Sirkulerende microRNAs har nylig dukket opp som lovende og nye biomarkører for ulike krefttyper og andre sykdommer. Målet med denne artikkelen er å diskutere tre ulike probe-basert real-time PCR-plattformer og metoder som er tilgjengelige for å kvantifisere og bestemme overflod av sirkulerende microRNAs.
Probe-basert kvantitativ PCR (qPCR) er en foretrukket metode for måling av transkripsjon overflod, siden det er en av de mest sensitive deteksjonsmetoder som gir en nøyaktig og reproduserbar analyse. Probe-basert kjemi har minst bakgrunnsfluorescens i forhold til andre (fargestoffbaserte) kjemi. For tiden er det flere plattformer tilgjengelig som bruk probe-basert kjemi for å kvantifisere transkripsjon overflod. qPCR i en 96-brønners plate er den mest rutinemessig brukt metode er imidlertid bare et maksimum på 96 prøver eller mirnas kan testes i en enkelt kjøring. Dette er tidkrevende og kjedelig hvis et stort antall prøver / mirnas skal analyseres. High-throughput probe-baserte plattformer som MicroFluidics (f.eks TaqMan Array kort) og nanofluidikk arrays (f.eks OpenArray) tilbud lette å reproduserbart og effektivt oppdage overflod av flere microRNAs i et stort antall prøver i løpet av kort tid. Her viser vi den eksperimentelle oppsettet ennd protokoll for miRNA kvantifisering fra serum eller plasma-EDTA prøver, ved hjelp av sonde-basert kjemi og tre forskjellige plattformer (96 brønners plate, MicroFluidics og nanofluidikk arrays) tilbyr økende nivåer av gjennomstrømming.
MicroRNAs (mirnas) er ~ 22 nucleotide ikke-kodende (nc) RNA, som fungerer som regulatorer av genuttrykk 1-3. De fleste mirnas hos dyr fungere gjennom sekvens-spesifikk baseparring med et mRNA, rettet mot 3 'UTR, noe som fører til negativ regulering av genekspresjon 2-4. Dette skjer vanligvis via hemming av mRNA oversettelse eller ved ribosomal drop-off. mirnas i omløp har vist seg å være nye biomarkører i forskning og kliniske felt for en rekke sykdommer, så som diabetes 5-7, eggstokkreft 8, 9 prostata og brystcancer 10,11, hepatitt B-12 og andre autoimmune sykdommer 13. Forskning har vært gjennomført for å identifisere rikelig mirnas i forskjellige celler eller vev, så vel som i sirkulasjon fra humant plasma og serumprøver, som er lettere tilgjengelig og mindre invasiv 9,11-15.
Ulike metoder for kvantifisering miRNA har vært eopprettet ved hjelp av flere plattformer, som for eksempel standard 96-brønns plate plattform 4,12,16-18, den MicroFluidics kort plattform 12,18-23 og nanofluidikk array plattform 17,24. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) tilbyr muligheten til å måle relative eller absolutte tall av vitnemål ved hjelp av flere (farve eller probe-basert) kjemi. Probe-basert real-time PCR kjemi tilbyr fordelen av lav bakgrunnsfluorescens og høy sensitivitet for å påvise en enkelt transkripsjon kopi. Det er relativt kostnadseffektivt, enkel å bruke og svært reproduserbare, noe som gjør det til et yndet metode for å kvantifisere og bestemme miRNA uttrykket 25. Probe-baserte qPCR metode generelt omfatter to trinn: revers transkripsjon (RT) og qPCR 4,26,27. RT er der stammesløyfe RT primeren blir hybridisert til en moden eller primær miRNA molekyl og konvertert til komplementær (c) DNA. Kvantifisering av cDNA-produktet blir deretter utført ved anvendelse av miRNA-spesifikke PCR-primere26-28. Prinsippet for probe-baserte qPCR er basert på påvisning av komplementære tråden forlengelse i sann tid, noe som innebærer hydrolyse av det fluorescens-merkede probe. Disse probene er utformet for å inneholde en fluoriserende reporter og et quencher som er like hverandre for å tillate FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Påvisning av utslipp fra fluorescens reporter (sender) er maskert av nærhet av slukkeren molekylet. Når Taq-polymerase (pol) strekker seg fra oppstrømsprimeren og når en gaffel (5'-enden av proben), hydrolyserer Taq-pol-eksonukleaseaktivitet sonden, hvilket fører til en fysisk dissosiasjon / separasjon av den fluorescerende emitter fra slukkeren. Denne frigjøring av et enkelt molekyl av fluorescens emitter er registrert av detektoren, og presentert som en inkrementell økning i fluorescens-signalet fra den brønn / reaksjon. Økningen i fluorescens er proporsjonal med mengden av PCR-produkt som genereres, slik at en nøyaktig quantification av den forsterkede target 26,28.
Med økende etterspørsel i miRNA kvantifisering, har middels til høy gjennomstrømning teknologier blitt utviklet for å tillate et større antall prøver som skal behandles i en kort tidsperiode. TaqMan Low Density Array (TLDA) er et medium-throughput innovative mikrofluid design basert på probe-baserte qPCR kjemi gir en økning i antall mirnas analysert på en plate. TLDA innebære bruk av et forhåndsdefinert pool av RT-primere som brukes til å syntetisere cDNA. Disse cDNAs blir deretter spunnet inn i en tilpasset 384 godt mikro-fluidic kort for å bestemme uttrykket av flere mirnas bruker qPCR 22,26,29. Hver brønn av kortet inneholder tørket primere og prober for å amplifisere spesifikke miRNA (s), således opp til 384 reaksjoner kan behandles i ett TLDA kortet 26.
Den nanofluidikk matrise er en high-throughput-plattform som brukes for deteksjon av gentranskriptene <sup> 24 ved bruk av den samme probe-basert kjemi. Det benytter en proprietær matrise som tilbyr hydrofobe-hydrofile interaksjoner til rette for enkel lasting av 33 nanoliter reaksjonsblandingen i en rekke av 3072 gjennomgående hull på en rustfritt stål lysbilde 24. Denne artikkelen fokuserer på å vise hvordan disse metodene for å kvantifisere mirnas i serum / plasma er utført og de kritiske faktorene som må vurderes når du utfører og tolke slike data. Tatt til konto, vil deres individuelle fordeler og begrensninger bli diskutert i denne artikkelen.
De kritiske trinnene i sondebaserte qPCR protokoller for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater er å sørge for at 1) det samme volum og konsentrasjon av RT-produkt som ligger i hvert qPCR reaksjon, 2) de riktige forholdstall og volumer av komponentene som trengs for qPCR reaksjon er forberedt og blandes godt, 3) de riktige og konsistente volumer er lagt til hver qPCR reaksjon, og 4) utarbeidelse og lasting av hver prøve og reaksjonsblandingen er ferdig på kortest mulig tid som mulig, samtidig oppmerksom på de ovennevnte kritiske trinn nevnt tidligere.
De MicroFluidics array-kort må egnet sentrifuge og spesifikke bøtter. Hver bøtte kan holde opp til tre kort (lastet / tom). Pass alltid på at alle tre sporene av en bøtte er okkupert og bøtta er balansert ved å plassere lignende bøtte (dette bøtte bør også inneholde tre kort, enten tom eller full) i motsatt sporet av sentrifugen. Mens du setter kortet i Buckest holder, sørg for at de åtte reservoarer projisere oppover og reaksjonsbrønnene møter ytterveggen av sentrifuge. Snurre kortene på 331 xg i 1 min ved romtemperatur. Etter første spin, åpner sentrifuge og visuelt sikre reaksjonsblandingen er utlevert gjennom de 384 brønnene. Gjenta spinn på samme innstillingene for en mer tid. Ta ut kortet fra bøtte og sikre at nivået av reaksjonsblandingen i hver av de 8 reservoarene er ensartet. Eventuelle uoverensstemmelser i væskevolumene igjen i reservoarene gjøre kortet upassende å bruke videre.
For å ha samme konsentrasjon av RT-produkt, er samme inngangs konsentrasjon av RNA tilsatt i hver RT-reaksjonen. Den totale RNA-konsentrasjonen blir målt ved anvendelse av en mikro-volumespectrophotometer. Den observerte 260/280 forholdet kan være så lavt som 1,3 for RNA isolert fra plasma / serum; Dette synes ikke å ha en effekt på nedstrøms qPCR-relaterte prosesser eller data generert 30. Likeledes er 260/280 forholdet avRNA prøvene testet her var mellom 1,3-1,7 med ingen unormale effekter i qPCR observert.
Ved bruk av lave RNA-innhold prøver, slik som de fra biofluids, kan det være vanskelig å kvantifisere RNA før behandling. Vi anbefaler bruk av syntetisk spike-in på RNA isolering samt revers transkripsjon etapper. I vår erfaring, Arabidopsis thaliana miRNA kandidater (ATH-Mir-159a og ath-Mir-172a) er foretrukket over Caenorhabditis elegans mirnas (som cel-Mir-39 eller cel-Mir-54), som etter vår erfaring kan ha høyere homologi enn de fra A. thaliana. Bruken av en slik scene spesifikke spike-in kan gjøre rede for normalisering av miRNA data på tvers av flere prøver analysert på ulike tidspunkter. Ved hjelp av en fast inngangsvolum RNA for cDNA syntese reaksjon er også anbefalt 32,33.
De tre probe-baserte protokoller for miRNA kvantifisering beskrevet her krever varierende mengderav total RNA-inngang, ulike arbeidsprosesser og kostnader. Hver av arbeidsflyter er konstruert for å ta forskjellige hastigheter basert på antall miRNA mål og antall prøver som skal analyseres. Med økende gjennomløp (96 Rxn 384 Rxn 3072 Rxn), kostnaden per reaksjonen avtar med en økning i mengden av data som er innhentet i løpet av en tidsenhet. Siden alle disse plattformer benytter TaqMan kjemi, kan kvaliteten på data oppnådd forventes å være lik. TaqMan qPCR er en veletablert metode for å identifisere overflod av mirnas i serum / plasmaprøver 9,11,27. Selv om de tre plattformer som er omtalt her har samme kjemi, en reduksjon i reaksjonsvolumet fører til en reduksjon i dynamisk område av transkriptet deteksjon (Farr RJ et al., Upubliserte data). 96-brønns qPCR plattformen er en lavere gjennomstrømming, men høy følsomhet plattform og etter vårt syn, "gullstandarden" for alle probe-basert (eller dye-basert) PCR plattformer. Dette kan imidlertidikke være den mest økonomiske eller effektive plattformen dersom flere hundre eller tusenvis av prøver blir analysert, og for flere microRNAs. Microfluidics (TLDA) og nanofluidikk (OA) plattformene er high-throughput / innholds plattformer er utformet for å tillate at anskaffelse av større data i en kortere tid. Selv batch forskjeller har blitt observert i TLDA kort, kan dette reduseres ved å be om TLDA kort fra samme parti. Vi observerer at TLDA plattform (figur 3) viste betydelig variasjon i 17% av mid – lav overflod mirnas når testet ved hjelp av den samme prøven på ulike grupper av TLDA kort. Vi anbefaler derfor å bruke de samme batchnumre for analyse ved hjelp TLDA kort. Denne variasjonen kan også være på grunn av teknisk variasjon inkludert eventuelle lasting og pipettering feil. Vi anbefaler imidlertid bestilling / ber om det samme batch av TLDA kort. Ingen signifikant batch variasjon ble observert på OA plattformen. Til tross for dette, TaqMan basert experimental qPCR nærmer tilbud lette å måle overflod av mirnas i plasma / serumprøver. Lav, medium og høy gjennomstrømning tilnærminger diskutert her tilbyr fleksibilitet til å analysere en rekke prøver og mirnas ved hjelp av en svært effektiv, reproduserbar og ren (lav bakgrunnsstøy) kjemi.
The authors have nothing to disclose.
Alle forfatterne erkjenner støtte infrastrukturen fra NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australia og Rebecca Cooper Foundation, Australia. Denne forskningen ble finansiert gjennom tilskudd fra Australian Research Council (FT110100254) og JDRF, Australia (CRN201314) til Aah WW, RJF og MVJ utført alle våt lab eksperimentering, gjennomført ASJ ut dataanalyse. WW skrev det første utkastet. AAH planlagt studien og analysert dataene. Alle forfattere lese og blitt enige om den endelige versjonen av manuskriptet, tall og regneark innsendt for publisering.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |