מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.
PCR כמותי המבוסס על בדיקה (qPCR) הוא שיטה מועדפת למדידת שפע תמליל, שכן הוא אחד מהשיטות זיהוי הרגישים ביותר המספקת ניתוח מדויק ושחזור. כימיה מבוססת Probe מציעה את הקרינה רקע לפחות בהשוואה לchemistries אחר (המבוסס על צבע). נכון להיום, יש כמה פלטפורמות זמינות שכימיה מבוססת בדיקה שימוש כדי לכמת שפע תמליל. qPCR בצלחת גם 96 הוא השיטה הנפוצה ביותר באופן שגרתי, אך רק למקסימום של 96 דגימות או miRNAs ניתן לבדוק בטווח אחת. זה זמן רב ומייגע, אם מספר גדול של דגימות / miRNAs הוא להיות מנותח. פלטפורמות מבוססות בדיקה תפוקה גבוהה כגון מיקרופלואידיקה (למשל כרטיס מערך TaqMan) ומערכי nanofluidics (למשל OpenArray) הצעת קלות וביעילות reproducibly לזהות את השפע של מיקרו-רנ"א המרובים במספר גדול של דגימות בזמן קצר. הנה, אנחנו מדגימים את ניסיוני התקנהnd פרוטוקול כדי לכמת את מירנה מסרום או דגימות פלזמה EDTA, באמצעות כימיה מבוססת בדיקה ושלוש פלטפורמות שונות (96 צלחת גם, מיקרופלואידיקה ומערכי nanofluidics) מציעה רמות גוברים של תפוקה.
מייקרו RNA (miRNAs) הוא ~ 22 נוקליאוטידים (NC) RNAs ללא קידוד, מתפקד כרגולטורים של ביטוי גני 1-3. רוב miRNAs בבעלי חיים לתפקד באמצעות זיווג בסיס רצף ספציפי עם mRNA, מיקוד 'UTR 3, מה שמוביל לרגולציה שלילית של ביטוי גני 2-4. זו מתרחשת בדרך כלל באמצעות בלימת תרגום mRNA או אחר טיפה-off ריבוזומלי. miRNAs במחזור הוכח להיות סמנים ביולוגיים חדשניים במחקר ובשדות קליניים עבור מגוון רחב של מחלות, כגון סוכרת 5-7, השחלות 8, סרטן הערמונית וסרטן השד 9 10,11, צהבת מסוג B 12 ומחלות אוטואימוניות אחרות 13. מחקר נערך לזהות miRNAs בשפע בתאים או רקמות שונים, כמו גם שבמחזור מפלזמה אנושית ודגימות סרום, שהוא נגיש יותר ופחות פולשני 9,11-15.
שיטות שונות של כימות מירנה היו דוארstablished באמצעות פלטפורמות מרובות, כגון פלטפורמת 96-היטב סטנדרטית צלחת 4,12,16-18, פלטפורמת כרטיס מיקרופלואידיקה 12,18-23 ופלטפורמת מערך nanofluidics 17,24. בזמן אמת PCR (qPCR) מציע את היכולת למדוד מספרים יחסי או מוחלטים של תמלילים באמצעות מרובה (dye- או מבוסס בדיקה) chemistries. כימיה PCR בזמן אמת המבוססת על הבדיקה מציעה את היתרון של הקרינה רקע נמוכה ורגישות גבוהה לגילוי עותק תמליל בודד. הוא יחסית חסכוני, פשוט לשימוש ומאוד לשחזור, מה שהופך את שיטה מועדפת לכימות וקביעת ביטוי מירנה 25. שיטת qPCR מבוססת בדיקה בדרך כלל כרוכה בשני שלבים: להפוך שעתוק (RT) וqPCR 4,26,27. RT הוא המקום שבי פריימר גזע הלולאה RT הוא הכלאה למולקולת מירנה בוגרת או עיקרי והמיר ל- DNA משלים (ג). כימות של מוצר cDNA מתבצעת לאחר מכן באמצעות פריימרים PCR מירנה ספציפיים26-28. עיקרון qPCR מבוסס בדיקה מבוסס על זיהוי של הארכה משלימה גדיל בזמן אמת, הכוללת הידרוליזה של החללית מתויג fluorescently. בדיקות אלה נועדו להכיל כתב ניאון ומרווה, כי הם פשוט בנפרד כדי לאפשר סריג (העברת הקרינה תהודה אנרגיה). זיהוי של הפליטה מכתב הקרינה (פולט) מוסווה בקרבתה של מולקולת המרווה. כאשר פולימראז תקי (pol) משתרע מפריימר במעלה הזרם ומגיע מזלג (סוף '5 של הבדיקה), פעילות exonuclease pol תקי hydrolyses הבדיקה, שהובילה לניתוק / הפרדה פיזית של פולט הניאון מהמרווה. גרסה זו של מולקולה בודדת של פולט הקרינה שתועדה על ידי הגלאים ומוצגת כגידול מצטבר באות הקרינה שמגם / תגובה. העלייה בקרינה היא פרופורציונלית לכמות של מוצר ה- PCR שנוצרה, המאפשר qu מדויקantification של 26,28 היעד המוגבר.
עם ביקוש גובר בכימות מירנה, בינוני לטכנולוגיות תפוקה גבוהה פותחו כדי לאפשר למספר גדול יותר של דגימות לעיבוד בפרק זמן קצר. מערך TaqMan בצפיפות נמוכה (TLDA) הוא עיצוב בינוני תפוקה חדשני microfluidic מבוסס על הכימיה qPCR מבוסס בדיקה מציע גידול במספר miRNAs ניתח בצלחת אחת. TLDA כרוך בשימוש בברכה מוגדרת מראש של RT-פריימרים המשמשים לסינתזת cDNA. אז cDNAs אלה הסתחררו לתוך 384 גם מיקרו-fluidic כרטיס מותאם אישית כדי לקבוע את הביטוי של miRNAs מרובה באמצעות qPCR 22,26,29. היטב בכל הכרטיס מכיל מיובש פריימרים ובדיקות כדי להגביר מירנה ספציפית (ים), ולכן עד 384 תגובות יכולות להיות מעובד בכרטיס היחיד TLDA 26.
מערך nanofluidics הוא פלטפורמת תפוקה גבוהה המשמשת לזיהוי של תמלילי גן <sup> 24 תוך שימוש באותה הכימיה מבוססת בדיקה. הוא מנצל מטריצת קניינית מציעה אינטראקציות הידרופוביות-הידרופילי כדי להקל על טעינה קלה של תערובת תגובת 33 nanoliter למערך של 3072 דרך חורים בשקופית נירוסטה 24. מאמר זה מתמקד במדגים כיצד שיטות אלה לכימות miRNAs בסרום / פלזמה מבוצעות והגורמים הקריטיים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע ופרשנות נתונים כאלה. נלקחו בחשבון, היתרונות האישיים שלהם ואת המגבלות יידונו במאמר זה.
השלבים הקריטיים בפרוטוקולי qPCR מבוסס הבדיקה כדי לקבל תוצאות מדויקות ושחזור הם לעשות 1 בטוח) את אותו הנפח והריכוז של RT-מוצר טעון בכל תגובת qPCR, 2) היחסים ונפחים הנכונים של הרכיבים דרושים ל תגובת qPCR מוכנה ומעורבת היטב, 3) הכרכים הנכונים ועקביים מתווספים לכל תגובת qPCR, ו -4) העריכה ולטעינה של כל דגימה ותגובת תמהיל הושלמה בזמן הקצר ביותר אפשרי, ועדיין מודעים ל השלבים הקריטיים מעל שהוזכרו קודם לכן.
כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה צריכים צנטריפוגות המתאימה ודליים ספציפיים. כל אחד מהסלים יכולים להכיל עד 3 כרטיסים (עמוסים / ריק). תמיד לוודא שכל 3 החריצים של דלי עסוקים והדלי הוא מאוזנת על ידי הצבת דלי דומה (הדלי הזה צריך להכיל גם 3 כרטיסים, ריקים או מלאים) בחריץ השני של צנטריפוגות. תוך שימת הכרטיס בbuckeבעל t, לוודא כי המאגרים 8 להקרין כלפי מעלה ובארות תגובת הפנים לקיר החיצוני של צנטריפוגות. ספין הכרטיסים ב331 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר. אחרי הספין ראשון, לפתוח את צנטריפוגות וחזותית להבטיח את תערובת התגובה כבר חילקה באמצעות 384 הבארות. חזור על הספין באותן הגדרות עבור 1 יותר זמן. הסר את הכרטיס מהדלי ולהבטיח כי רמת תערובת תגובה בכל אחד מהמאגרים 8 היא אחידה. כל חוסר עקביות בנפחי הנוזל שנותרו במאגרים להפוך את הכרטיס לשימוש בלתי הולם נוסף.
כדי לקבל את אותו הריכוז של RT-המוצר, אותו ריכוז קלט של רנ"א הוסיף לכל תגובת RT. סך הכל ריכוז RNA נמדד באמצעות מיקרו-volumespectrophotometer. היחס נצפה 260/280 יכול להיות נמוך כמו 1.3 לRNA מבודד מפלזמה / סרום; זה לא נראה שיש להם השפעה על תהליך הקשור לqPCR במורד הזרם או נתונים שנוצרו 30. כמו כן, יחס 260/280 שלדגימות RNA נבדקו במסמך זה היו בין 1.3-1.7 ללא תופעות חריגות בqPCR נצפו.
בעת שימוש בדגימות נמוכות RNA תוכן, כמו אלה מbiofluids, זה עלול להיות קשה לכמת RNA לפני העיבוד. אנו ממליצים על השימוש בספייק-בסינטטי בבידוד RNA, כמו גם את שלבי שעתוק לאחור. מניסיוננו, מועמדי ארבידופסיס thaliana מירנה (ATH-miR-159a וATH-miR-172a) עדיפים על miRNAs elegans Caenorhabditis (כגון cel-miR-39 או cel-miR-54), אשר בניסיון שלנו עשוי להיות גבוה יותר הומולוגיה מאלה מא thaliana. השימוש בספייק-בשלב ספציפי כזה יכול להסביר את הנורמליזציה של נתונים מירנה פני דגימות מרובות assayed בזמנים שונים. שימוש קבוע קלט נפח של RNA לתגובת סינתזת cDNA מומלץ גם 32,33.
שלושה הפרוטוקולים מבוססים-הבדיקה לכימות מירנה שתוארו כאן דורשים כמויות משתנותשל קלט RNA הכולל, זרימות עבודה ועלויות שונות. כל אחד מתהליכי העבודה נועד לספק תפוקה שונה המבוססת על מספר מטרות מירנה ומספר הדגימות להיות מנותחים. עם הגדלת תפוקה (96 rxn rxn 3072 384 rxn), העלות לכל תגובה יורדת עם עלייה בכמות של נתונים המתקבלים על יחידת זמן. מאז כל פלטפורמות אלה לנצל כימיה TaqMan, ניתן לצפות באיכות של נתונים המתקבלים להיות דומה. TaqMan qPCR הוא שיטה מבוססת היטב לזיהוי השפע של miRNAs בדגימות סרום / פלזמה 9,11,27. למרות ששלוש הפלטפורמות שנדונו כאן חולקות את אותה הכימיה, ירידה בנפח התגובה מובילה לירידה בטווח דינמי של גילוי תמליל (פאר RJ et al., נתונים שלא פורסמו). פלטפורמת qPCR 96-גם היא תפוקה נמוכה יותר, אבל פלטפורמת רגישות גבוהה ולדעתנו, "תקן הזהב" לכל פלטפורמות PCR (או דיי מבוסס) המבוסס על הבדיקה. עם זאת, ייתכן שזהלא תהיה הפלטפורמה החסכונית או יעילה ביותר אם כמה מאה או אלפי דגימות שמתבצעת assayed ולמייקרו-רנ"א מרובה. מיקרופלואידיקה (TLDA) וnanofluidics פלטפורמות (OA) הן פלטפורמות תפוקה גבוהה / תוכן שנועדו לאפשר רכישה של נתונים גדולים יותר בזמן קצר יותר. למרות הבדלים אצווה נצפו בכרטיסי TLDA, זה יכול להיות ממוזער על ידי בקשת כרטיסי TLDA מאותה אצווה. אנו צופים כי פלטפורמת TLDA (איור 3) הראתה וריאציה משמעותית בכ -17% מאמצע – miRNAs שפע נמוך כאשר נבדק באמצעות המדגם זהה בקבוצות שונות של כרטיסי TLDA. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש באותו מספרים אצווה לניתוח באמצעות כרטיסי TLDA. גם וריאציה זו יכולה להיות בגלל ההשתנות הטכניות לרבות כל שגיאות טעינה וpipetting פוטנציאליות. עם זאת, אנו ממליצים הזמנה / מבקש את אותו אצווה של כרטיסי TLDA. אין וריאציה אצווה משמעותית נצפתה על פלטפורמת OA. למרות זאת, TaqMan experimen מבוססטל qPCR גישות הצעת קלות למדוד את השפע של miRNAs בדגימות פלזמה / סרום. גישות התפוקה נמוכה, בינוניות וגבוהות שנדונו כאן מציעות את הגמישות כדי לנתח מגוון של דוגמאות וmiRNAs באמצעות כימיה יעילה ביותר, לשחזור ונקיה (רעש רקע נמוך).
The authors have nothing to disclose.
כל המחברים מודים תמיכת התשתית מNHMRC CTC, אוניברסיטת סידני, קרן המחקר לסוכרת נעורים (JDRF), אוסטרליה וקרן קופר רבקה, אוסטרליה. מחקר זה מומן באמצעות מענקים מהמועצה האוסטרלית למחקר (FT110100254) וJDRF, אוסטרליה (CRN201314) לאהה WW, RJF וMVJ ביצע את כל הניסויים המעבדה הרטובים, ASJ ביצע ניתוח נתונים. WW כתב את הטיוטה הראשונה. אהה מתוכנן המחקר וניתח את הנתונים. כל המחברים לקרוא והסכימו על הנוסח הסופי של כתב היד, דמויות וגיליונות העבודה שהוגשו לפרסום.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |