plakalar (gözün tamamının içeriği) arasından parazit mutantlar seçilir ve çoğalmasını sağlar.
  2. Kültür, kemik iliği türevli makrofajlar O / N D10 ortamı 250 ul içinde 3 x 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda 8 bölme cam slaytlar. Pa karşılaştırmak için bir slayt hazırlayınnaif makrofajlar rasite çoğaltma ve ek slayt enfekte makrofajların aktivasyonu takip parazit çoğaltma karşılaştırmak için.
  3. Hasat tachyzoite parazitleri ve hemositometrede saymak. 5 × 10 4 T. ekle gondii de 4 saat süre ile D10 ortam ve kültürde makrofajların ihtiva eden bir bölmeye parazitleri. Bir kontrol olarak yabani tip ebeveyn parazitler ile bir kuyu ekleyin. Naif makrofajlarda parazitlerin çoğaltma izlemek için aktivasyon ortamı almayacaksınız, aynı parazit klon ile aynı çoğaltmak slayt aşılamak.
  4. Suret odası slaytlar 1 D10 medya atın ve "aktivasyon medya" 250 ul ile değiştirin. Diğer çoğaltmak odası slayt D10 medya atın ve D10 medya 250 ul ile değiştirin. Üzerine odası slayt kapağı ile "aktif" ve "naif" makrofaj slayt hem kuluçkaya bir Additi için 37 ° C ve% 5 CO 2 deÖnal 24-30 saat.
  5. Aşama 1 'de tarif edildiği gibi dokunulmamış odalı IFA boyama gerçekleştirme saptamak Permeabilize ve İFA boyama ve parazitlerin analizi için blok kayar.
    1. T. membran bağlantılı 1 (LAMP1) veya Lysotracker ve antikor lızozomal için bir antikor ile eş leke hücreleri enfekte makrofajlar aktivasyon lizozomlarında (Şekil 4) ile mutant PV'lerinin füzyon tetikliyor olup olmadığını gondii değerlendirmek için.
    2. Erken makrofaj aktivasyonu 28 Aşağıdaki belirgindir parazit mutant değişiklikleri tespit etmek IFA boyama parazit / PV içinde belirli bölme / organellere antikorları kullanın.
      NOT: Bu tür değişiklikler makrofaj aktivasyonu aşağıdaki mutant eksik yaşam / çoğaltma temelini mekanizması içgörü sağlayabilir.
  6. Bir 100X faz petrol objektif ve floresan mikroskobu kullanarak slaytları inceleyin.
    1. Belirleyerek parazit çoğaltma değerlendirin100 rastgele vakuollerde PV başına parazit sayısı. İstatistiksel analiz için, 100 hücre arası boşlukların her birinin en az 2 sayısını yapın.
    2. Genel Her iki floresan analizi kullanılarak parazit morfolojisi yanı sıra faz kontrast mikroskobu değerlendirin. Faz 100x hedefi altında Görünüm parazitleri. Sağlıklı parazitler parazitler sıkıca yakın oturan parasitophorous vacuole'nin içinde kapalı olması. Faz yoğun jantlar veya amorf parazitler ile amorf geniş vakuoller sahip Parazitler parazit ölüm yerine çoğaltma sadece bir kusur (Şekil 1 ve 3) öneririz.

4. Enfekte Makrofagların aktivasyonu Mutant Parazitler Duyarlılık bilinen anti-mikrobiyal Mediyatörlere ile ilişkili olup olmadığını değerlendirin

  1. - / -, Gp91-pHOx - vahşi tip C57 / BL6 farelerinde gelen iNOS, kemik iliği türevli makrofajlar izole / - veya Irgm1 / Irgm3 - / - fareler 32.
  2. Kültür, ilgili kemik iliği kaynaklı macrophages O / D10 ortamı 250 ul içinde 3 x 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda 8 bölme cam slaytlar N.
  3. Aşama 3'te tarif edildiği gibi, parazit mücadelesi IFA boyama ve analizi ile devam edin.
  4. Hayatta ve enfekte makrofajlar aktivasyonunu aşağıdaki çoğaltmak mutant parazitlerin yeteneği GTPases 28 ile ilgili reaktif oksijen veya nitrojen türlerinin ya da belirli bağışıklığın yokluğunda restore olup olmadığını belirleyin.
  5. Spesifik anti-mikrobiyal arabulucular sadece makrofajlar aktivasyon 28 diğer arabulucular ile uyum içinde hareket halinde HFF hücreleri veya naif makrofajlar mutant parazitleri zarar veya kendileri tarafından yeterli olup olmadığını değerlendirmek için, nitrik oksit vericisi olarak farmakolojik ajanlar, kullanın.

5. Değerlendirin Mutant Parazit Bozukluklarını Kronik Enfeksiyon Defekt olsun

  1. T25s co yetişen yabani türü, mutant veya hedeflenen gen silinmiş parazitler takizoit YalıtmakHFF hücrelerinin ntaining. Parazitler taze HFF kültürleri lize gerekir.
  2. Hemasitometre kullanarak parazitleri sayın. Intraperitonal (IP) enjeksiyon ile 200 ul içinde verilen bir parazit subletal doz mi uygun başına bir konsantrasyonda Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde yeniden süspanse parazitleri.
  3. 200 ul hacmi intraperitoneal (İP) ile parazitleri enjekte etmek için 1 ml tüberkülin şırınga ve 25 G iğne kullanın. Doz parazit yabani tip suşu fare genotipine bağlıdır.
    NOT: parazitin Tip I genotipleri ne olursa olsun parazit doz enfeksiyonun akut aşamasında farelere öldürücü ve T. kemoterapi yokluğunda kronik enfeksiyon çalışmalar için uygun değildir gondii paraziti çoğaltma bastırmak için.
  4. Otuz gün parazit mücadeleden sonra, standart bir boyut Fare kafesi, en fazla 5 m içerebilir (bir uncrowded odası içinde bir basınçlı tanktan CO2 inhalasyonu ile fareler kurbanBuz, sonra servikal dislokasyon).
  5. Kurulan prosedürleri 41-43 kullanılarak fare beyni izole edin.
    1. Ön tarafta fare yatırın. Alan sterilize etmek için% 70 etanol ile baş püskürtün.
    2. Beyin sapı kesmek için keskin bir makas kullanın. Daha sonra sığ bir sağ etrafında yanal kesme ve beyin sapı tabanından başlayarak kafatasının sol tarafında yapmak için diseksiyon makas kullanın. Yavaşça beyin maruz kafatasını geri soyma için forseps kullanın.
    3. Yavaşça beyin özgür koku siniri kesmek için kafatası beyin ve tabanı arasındaki beyin ve yer makas kaldırın. Steril forseps veya steril PBS 10 ml içeren bir bakteriyolojik Petri plaka bir spatula ve yeri ile beyin kaldırın.
  6. Sağ ve sol hemisfer arasında merkezi aracılığıyla steril bir bisturi ile yarısında beyin kesin.
  7. 1 ml PBS ihtiva eden küçük bir harç beyin yarısı ekleyin. Için havan kullanınGeniş delik 20-200 ul pipet geçebileceği beynin ince bir doku süspansiyon yapmak.
    NOT: Doku kesitleri histopatolojik için gerekirse beynin diğer yarısı 1 saat% 2.5 formaldehit sabit olmalıdır.
  8. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, beyin lisatı, 100 ul koyun. Boyama için beyin süspansiyonu düzeltmek için beyin lizatını içeren tüpe PBS içinde% 2.5 formaldehit 1 ml ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  9. Bir mikrosantrifüjde 5 dakika boyunca 8000 x g'de lizat santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant atılır.
  10. Lizat (% 10 keçi serumu, PBS içinde% 0.2 Triton X-100) ile geçirimli hale / Bloke edici tamponun 1 ml ilave edilir. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  11. Santrifüj 5 dakika boyunca 8.000 xg'de lizat ve süpernatant kaldırmak.
  12. FITC-konjüge Dolichos biflorus agglutin (DBA) 200 ul ekle. PBS içinde lektin artı% 10 keçi serumu, 100 seyreltme: 1 kullanın. Yavaşça pipetleme lizat tekrar süspansiyon. Kuluçkaya yatmakoda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
    Not: DBA parazit kist duvar CST1 bağlanan bir liganddır.
  13. Santrifüj 5 dakika boyunca 8.000 xg'de lizat ve süpernatant atın. Pelet PBS 1 ml ilave edilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. PBS yıkama 3x tekrarlayın. Bir pipet kullanarak nihai yıkama aşağıdaki süpernatantı.
  14. Bir mikroskop lamı üzerine lekeli beyin lisatından ve yerin 5 ul hazırlamak için geniş bir delik 20-200 ul pipet kullanın. Beyin lizat ıslak montaj oluşturmak için 25 x 25 mm kapak kayma ile slayt monte edin. Beynin 5 ul her lizata kullanarak 3 suret slaytlar olun.
  15. 10X objektif (Şekil 6) kullanarak floresan mikroskobu ile her 5 ul aliko başına kist sayısını.
    NOT: Bazı kistler bazı (kist başına 1-2 parazitler) çok küçük ise büyük (8 veya daha fazla parazit yaklaşık) vardır. Küçük kistlerin sayısı karşısında büyük her slayt ama belge sayısı başına kist toplam sayısını sayın.
  16. Kistler det sayısını ekleyansıtılmaktadır (sadece beynin yarım lizatından haline getirilmiştir), toplam seyreltme faktörü x 2 ile üç farklı 5 ul hacimde ve çarpma beyin başına toplam kistlerin sayısını tahmin etmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Toxoplasma gondii naif makrofajlar serbestçe çoğaltır ve 6-12 saat parazit suşu bağlı arasında iki katına zaman vardır. 1 aktif kemik iliği kökenli makrofajlar karşı naif temsilcisi parazitleri göstermektedir. Şekil 2 HFF parazitlerin genel morfolojisi gösterir 2, 4, 8, 16 ve 32 parazitler / PV hücreler ev sahipliği. Mevcut protokolde, parazit naif makrofajlar istila ve enfekte makrofajlar için güçlü aktivasyon uyaran, LPS ve IFN-teslim öncesinde doğmakta parasitophorus çarpıtma (PV), kurmak için izin verilir. Bu modelde, vahşi tip parazitler replikasyon geciktirilir, fakat parazitin çoğaltma hala makrofajlar parazit replikasyonunun engellenmesi gittikçe daha usta ve bu süre içinde yaklaşık 24 saat süreyle devam eder. Ekran güçlü makrofaj a için gerekli zaman arasında bir modifiye rekabet modeli olarak işlev için tasarlanmıştırvahşi tip parazit veya parazit mutant kendi PV içinde çoğaltmak devam edebilirsiniz sırasında zamana karşı ctivation. Ekranın ilk adım LPS'nin bir doz seçmek ve IFN-y edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu için kullanılacak γ. Doz deneysel LPS bir konsantrasyon aralığı veya IFN-y konsantrasyonu (Aşama 1) 'in bir dizi LPS'nin sabit bir dozu ile kombinasyon halinde IFN-γ sabit bir doz ya aktive edilmiş makrofajlarda parazit çoğaltma değerlendirilmesiyle belirlenir. Aktivasyon uyaranların doz kimyasal veya araya sokulan mutajenez sayesinde parazit mutantlarının oluşturulması için kullanılan ebeveyn doğal tip parazitler için değerlendirilmesi gerekir. İdeal LPS ve IFN γ dozu saf makrofajlar PV başına 8-16 parazitler ile karşılaştırıldığında aktivasyon sonrasında PV 24-30 saat başına 2-8 parazitlerin ortalama parazit çoğaltma izin verecektir (Şekil 1 ve 2).

LPS ve IFN-y ve uygun bir konsantrasyonda bir kez ^7; tespit edilir, mutantlar, 96 oyuklu bir optik tabanlı doku kültür plakaları içinde taranır. Geleneksel doku kültürü plakaları için kullanılan plastik düzensizlikler zor faz kontrast ve floresan mikroskobu ile parazitleri ekrana uygun çözünürlük elde etmek yapar çünkü plakalar optik alt önemlidir. 96 oyuklu plakalar faz kontrast ve floresan mikroskobu faz kontrast 4, uzun çalışma mesafesi için donatılmış 10, 20 ya da 40x objektif ile bir ters flüoresan mikroskop gerektirir. Mutantlar fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar içeren kopya plakalarda taranır. Parazit mutantları ile meydan okuma sonra, tek bir levhanın gözleri içine enfekte makrofajlar enfekte makrofajlar içeren diğer levha yalnızca D10 ortamında kültürlenmiştir ise LPS ve IFN-γ ile aktive edilir. Plakalar, LPS ve IFN-y γ ilavesinden sonra 24-30 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 ile kuluçkalanır. İnkübasyondan sonra, hücreler, fi olarakxed, parazitler için lekeli ve floresan ve faz kontrast mikroskobu hem kullanılarak IFA tarafından analiz. Mutantlar, normal parazit numaraları ve naif makrofajlarda çoğaltma ama daha az parazit veya aktive enfekte makrofajlar daha az parazit ile küçük vakuoller var seçilir. Mutantlar daha yüksek büyütme parazit morfolojisi analizi (100X objektif ve yağ) etkinleştirmek için ve onlar naif makrofajlar normal çoğaltma olduğunu onaylamak için iki bağımsız deneylerde makrofajlar naif olarak oda slaytlar (Adım 3) içinde tekrar elenebilir ve aktif edilmelidir seçildikten sonra ancak çoğaltma / hayatta kalma bir kusur makrofaj aktivasyon takip.

Enfekte makrofajların aktivasyonu direnç kusurların ile mutantlar fenotipleri genellikle iki geniş kategoriye ayrılır: morfolojik sağlam görünen, fakat PV başına tek bir parazitin ötesine çoğaltmak mümkün olan parazitler; ve görünen parazitler degrad edilecekEd ve amorf geniş PV'lerinin (Şekil 1 ve 3) olabilir. morfolojisi ve parazit ince yapısı ve PV iyi bir 100X objektif ve yağ kullanarak slaytlar ve floresan analizleri ile birlikte faz kontrast mikroskobu ile görülüyor. Lızozomal bağlantılı membran proteini-1 (LAMP1) için bir antikor ile IFA için parazitlerin boyama mutant kusur lizozomlar ile füzyonu önlemek için PV bir yetersizlik ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için faydalıdır. Konak hücrenin (LAMP1 negatif) olarak endositik sisteminden büyük ölçüde ayrılmış olan bir PV olan bir parazit karşı bir phagolysosome (LAMP1 pozitif) içinde bir parazit Şekil 4'te gösterilmektedir. phagolysosome tüm parazit çevresinde gergin LAMP1 sürekli bir katı ağız ile belirgindir. Buna karşılık, bir PV genellikle yakın lizozom organellere ancak çevresinde LAMP1 boyama herhangi bir sürekli çevre kenarına sahip bulunmaktadır. t tanımlanan yapıları / organellere antikorların kullanımıO asalak ve / veya PV edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu ile bağlantılı her mutant anormallikleri tanımlamak için IFA çalışmaları takip yararlıdır. Antikorlar ile bu tür sorgulama bir mutant çoğaltma / hayatta kalma kusur altında yatan mekanizmaları içgörü sağlayabilir. Örneğin, Şekil 5, T. gösterir gondii mitokondri monoklonal antikor 5F4 anti-F1 ATPaz p alt-birimi (Peter Bradley bir tür hediye) vahşi tip parazit veya parazit mutantları ile enfekte olan makrofaglar ve aktive edildikten sonra, 24 saat ile boyanmıştır. T Toxoplasma gondii, bir monoklon anti-T ile birlikte lekeli gondii antikor. Yabani tip T. gondii parazitin çevresi etrafında uzanan tek bir mitokondri sahiptir. enfekte makrofajlar aktivasyonu takip vahşi tip parazitler de parazitin tek mitokondri mutant parazitler bir parçalanmış mitokondri kıyasla sağlam oldu. Mitokondri parçalanma değil, sadece bozulmuş / amorf belirgindiparazitler aynı zamanda faz kontrast mikroskobu ile değerlendirildi normal morfoloji görüntülenen parazitler. Bu parazit mutant kusur makrofaj aktivasyonu ile uyarılan hücre mediatörleri barındırmak için parazit mitokondri duyarlılığını artırmak olabileceğini düşündürmektedir.

şimdiki model enfekte makrofajlar etkinleştirmek için IFN γ ve LPS bir kombinasyonunu kullanır. IFN-γ transkripsiyon faktörü STAT1 uyarır. LPS, TNF-α gibi, transkripsiyon faktörü NF-KB uyarır. T. karşı hücre özerk bağışıklığın önemli bağımlı antimikrobiyal arabulucular γ Bilinen IFN gondii diğer ajanların yanı sıra, bir IFN-γ-bağımlı bağışıklık ile ilgili GTPazlar dizisini (IRGS, Gbps) ve reaktif nitrojen ve oksijen türlerini içerir. Olmadığını belirlemek için, her mutant kusur özellikle -inducible antimikrobiyal aracıların γ bilinen IFN-y üretimi ile ilişkilidir, kemik iliği türevli makrofajlar izole edilmiştirİNOS - / -, gp 91 pHOx - / - ya da belirli bir IRG / GBP geni silinmiş fareler ve mutant parazitlere karşı aktivitesi için deneye tabi tutuldu. enfekte makrofajlar etkinleştirmek için IFN γ ve LPS kombinasyonu tercihen vahşi tip 28 parazitleri göre nitrik oksit gelişmiş duyarlılık ile mutantlar sonuçlanır.

Enfekte makrofajların aktivasyonu takizoit doku kistlerinin içerdiği bradizoitlerinin ortalama ile parazitlerin sahne farklılaşmasını neden olabilir. Bu tür kistler, kronik enfeksiyon karakteristiktir. Böylece, virüslü makrofajların aktivasyonu aşağıdaki çoğaltma / hayatta kalmak için kusurlu parazit mutantlar da in vivo enfeksiyon sırasında kist dönüşüm için arızalı olabilir. Kronik enfeksiyon sırasında kist değerlendirilmesi için, fareler, ebeveyn parazit soyunun bir öldürücü olmayan dozun ya da mutant klonu ile karın içinden (ip) olarak zorlanmaktadır. Daha az 10 boyutta beyin aralığında Kistler _6;. Daha büyük 50 um m çapında Şekil 6'da gösterildiği gibi IFA hem büyük ve küçük kistlerin sayısını ama parazit mutant toplam kist üretimi için ya da sadece kurulması için bozulmuş ise sayıları belirlemek için ayrı tutmak Büyük kistlerin ve bakımı.

Şekil 1,
Şekil 1. Saf fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar T. replikasyonuna izin vardır Toxoplasma gondii, ancak IFN-γ ile aktivasyonu ve LPS ile esas olarak replikasyonunu inhibe eder. (A), yabani tip T bir parasitophorous vacuole'nin (PV) gondii 24 naif fare kemik iliği kökenli makrofajlar işgalinden sonra saat. (B) vahşi tip T. PV gondii enfekte makrofajların aktivasyonu sonrası vakuol 24 saat başına dört parazitlerin oluşan paraziti.(C) bir parazit / PV edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu 24 saat sonra hala replike olamıyorsa, ve bir mutant parazit örneği. (D), enfekte olmuş makrofaj aktive edildikten sonra amorf bir PV, 24 saat içinde bozulmuş görünür bir mutant parazitin örneği . Üst satır parazitlerinin faz görüntüler gösterir ve alt sıra T. karşı bir poliklonal anti-serumu kullanarak floresan görüntüleri gösterir gondii. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Parazit çoğaltma PV toplam parazit sayısı değerlendirilmiştir. Resim 2, 4, 8, 16 ve HFF hücreleri içinde PV başına 32 parazitleri göstermektedir. Her resim bir birleştirilmiş faz görüntüsü thkırmızı parazit ve mavi (DAPI) içinde HFF çekirdeğin poliklonal antikor boyama gösterir. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. mutantlar edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu takiben fenotiplerin bir sırasını gösterir. Sol kolon makrofajlarda parazitin bir faz görüntüsüdür, merkez kolon T. bir antikor kullanılarak floresan görüntü gondii ve sağ sütun faz ve floresan görüntünün bir birleştirme olduğunu. Parazit, yeşil ve mavi makrofaj çekirdeğinde gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Şekil 4,
Şekil 4. LAMP1 boyama phagolysomes içeren parazitler PV'lerin ayırır. Parazitler bir poliklonal anti T. ile boyanır mAb 1D4B (yeşil) ile gondii antikoru (kırmızı) ve LAMP1. Bir ok lizozomlardan ile kaynaşmış olan bir parazit PV işaretler. ok olmadan parazit lizozomlardan ile kaynaşmış olan bir parasitophorous vacuole'nin (PV) bulunmaktadır. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. Yabani tip parazitler mitochondri ise sağlam bir mitokondri korumakEnfekte makrofajların aktivasyonu takip parazit mutantlar parçalanır üzerinde. Üç farklı mutant T. ile karşılaştırıldığında vahşi tip parazitler de mitokondri (yeşil) (üst panel) gondii bozulması (alt üç panel) farklı aşamalarında edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu 24 saat sonra parazitleri. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Lektin biflorus FITC-konjuge Doliços kullanarak beyinde parazit kist Şekil 6. Algılama. Lektin ile etiketlenmiş kist duvarı yeşil gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. Daha büyük bir versio görmek için buraya tıklayınızBu rakamın n.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan protokol fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar ve T. izole etmek için ileri genetik aktivasyonunu kullanan olmayan bir önyargılı bir yaklaşım sağlar yeteneklerini bir kusur ile gondii mutantlar enfekte makrofajlar aktivasyonunu hayatta kalmak için. mutantlar aşağıdaki makrofaj aktivasyon fenotip tipik iki geniş kategorilerden birine girer: 1) parazitler sağlam görünen, fakat PV başına 1 parazitin ötesine çoğaltmak için başarısız; 2) parazitler bozulmuş görünür ve ferah, amorf PV'lerden olabilir. mutantlar aktivasyonun yokluğunda naif makrofajlar yabani tip parazitler gibi bir fenotipe sahip olması protokol spesifik olarak makrofaj aktivasyonu mukavemet etme kabiliyetleri bozulmaktadır mutantlann tespit edilmesi için de kullanılabilir göstermektedir. primer kemik iliği kaynaklı makrofajların kullanımı ekran RAW 264.7 makrofaj hücre hattına karşı önerilir, çünkü vacu başına parazit, parazit sayısı morfolojisiole daha kolay kemik iliği kökenli makrofajlar içinde görülür.

ileri genetik ile birlikte açıklanan ekran parazit genleri ve hücre özerk bağışıklığın özel arabulucular direnç için önemli sonuçta genetik yollar incelemek için çok yönlü bir araç sağlar. Böyle ileri genetik çalışmalar in vitro ve patogenezi sırasında hem özel antimikrobiyal direnç arabulucular için önemli parazit yollar çözülüyor başlamak için bir dize gibi takip edilebilir parazit genleri tanımlamak için önemlidir. Ileri genetik yaklaşımlar ile önceki zorluk, her mutant bozulduğu anahtar genin tanımlanması oldu. T. kozmid kütüphanesi tamamlama gondii hücre bölünmesi mutantların fonksiyonel tamamlaması için oldukça etkili olmuştur. Bununla birlikte, yabani tip parazitler çoğaltma de sadece mutantı daha az bir ölçüde, IFN-γ ve LPS tarafından bastırılmış olduğu gerçeği, fonksiyonel tamamlama daha zor hale getirir thaHücre bölünmesi mutantlar n. T. kimyasal ve insersiyonel mutantlar hem de tüm genom mutasyon profili gondii son zamanlarda üretken olarak ortaya çıktı ve hatta ileri genetik ekranlarında 34,36,37,44 mutantların fenotipleri sorumlu genleri tanımlamak için etkili, cadde mal olmuş. Sonuç olarak, yeni nesil sıralama kullanarak tüm genom mutasyon profilleme T. kimyasal mutagenezin potansiyel kullanım artırmıştır ileri genetik çalışmalarda gondii belirli fonksiyonlar için önemli genleri tanımlamak için. Mevcut protokolde tarif edildiği gibi böyle bir ileri genetik yaklaşım T. genomunun en önemli olan gondii bağışıklık kaçırma önemli aday parazit genlerin tanımlanmasında yardımcı olabilecek diğer genler ya da işlevsel etki için bir homolojiye sahip öngörülen bir gen çoğunlukla varsayımsal kalır.

96 oyuklu plakalar IFA analizi, genel olarak bir araya bir yüksek veri akışı tarama kabul edilmezhod. Bir kişi bir günde 10 96-kuyu plakaları ya da yaklaşık 960 mutantlar leke ve ekran için bizim deneyim makul olduğunu. Skariah ve diğ., Kağıdın içinde, yaklaşık 8.000 mutant analiz edildi ve 14 bağımsız mutantlar aktif değil naif makrofajlar 28 hayatta kalma / çoğaltma için bozulmuş olduğu izole edilmiştir. mutantların engelli yaşam baskın nitrik oksit artan duyarlılık sonucu oldu. genel yöntemde sınırlama öncelikle parazit tek klonları elde ziyade 96 kuyu plakalar ilk ekran nitel ve makul hızlı olduğu gibi mikroskobu ile tarama seviyesinde olduğunu. 96 gözlü bir levhanın elemede tanımlanan mutantların fenotip teyidi oda slaytlar makrofajlar kullanılarak niceliksel ve niteliksel analizi ile Adım 3'te ve vahşi tipli ya da mutant parazitlerin eşit sayıda ekleyerek takip edilir. Diğer analitik eleme yöntemlerinin kullanılmasıBu tür parazitlerin toplam nüfusu düzeyinde fluorometri olarak, yerine mikroskopi tarafından değerlendirilir bireysel parazit seviyesinden daha, bozulmuş parazitler gibi birçok T. karşı poliklonal antikor ile leke mevcut protokol sorunlu gondii kadar sağlam olarak mutant floresan yoğunluğu düzeyinde nicel daha nitel olmak fark ile yabani tip parazitler. Ayrıca, IFN-γ ve daha sonraki zaman noktalarında da olsa vahşi tip parazitler bastırılmış çoğalmasında enfekte makrofajlar sonuçlar aktivasyonuna direncinde bir bozukluğu olan mutantlar izole etmek için gerekli olan LPS'nin dozu. Bu nedenle, Işıklı parazitler kullanımı da dahil olmak üzere ileri genetik ekran için toplam parazit sayısının ölçümü sorunludur. Bununla birlikte, kimyasal veya araya sokulan mutajenez için kullanılan ebeveyn parazit klonlar, bir kurucu ya da uyarılabilir floresan veya Lucifer'i ifade eğer boyama protokolü eleme aşaması elimine edilebilir mümkündürase işaretleyici. 96 yuvalı plakalar içinde makrofajlar IFA ve mikroskop tarama kullanılarak açıklanan protokol aktive edilmiş makrofajlarda hayatta kalma / çoğaltma için arızalı mutantın izolasyonu sağlar ama aynı zamanda açık bir şekilde elde edilebilir, 96 oyuklu plaka formatı olarak kullanılarak sınırlı mikroskopik çözünürlük nedeniyle bazı potansiyel mutantlar kaçırır Bu çözünürlükte parazit antijen için leke amorf şişmiş vakuoller normal PV içinde sağlıklı kopyalayan parazitler için yanlış olabilir. 96 gözlü cam kapak plakaları yerine, bir optik yüzeyi ile 96 yuvalı plakalar ikamesi, 96 gözlü plakalar içinde enfekte olmuş makrofaj ekran esnasında daha büyük bir çözünürlük elde etmek olasıdır.

Parazit işgali aşağıdaki makrofajlar etkinleştirmek için açıklanan protokol IFN-γ ve LPS kullanılarak belirlenen mutantların büyük çoğunluğu nitrik oksit 28 kendilerini korumak için kendi yeteneği bir kusur var. Bu bağlamda, ekran olmayan yanlı olması amaçlanmıştır, ancakaktivasyon koşulları, Çeşidi ve makrofajların türleri ve ekran için seçilen makrofaj aktivasyonu ile yakından parazit istilası nisbetle zamanına bağlı olarak spesifik bir antimikrobiyal aracıların karşı daha hassas olan bir parazit mutantların izolasyonu için zenginleştirebilir. Bu nedenle ekran ve uygulanan aktivasyon uyaranlara seçilen doğal immün hücre elde edilen asalak mutantlar duyarlı olması muhtemel olan antimikrobiyal aracıların türü etki önemli parametrelerdir. parazitin genotip ayrıca, Tip II ve III genotipleri 26,45,46 daha hassastır süre parazitin genotipleri IFN-γ yanıt olarak oluşturulan bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS) nispeten dirençli olan tür olarak kritik bir parametredir. Açıklanan protokol, makrofajlar parazit istilasından sonra aktive edilir. Tip II genotipi, ancak tarif edilen ekranda kullanılan Prugnaud soyu, bağışıklıkla ilgili GTPases etkisine duyarlı olan birParazit makrofajlar istila llowing ilk IRGS tam indüksiyon öncesi vahşi tip parazit çoğaltma sağlar. Ayrıca, IRGS istilayı ve replikasyonunun başlatılmasını asalak sonraki makrofajlarda neden olup olmadığını parazite karşı etkili olduğu açık değildir.

açıklanan protokol-IFN γ-bağımlı hücre özerk dokunulmazlık, özellikle nitrik oksit arabulucular direnç için önemli parazit genleri tanımlamak için makrofajlar kullanır. nitrik oksit belirgin bir duyarlılık yanı sıra nitrik oksit-bağımlı mitokondriyal parçalanma paylaşılan fenotip paylaşan parazit mutantlar bir havuz izolasyon nitrik oksit ve anlayış için parazit genleri ve direnç için önemli yolları belirlemek için eşsiz bir araçlar kümesi sağlar T. karşı daha geniş bir nitrik oksit eylem Toxoplasma gondii ve küçük değişikliklerle, başka ökaryotik pathogens.The açıklanan protokol ileri genetik STUDIE için kullanılabilirs hücre özerk bağışıklığın farklı arabulucular direnç için önemli parazit genleri tanımlamak için. Muhtemel tadilatlar işgali asalak enfekte konakçı hücre türü, aktivasyon uyaranı veya aktivasyon zamanlamasını değiştirilmesini kapsayabilecektir. Örneğin, parazitlerin ilave edilmeden önce, IFN-γ ile sıçangil makrofaj aktivasyon öncesi bağışıklık ile ilgili GTPases aktivasyonuna neden olur. T. Böyle bir model Tipi parazit genleri tanımlamak için kullanılan olabilir ben genotipleri gondii bağışıklıkla ilgili GTPases 24,25 ile ROP18 ve ROP5 aracılık ettiği dirence katkıda bulunabileceğini. T. karşı hücre özerk bağışıklığın Arabulucular İnsan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde gondii yanı kemirgenler gibi tanımlanmış değildir. Bu nedenle, insan periferal kan monositleri kullanımı T. kimyasal mutantların taranması için gondii doğuştan gelen bağışıklık hücreleri insan enfeksiyonu yanı sıra fo insanlarda önemli mekanizmalardan sırasında hayatta kalmak için önemli hem de parazit genleri tanımlamak olabilirT. r antimikrobiyal direnç gondii. Bu tür reaktif oksijen veya nitrojen türleri gibi farmakolojik maddeler için enfekte olmuş konakçı hücrelerin maruziyetini koruyamamıştır mutantların izole edilmesi suretiyle tespit edilebilir spesifik bir antimikrobiyal aracılarının direnç için önemli bir Parazit genleri bulunmaktadır. Benzer bir protokol aktivasyonunu 47-49 veya makrofaj purinerjik reseptörlerin 50 ATP uyarılması inflammasome karşı daha hassas olan bir parazit mutantların izole edilmesi için modifiye edilebilir.

Birlikte ele alındığında, protokoller T. için önemli parazit mutantlar izole ileri genetik ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri kullanarak bir yaklaşım tarif gondii direnç IFN-γ-bağımlı hücre özerk bağışıklık. Önemli olarak, bu yaklaşım ortaya koymak çok yönlüdür ve hali hazırda konakçı hücreler veya durumlar encounte stres direnci, belirli tiplerinde belirli antimikrobiyal mediyatör parazit yaşam kaçma önemli parazit genleri izole etmek için değiştirilebilirtoksoplazmozis sırasında kırmızı. Bundan başka, bir çok durumda, konakçı hücre aktivasyonunu direnç göstermek için önemli parazit genler de enfeksiyon sırasında, in vivo olarak kist üretiminde doğrudan veya dolaylı olarak bir rol oynuyor olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Hyclone SH3008101 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBS Thermo SH3091003 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBS Thermo SH3002802  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamine Thermo SH3003401  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strep Thermo SV30010  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSS Thermo SH3003002 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPS LIST biologicals 201 http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γ Pepro Tech Inc 50-813-664 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slides Thermo 177402 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical plates Thermo 165306 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture plates Fisher 353072 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25 Fisher 156367 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehyde Ted Pella 18505 http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100 Fisher BP151 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 - protein conjugation kit Life Technologies A20181 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serum MP Biomedicals ICN19135680 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting media Vector Labs H1200 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichos Vector Labs FL-1031 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTracker Life Technologies L-7526 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 mice Jackson Laboratories 664 http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out mice Jackson Labaoratories 2365 http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out mice Jackson Laboratories 2609 http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprusside ACROS Organics AC21164-0250  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOate ACROS Organics AC32865-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236 (2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Tags

İmmünoloji Sayı 97, Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücre içi patojen bağışıklık kaçırma bulaşıcı hastalık ileri genetik parazit
İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B.,… More

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter