MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d'autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l'abondance des microARN circulation.
PCR quantitative basée-Probe (qPCR) est une méthode privilégiée pour mesurer l'abondance des transcrits, puisque ce est l'une des méthodes de détection les plus sensibles qui fournit une analyse précise et reproductible. La chimie à base de sonde offre le moins de fluorescence d'arrière-plan par rapport aux autres chimies (à base de colorants). Actuellement, il existe plusieurs plates-formes disponibles que la chimie basée sur une sonde d'utilisation pour quantifier l'abondance des transcrits. qPCR dans une plaque de 96 puits est la méthode la plus couramment utilisée, mais seulement un maximum de 96 échantillons ou miARN peut être testée en un seul passage. Ce est fastidieux et pénible si un grand nombre d'échantillons / miRNAs sont à analyser. Plateformes sonde haut-débit tels que la microfluidique (par exemple TaqMan tableau Card) et des tableaux de nanofluidique (par exemple OpenArray) offre de facilité de détecter de façon reproductible et efficacement l'abondance de plusieurs microARN dans un grand nombre d'échantillons en peu de temps. Ici, nous démontrons le dispositif expérimental d'unee protocole pour la quantification de miARN échantillons de sérum ou plasma EDTA, en utilisant la chimie à base de sonde et de trois plates-formes différentes (plaque de 96 puits, la microfluidique et les tableaux de nanofluidique) offrant des niveaux croissants de débit.
Les microARN (miARN) sont ~ 22 nucléotides non codante (NC) ARN, fonctionnant comme régulateurs de l'expression du gène 1-3. La plupart des miARN chez les animaux fonctionnent par appariement de bases spécifique de séquence avec un ARNm, ciblant l'extrémité 3 'UTR, ce qui conduit à une régulation négative de l'expression de gène 2-4. Cela se produit généralement par l'intermédiaire de l'inhibition de la traduction de l'ARNm ou en ribosomique de débarquement. miARN en circulation se sont révélés être de nouveaux biomarqueurs dans la recherche et les domaines cliniques pour une variété de maladies telles que le diabète, 7.5, 8 ovaire, de la prostate et cancer du sein 9 10,11, 12 l'hépatite B et d'autres 13 maladies auto-immunes. Des recherches ont été menées pour identifier les miRNAs abondantes dans différentes cellules ou des tissus, ainsi que dans la circulation du plasma humain et des échantillons de sérum, ce qui est plus accessible et moins invasive 9,11-15.
Différentes méthodes de quantification miARN ont été eréé en utilisant de multiples plates-formes, telles que la plate-forme de plaque standard 96 puits 4,12,16-18, la plate-forme de carte microfluidique 12,18-23 et la plate-forme de tableau 17,24 nanofluidique. Quantitative PCR en temps réel (qPCR) offre la possibilité de mesurer les nombres relatifs ou absolus de transcriptions utilisant multiple (teinturerie ou à base de sonde-chimiques). La chimie PCR en temps réel basée sur une sonde offre l'avantage d'une faible fluorescence de fond et une haute sensibilité pour détecter un seul exemplaire de la transcription. Il est relativement rentable, simple à utiliser et hautement reproductible, ce qui en fait une méthode privilégiée pour quantifier et déterminer miRNA expression 25. Méthode qPCR base-Probe implique généralement deux étapes: la transcription (RT) et qPCR 4,26,27 inverser. RT est l'endroit où l'amorce tige-boucle RT est hybridée à une molécule miARN mature ou primaire et convertie en (c) un ADN complémentaire. La quantification du produit de l'ADNc est ensuite effectuée en utilisant des amorces de PCR spécifiques miARN26-28. Le principe de la PCR quantitative à base de sonde est basée sur la détection de l'extension du brin complémentaire en temps réel, ce qui implique l'hydrolyse de la sonde marqués par fluorescence. Ces sondes sont conçues pour contenir un rapporteur fluorescent et un extincteur qui sont tout autre pour permettre FRET (de Fluorescence Resonance Energy Transfer). La détection de l'émission de la fluorescence rapporteur (émetteur) est masquée par la proximité de la molécule d'agent d'extinction. Lorsque la Taq polymerase (pol) se étend à partir de l'amorce amont et atteint une fourche (de l'extrémité 5 'de la sonde), l'activité pol d'exonucléase de la Taq hydrolyse de la sonde, ce qui conduit à une dissociation / séparation physique de l'émetteur fluorescent à partir de l'extincteur. Cette version d'une seule molécule de la fluorescence émetteur est enregistré par le détecteur et présenté comme une augmentation progressive du signal de fluorescence de ce puits / réaction. L'augmentation de la fluorescence est proportionnelle à la quantité de produit de PCR généré, ce qui permet une précision qu26,28 antification de la cible amplifiée.
Avec l'augmentation de la demande dans miRNA quantification, à moyen et à des technologies à haut débit ont été développés pour permettre à un plus grand nombre d'échantillons à traiter dans un court laps de temps. TaqMan Low Density Array (TLDA) est un débit moyen de conception innovante basée sur microfluidique à base de sonde-qPCR chimie offrant une augmentation du nombre de miARN analysés sur une plaque. TLDA impliquent l'utilisation d'un pool prédéfini de RT-amorces qui sont utilisées pour synthétiser l'ADNc. Ces ADNc sont ensuite filées en une carte personnalisée 384 et micro-fluidique pour déterminer l'expression de plusieurs miARN utilisant qPCR 22,26,29. Chaque puits de la carte contient séché amorces et des sondes pour amplifier miARN (s) spécifique, donc à 384 réactions peuvent être transformés dans la carte unique TLDA 26.
La matrice de nanofluidique est une plate-forme à haut débit qui est utilisé pour la détection de produits de transcription de gènes <sup> 24 en utilisant la même chimie du sonde. Il utilise une matrice exclusive offrant interactions hydrophobes hydrophile pour faciliter le chargement facile du mélange de réaction 33 en nanolitres en un tableau de 3072 trous traversants sur une lame en acier inoxydable 24. Cet article se concentre sur la démonstration de la façon dont ces méthodes pour quantifier miARN dans le sérum / plasma sont effectuées et les facteurs critiques qui doivent être considérés lors de l'exécution et l'interprétation de ces données. Prises pour compte, leurs avantages et leurs limites individuelles seront discutés dans cet article.
Les étapes critiques dans les protocoles de qPCR basée sonde à obtenir des résultats précis et reproductibles pour se assurer 1) le même volume et la concentration de RT-produit est chargé dans chaque réaction qPCR, 2) les rapports et les volumes corrects des composants nécessaires pour réaction qPCR sont préparés et bien mélangé, 3) les volumes corrects et cohérents sont ajoutés à chaque réaction qPCR, et 4) la préparation et le chargement de chaque échantillon et mélange réactionnel est terminée dans le plus court laps de temps possible, tout en conscient de les étapes critiques ci-dessus mentionnés plus tôt.
Les cartes de réseau microfluidique besoin centrifugeuse appropriée et seaux spécifiques. Chaque godet peut contenir jusqu'à trois cartes (chargé / vide). Toujours se assurer que tous les trois fentes d'un seau sont occupés et le seau est équilibré en plaçant seau similaire (ce seau devrait également contenir trois cartes, soit vides ou pleines) dans la fente en face de la centrifugeuse. En plaçant la carte dans le Buckeporte-t, assurez-vous que les huit réservoirs projettent vers le haut et puits de réaction face à la paroi extérieure de la centrifugeuse. Faites tourner les cartes à 331 g pendant 1 min à température ambiante. Après la première centrifugation, ouvrir la centrifugeuse et se assurer visuellement le mélange de réaction a été distribué à travers les 384 puits. Répétez le spin au mêmes paramètres pour une fois de plus. Retirez la carte de seau et se assurer que le niveau de mélange réactionnel dans chacun des huit réservoirs est uniforme. Les incohérences dans les volumes de liquide dans les réservoirs gauche font la carte inapproprié d'utiliser davantage.
Pour avoir la même concentration de la RT-produit, même concentration d'entrée de l'ARN est ajoutée dans chaque réaction RT. La concentration d'ARN total est mesuré en utilisant un micro-volumespectrophotometer. Le ratio observé 260/280 peut être aussi faible que 1,3 pour l'ARN isolé à partir de plasma / sérum; cela ne semble pas avoir un effet sur le processus ou les données liées qPCR-aval généré 30. De même, le rapport de 260/280les échantillons d'ARN testés ici sont entre 1.3 à 1.7 sans effets anormaux dans le qPCR observés.
Lors de l'utilisation des échantillons à faible teneur d'ARN, tels que ceux de fluides biologiques, il peut être difficile de quantifier l'ARN avant le traitement. Nous recommandons l'utilisation du synthétique pic-in à l'isolement de l'ARN ainsi que les étapes de transcription inverse. Dans notre expérience, les candidats Arabidopsis thaliana (miARN miR-ath-159a et ath-miR-172a) sont préférés Caenorhabditis elegans miARN (tels que cel-miR-39 ou cel-miR-54), qui, dans notre expérience peut avoir plus homologie que ceux de A. thaliana. L'utilisation de tels spécifique du stade pic-in peut tenir compte de la normalisation des données miRNA sur plusieurs échantillons analysés à différents moments. L'utilisation d'un volume d'entrée fixe de l'ARN pour la réaction de synthèse d'ADNc est également recommandé 32,33.
Les trois protocoles basés sonde-miARN pour la quantification décrites ici nécessitent des quantités variablesde l'entrée de l'ARN total, différents flux de travail et les coûts. Chacun des flux de travail sont conçus pour répondre à différents débits basés sur le nombre de cibles miARN et le nombre d'échantillons à analyser. Avec l'augmentation de débit (96 RXN 384 RXN 3072 RXN), le coût par réaction diminue avec une augmentation de la quantité de données obtenues au cours d'une unité de temps. Étant donné que toutes ces plates-formes utilisent chimie TaqMan, la qualité des données obtenues peut se attendre à être similaires. TaqMan qPCR est une méthode bien établie pour identifier l'abondance des miARN dans les échantillons de sérum / plasma 9,11,27. Bien que les trois plates-formes discutées ici ont la même composition chimique, une diminution dans le volume de réaction conduit à une diminution de la gamme dynamique de détection de transcription (RJ Farr et al., Données non publiées). Le 96 puits plateforme qPCR est un débit plus faible, mais la plate-forme de haute sensibilité et à notre avis, le «gold standard» pour toutes les plateformes de PCR (ou colorant à base de) basée sonde. Cependant, cela peutne pas être la plate-forme la plus économique ni efficace si plusieurs centaines ou milliers d'échantillons sont analysés et pour plusieurs microARN. Microfluidique (TLDA) et nanofluidique (OA) plates-formes sont des plates-formes à haut débit / contenu conçus pour permettre l'acquisition de données plus grands dans un temps plus court. Bien que les différences de lots ont été observés dans les cartes TLDA, ce peut être minimisée en demandant TLDA cartes du même lot. Nous observons que la plate-forme TLDA (figure 3) montré une variation significative dans 17% des mi – miARN de faible abondance lorsqu'il est testé en utilisant le même échantillon sur différents lots de cartes TLDA. Nous vous recommandons donc d'utiliser les mêmes numéros de lot pour l'analyse en utilisant des cartes TLDA. Cette variation pourrait aussi être due à la variabilité technique, y compris des erreurs de chargement et de pipetage. Cependant, nous conseillons de commander / demandant le même lot de cartes TLDA. Aucune variation significative n'a été observée lot sur la plate-forme de l'arthrose. Malgré cela, TaqMan expéri basetal qPCR approches offrent facilité pour mesurer l'abondance des miARN dans les échantillons de plasma / sérum. Les approches de débit faible, moyenne et haute discutés ici offrent la flexibilité d'analyser une série d'échantillons et miARN l'aide d'un (faible bruit de fond) la chimie hautement efficace, reproductible et propre.
The authors have nothing to disclose.
Tous les auteurs reconnaissent le soutien du NHMRC CTC, Université de Sydney, la Fondation de recherche sur le diabète juvénile (FRDJ), l'Australie et la Fondation Rebecca Cooper, l'Australie infrastructure. Cette recherche a été financée par des subventions du Conseil australien de la recherche (FT110100254) et la FRDJ, Australie (CRN201314) pour AAH WW, RJF et MVJ effectuée tous laboratoire humide expérimentation, ASJ effectué l'analyse des données. WW a écrit la première ébauche. AAH prévu l'étude et analysé les données. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit, des chiffres et des feuilles de travail soumis pour publication.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |