وقد ظهرت الرنا الميكروية المتداولة مؤخرا في المؤشرات الحيوية واعدة وجديدة لمختلف أنواع السرطان وأمراض أخرى. والهدف من هذه المقالة هو لمناقشة ثلاثة في الوقت الحقيقي PCR منصات مختلفة القائم على التحقيق والأساليب المتوفرة لقياس وتحديد وفرة تعميم الرنا الميكروية.
يستند التحقيق-PCR الكمي (QPCR) هو وسيلة مفضلة للقياس وفرة النص، لأنها هي واحدة من طرق الكشف الأكثر حساسية أن يقدم تحليلا دقيقا وقابلة للتكرار. الكيمياء يستند التحقيق، ويقدم أقل مضان الخلفية بالمقارنة مع غيرها كيمياء (على صبغ). في الوقت الحاضر، هناك العديد من المنابر المتاحة أن الكيمياء أساس تحقيق الاستخدام ل quantitate فرة النص. QPCR في 96 لوحة جيدا هو الأكثر استخداما بشكل روتيني طريقة، ولكن فقط كحد أقصى من 96 عينات أو miRNAs يمكن اختبارها في تشغيل واحد. هذا هو وقتا طويلا ومملا إذا كان عدد كبير من العينات / miRNAs هي لتحليلها. عالية الإنتاجية المنصات المرتكزة إلى تحقيق مثل على microfluidics (على سبيل المثال TAQMAN بطاقة صفيف) والمصفوفات علم الموائع النانوي (على سبيل المثال OpenArray) عرض سهولة بتكاثر وكفاءة للكشف عن وفرة من microRNAs متعددة في عدد كبير من العينات في وقت قصير. هنا، ونحن لشرح إعداد التجريبيالثانية بروتوكول لميرنا الكميات من المصل أو عينات البلازما EDTA، وذلك باستخدام الكيمياء القائم على التحقيق وثلاث منصات مختلفة (96 لوحة جيدا، على microfluidics والمصفوفات علم الموائع النانوي) تقدم مستويات متزايدة من الإنتاجية.
الرنا الميكروية (miRNAs) هي ~ 22 النوكليوتيدات غير الترميز (نورث كارولاينا) الرنا، كما تعمل الجهات التنظيمية في التعبير الجيني 1-3. معظم miRNAs في الحيوانات وظيفة من خلال تسلسل محدد قاعدة الاقتران مع مرنا، واستهداف "UTR 3، مما يؤدي إلى تنظيم السلبي للالتعبير الجيني 2-4. هذا يحدث عادة عن طريق تثبيط الترجمة مرنا أو عن طريق الريباسي الانزال. وقد ثبت miRNAs في التداول أن تكون المؤشرات الحيوية الجديدة في مجال البحوث والمجالات السريرية لمجموعة متنوعة من الأمراض، مثل السكري 5-7 والمبيض 8، 9 البروستاتا وسرطان الثدي 10،11، والتهاب الكبد B 12 و أمراض المناعة الذاتية الأخرى 13. وقد أجريت الأبحاث لتحديد miRNAs وفرة في الخلايا أو الأنسجة المختلفة، وكذلك في الدورة الدموية من البلازما البشرية وعينات مصل الدم، والتي هي أكثر يسرا وأقل تغلغلا 9،11-15.
وكانت وسائل مختلفة من ميرنا الكمي هأقاموا باستخدام منصات متعددة، مثل منصة لوحة معيار 96-جيدا 4،12،16-18، ومنصة بطاقة على microfluidics 12،18-23 ومنصة علم الموائع النانوي مجموعة 17،24. الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) يوفر القدرة على قياس الأعداد النسبية أو المطلقة من النصوص باستخدام متعددة (dye- أو القائم على التحقيق) كيمياء. يستند التحقيق في الوقت الحقيقي PCR الكيمياء يقدم فائدة منخفضة مضان الخلفية وحساسية عالية للكشف عن نسخة نسخة واحدة. ومن نسبيا فعالة من حيث التكلفة، وسهلة الاستخدام وقابلة للتكرار للغاية، مما يجعل الطريقة المفضلة لقياس وتحديد ميرنا التعبير 25. طريقة QPCR يستند التحقيق-ينطوي عموما خطوتين: النسخ (RT) وQPCR 4،26،27 عكس. RT هو المكان الذي تهجين التمهيدي الجذعية حلقة RT إلى ناضجة أو الأساسي جزيء ميرنا وتحويلها إلى مكمل (ج) DNA. يتم بعد ذلك إجراء تقدير حجم المنتج [كدنا خارج باستخدام بادئات PCR ميرنا محددة26-28. ويستند مبدأ QPCR يستند التحقيق على الكشف عن تمديد حبلا التكميلية في الوقت الحقيقي، والذي ينطوي على التحلل من التحقيق fluorescently الموسومة. وتهدف هذه المجسات لاحتواء مراسل الفلورسنت وفاكهه تقضي التي هي مجرد بصرف النظر للسماح الحنق (نقل الإسفار الرنين الطاقة). وملثمين الكشف عن الانبعاثات من مراسل مضان (باعث) من قبل مقربة من جزيء فاكهه تقضي. عندما طق بوليميريز (بول) يمتد من التمهيدي المنبع ويصل شوكة (5 'نهاية التحقيق)، وطق النشاط بول نوكلياز خارجية مائيا التحقيق، مما يؤدي إلى التفكك المادي / فصل باعث الفلورسنت من فاكهه تقضي. يتم تسجيل هذا الإصدار من جزيء واحد من مضان باعث بواسطة كاشف وعرضها على أنها الزيادة التدريجية في إشارة مضان من ذلك جيدا / رد فعل. الزيادة في مضان يتناسب مع كمية من الناتج PCR ولدت، السماح لتشو دقيقةantification من 26،28 الهدف تضخيم.
مع تزايد الطلب في ميرنا الكمي، وقد وضعت المتوسطة على التكنولوجيات الإنتاجية العالية للسماح لعدد أكبر من العينات التي سيتم تجهيزها في فترة قصيرة من الزمن. TAQMAN منخفض الكثافة صفيف (TLDA) هو المتوسطة الإنتاجية تصميم ميكروفلويديك مبتكرة على أساس القائمة على التحقيق QPCR الكيمياء تقدم زيادة في عدد miRNAs تحليلها على لوحة واحدة. TLDA تنطوي على استخدام بركة معرفة مسبقا من RT-الاشعال التي تستخدم لتجميع كدنا]. ثم يتم نسج هذه cDNAs إلى 384 بطاقة جيدا الصغرى الموائعية مخصصة لتحديد التعبير عن miRNAs متعددة باستخدام QPCR 22،26،29. كل بئر من بطاقة يحتوي الاشعال وتحقيقات المجففة لتضخيم ميرنا معين (ق)، وبالتالي تصل إلى 384 ردود الفعل يمكن معالجتها في بطاقة TLDA واحد 26.
مجموعة علم الموائع النانوي هي عبارة عن منصة عالية الإنتاجية التي يتم استخدامها للكشف عن النصوص الجين <sup> 24 باستخدام نفس الكيمياء القائم على التحقيق. فإنه يستخدم مصفوفة الملكية تقدم التفاعلات مسعور-محبة للماء لتسهيل تحميل السهل لل33 نانولتر خليط التفاعل في صفيف من 3072 من خلال الثقوب على شريحة الفولاذ المقاوم للصدأ 24. تركز هذه المقالة على إظهار كيف يتم تنفيذ هذه الأساليب لقياس miRNAs في المصل / البلازما والعوامل الحاسمة التي يجب مراعاتها عند تنفيذ وتفسير هذه البيانات. المتخذة لالاعتبار، وسيتم مناقشة فوائدها الفردية والقيود في هذه المقالة.
الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكولات QPCR القائم على التحقيق للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار هي للتأكد 1) يتم تحميل نفس حجم وتركيز RT-المنتج في كل رد فعل QPCR، 2) النسب والأحجام الصحيحة للمكونات اللازمة ل تعد رد فعل QPCR ومختلطة جيدا، و3) يتم إضافة كميات صحيحة وثابتة على كل رد فعل QPCR، و4) الانتهاء من إعداد وتحميل كل عينة ورد فعل المزيج في اقصر وقت ممكن، في حين لا تزال تضع في اعتبارها الخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه في وقت سابق.
بطاقات مجموعة على microfluidics تحتاج الطرد المركزي مناسبة والدلاء محددة. كل دلو يمكن أن تعقد ما يصل إلى 3 بطاقات (تحميل / فارغ). تأكد دائما أن جميع فتحات 3 من دلو واحتل ومتوازن دلو من خلال وضع دلو مماثل (وينبغي أن تتضمن هذه دلو أيضا 3 بطاقات، إما فارغة أو كاملة) في فتحة نقيض من أجهزة الطرد المركزي. في حين وضع البطاقة في دلور حامل، تأكد من أن 8 خزانات تتوقع صعودا ويواجه آبار رد فعل الجدار الخارجي للطرد المركزي. تدور البطاقات في 331 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد أول تدور، فتح الطرد المركزي وضمان بصريا تم الاستغناء عن مزيج التفاعل من خلال الآبار 384. كرر تدور في نفس الإعدادات ل1 المزيد من الوقت. إزالة البطاقة من دلو والتأكد من أن مستوى مزيج رد فعل في كل من 8 خزانات غير موحد. أي تضارب في حجم السائل اليسار في الخزانات تجعل البطاقة غير مناسب لمواصلة استخدامها.
لدينا نفس التركيز من RT-المنتج، يضاف نفس التركيز المدخلات من الحمض النووي الريبي في كل رد فعل RT. يتم قياس التركيز الكلي RNA باستخدام volumespectrophotometer الدقيقة. لاحظ نسبة 260/280 يمكن أن تكون منخفضة مثل 1.3 لRNA معزولة عن بلازما / مصل. هذا لا يبدو أن يكون لها تأثير على عملية المصب المتعلقة QPCR أو البيانات ولدت 30. وبالمثل، فإن نسبة 260/280 منكانت عينات الحمض النووي الريبي اختبارها هنا بين 1.3-1.7 مع أي آثار غير طبيعية في QPCR ملاحظتها.
عند استخدام عينات منخفضة المحتوى RNA، مثل تلك التي من biofluids، قد يكون من الصعب تحديد RNA قبل المعالجة. ونحن نوصي استخدام الاصطناعية ارتفاع في في عزل الحمض النووي الريبي وكذلك المراحل النسخ العكسي. في تجربتنا، والمرشحين نبات الأرابيدوبسيس thaliana ميرنا (ATH-مير 159a وATH-مير 172a) ويفضل على انواع معينة ايليجانس miRNAs (مثل سل-مير-39 أو سل-مير-54) التي في تجربتنا قد يكون أعلى، التماثل من تلك التي من A. thaliana. استخدام هذا الارتفاع في مرحلة معينة يمكن حساب لتطبيع البيانات ميرنا عبر عينات متعددة يعاير في أوقات مختلفة. باستخدام حجم المدخلات الثابتة من الحمض النووي الريبي لرد فعل التوليف [كدنا] ويوصى أيضا 32،33.
ووصفت البروتوكولات القائمة على التحقيق الثلاثة لميرنا الكمي هنا تتطلب كميات متفاوتةمن إجمالي المدخلات RNA، سير العمل وتكاليف مختلفة. تم تصميم كل من سير العمل لتلبية احتياجات الانتاجية المختلفة استنادا إلى عدد من الأهداف ميرنا وعدد من العينات لتحليلها. مع زيادة الإنتاجية (96 rxn 384 rxn 3072 rxn)، والتكلفة لكل رد فعل تتناقص مع زيادة في كمية البيانات التي تم الحصول عليها خلال وحدة الزمن. بما أن جميع هذه المنصات الاستفادة الكيمياء TAQMAN، ونوعية البيانات التي تم الحصول عليها يمكن أن يتوقع أن تكون مشابهة. TAQMAN QPCR هي طريقة راسخة للتعرف على وفرة من miRNAs في عينات المصل / البلازما 9،11،27. على الرغم من أن المنابر الثلاثة التي نوقشت هنا يشتركان فى نفس والكيمياء، وانخفاض في حجم رد الفعل يؤدي إلى انخفاض في النطاق الديناميكي للكشف عن نسخة (فار RJ آخرون، بيانات غير منشورة). منصة 96-جيدا QPCR هو الإنتاجية أقل، ولكن منصة حساسية عالية ورأينا أن "المعيار الذهبي" للجميع (أو صبغ أساس) القائم على التحقيق منصات PCR. ومع ذلك، وهذا قدلن تكون منصة الأكثر اقتصادا أو كفاءة إذا كان يتم يعاير عدة مئات أو آلاف من العينات وعن الرنا الميكروية متعددة. على microfluidics (TLDA) وعلم الموائع النانوي (OA) منصات هي منصات عالية الإنتاجية / المحتوى صممت للسماح الحصول على بيانات أكبر في وقت أقصر. على الرغم من أن لوحظت اختلافات دفعة في بطاقات TLDA، وهذا يمكن أن يكون الحد الأدنى عن طريق طلب بطاقات TLDA من نفس الدفعة. ونلاحظ أن منصة TLDA (الشكل 3) أظهرت تفاوت كبير في 17٪ من منتصف – miRNAs فرة منخفضة عند اختبارها باستخدام نفس العينة على دفعات مختلفة من بطاقات TLDA. ولذلك نوصي باستخدام الأرقام دفعة نفس لتحليلها باستخدام بطاقات TLDA. يمكن أن يكون هذا الاختلاف أيضا يرجع إلى التباين الفني بما في ذلك أي التحميل وpipetting لأخطاء محتملة. ومع ذلك، فإننا نوصي أمر / طلب نفس دفعة من بطاقات TLDA. وقد لوحظ عدم وجود اختلاف دفعة كبير على منصة OA. على الرغم من هذا، TAQMAN التجربه مقرهانهج التل QPCR العرض سهولة لقياس وفرة miRNAs في عينات البلازما / المصل. النهج الإنتاجية المنخفضة والمتوسطة والعالية مناقشتها هنا توفر المرونة لتحليل مجموعة من العينات وmiRNAs باستخدام كفاءة عالية، قابلة للتكرار ونظيفة (انخفاض الضوضاء في الخلفية) الكيمياء.
The authors have nothing to disclose.
تعترف جميع المؤلفين دعم البنية التحتية من NHMRC CTC، جامعة سيدني، ومؤسسة أبحاث السكري الأحداث (JDRF)، وأستراليا، ومؤسسة كوبر ريبيكا واستراليا. وقد تم تمويل هذا البحث من خلال المنح المقدمة من المجلس الأسترالي للبحوث (FT110100254) وJDRF، أستراليا (CRN201314) إلى آآآه WW، RJF وحملت MVJ من كل التجارب المخبرية الرطب، قامت ASJ من تحليل البيانات. كتب WW المسودة الأولى. آآآه التخطيط لدراسة وتحليل البيانات. جميع المؤلفين قراءة واتفقت على الصيغة النهائية للمخطوطة والأرقام وأوراق العمل المقدمة للنشر.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |