Cirkulerende microRNA har for nylig vist sig som lovende og nye biomarkører for forskellige kræftformer og andre sygdomme. Målet med denne artikel er at diskutere tre forskellige probe-baseret real-time PCR-platforme og metoder, der er til rådighed til at kvantificere og bestemme den overflod af cirkulerende microRNA.
Probe-baserede kvantitativ PCR (qPCR) er en foretrukne metode til måling af transkript overflod, da det er en af de mest følsomme metoder til påvisning, der tilvejebringer en nøjagtig og reproducerbar analyse. Probe-baserede kemi giver mindst baggrundsfluorescens sammenlignet med andre (farvestof-baserede) kemier. I øjeblikket er der flere platforme til rådighed, at brugen probe-baseret kemi til kvantificering transkript overflod. qPCR i en 96-brønds plade er den mest rutinemæssigt anvendte metode, dog kun maksimalt 96 prøver eller miRNA kan afprøves i en enkelt kørsel. Dette er tidskrævende og trættende, hvis et stort antal prøver / miRNA skal analyseres. High-throughput probe-baserede platforme, såsom mikrofluidik (f.eks TaqMan Array kort) og nanofluidics arrays (f.eks OpenArray) ved let til reproducerbart og effektivt detektere overflod af flere microRNA i et stort antal prøver på kort tid. Her viser vi forsøgsopstillingen ennd protokol for miRNA kvantificering af serum eller plasma-EDTA prøver ved hjælp af probe-baseret kemi og tre forskellige platforme (plade med 96 brønde, mikrofluidik og nanofluidics arrays) tilbyder stigende niveauer af gennemløb.
MikroRNA'er (miRNA) er ~ 22 nukleotid ikke-kodende (NC) RNA'er, der fungerer som regulatorer af genekspression 1-3. De fleste miRNA i dyr fungerer gennem sekvensspecifik baseparring med et mRNA, der er målrettet 3'UTR, hvilket fører til negativ regulering af genekspression 2-4. Dette sker normalt via hæmning af mRNA translation eller ved ribosomal drop-off. miRNA i omløb har vist sig at være hidtil ukendte biomarkører i forskning og kliniske områder for en række sygdomme, såsom diabetes 5-7, ovarie- 8, prostata 9 og brystkræft 10,11, hepatitis B 12 og andre autoimmune sygdomme 13. Forskning er blevet udført for at identificere rigelige miRNA i forskellige celler eller væv, såvel som i omløb fra humant plasma og serum prøver, som er mere tilgængelig og mindre invasive 9,11-15.
Forskellige metoder til miRNA kvantificering har været eblev oprettet ved hjælp af flere platforme, såsom standard 96 brønde platform 4,12,16-18, den mikrofluidik kort platform 12,18-23 og nanofluidics matrix platform 17,24. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) giver mulighed for at måle relative eller absolutte antal af udskrifter ved hjælp af flere (farvestofbaseret eller probe-baseret) kemier. Probe-baserede real-time PCR kemi tilbyder fordelen ved lav baggrund fluorescens og høj følsomhed til at detektere en enkelt udskrift. Den er forholdsvis omkostningseffektive, enkel at bruge og meget reproducerbar, hvilket gør det et yndet metode til at kvantificere og bestemme miRNA udtryk 25. Probe-baserede qPCR metode generelt indebærer to trin: revers transkription (RT) og qPCR 4,26,27. RT er hvor hårnåle-RT-primeren hybridiseres til en moden eller primær miRNA molekyle og omdannes til komplementære (c) DNA. Kvantificering af cDNA-produktet udføres derefter ved hjælp af miRNA-specifikke PCR-primere26-28. Princippet om probe-baseret qPCR er baseret på påvisning af komplementære streng forlængelse i realtid, der involverer hydrolyse af fluorescens-mærkede probe. Disse prober er designet til at indeholde en fluorescerende reporter og quencher, der er lige fra hinanden for at tillade FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Påvisning af emissionen fra fluorescens reporter (emitter) er maskeret af den tætte nærhed af quencher molekylet. Når Taq-polymerase (pol) strækker sig fra den opstrøms primer og når en gaffel (5 'enden af sonden), Taq pol exonukleaseaktivitet hydrolyserer probe, hvilket fører til en fysisk dissociation / adskillelse af fluorescerende emitter fra quencheren. Denne udgave af et enkelt molekyle fluorescens emitter registreres af detektoren og præsenteres som en trinvis forhøjelse i fluorescens signal fra det godt / reaktion. Stigningen i fluorescens er proportional med mængden af PCR-produkt genereret, så en nøjagtig quantification af det amplificerede mål 26,28.
Med stigende efterspørgsel i miRNA kvantificering, har medium til avanceret teknologi er udviklet til at give et større antal prøver, der skal behandles i et kort stykke tid. TaqMan Low Density Array (TLDA) er en medium-throughput innovativt microfluidic design baseret på probe-baserede qPCR kemi tilbyder en stigning i antallet af miRNA analyseret på én plade. TLDA involverer anvendelsen af en foruddefineret pulje af RT-primere, der anvendes til at syntetisere cDNA. Disse cDNA'er derefter spindes til en tilpasset 384 godt mikro-strømningsteknisk kort til at bestemme ekspressionen af flere miRNA hjælp qPCR 22,26,29. Hver brønd af kortet indeholder tørrede primere og prober til amplifikation specifik miRNA (r), derfor op til 384 reaktioner kan behandles i én TLDA kort 26.
Den nanofluidics array er en high-throughput platform, der anvendes til påvisning af gentranskripter <sup> 24 anvendelse af den samme probe-baseret kemi. Det udnytter en proprietær matrix tilbyder hydrofobe-hydrofile vekselvirkninger at lette nem belastning af 33 nanoliter reaktionsblandingen i et array af 3072 gennemgående huller på en stål slide rustfri 24. Denne artikel fokuserer på at demonstrere, hvordan disse metoder til kvantificering miRNA i serum / plasma udføres og de kritiske faktorer, der skal overvejes, når du udfører og fortolke sådanne data. Taget til konto, vil deres individuelle fordele og begrænsninger diskuteres i denne artikel.
De kritiske skridt i probe-baseret qPCR protokoller til at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater er for at sikre, 1) den samme mængde og koncentration af RT-produkt er lagt i hver qPCR reaktion, 2) de korrekte forhold og mængder af komponenterne er nødvendige for qPCR reaktion er forberedt og blandes godt, 3) korrekt og konsekvent volumener til hver qPCR reaktion, og 4) forberedelse og lastning af hver prøve og reaktion mix er afsluttet i kortest tid som muligt, mens du stadig opmærksomme på ovennævnte kritiske trin nævnt tidligere.
De mikrofluidik array-kort skal egnet centrifuge og specifikke spande. Hver spand kan indeholde op til 3 kort (indlæst / tom). Sørg altid for, at alle 3 pladser i en spand er besat, og spanden afbalanceres ved at placere tilsvarende spand (denne spand bør også indeholde 3 kort, enten tomme eller fulde) i den modsatte slot af centrifugen. Mens placere kort i Bucket holder, skal du sørge for, at de 8 reservoirer rager opad og reaktionsbrønde står ydervæg centrifuge. Spin kortene ved 331 xg i 1 min ved stuetemperatur. Efter første tur, skal du åbne centrifugen og visuelt sikre reaktionsblandingen er blevet afgivet gennem 384 boringer. Gentag centrifugering ved samme indstillinger for 1 mere tid. Fjern kortet fra spanden og sikre, at niveauet for reaktionsblandingen i hver af de 8 reservoirer er ensartet. Eventuelle uoverensstemmelser i de væskevolumener tilbage i reservoirerne gøre kortet uhensigtsmæssigt at bruge yderligere.
At have den samme koncentration af RT-produkt, samme input koncentration af RNA tilsat til hver RT-reaktionen. Den totale RNA-koncentrationen måles ved anvendelse af en mikro-volumespectrophotometer. Den observerede 260/280 Forholdet kan være så lav som 1,3 til RNA isoleret fra plasma / serum; dette synes ikke at have en effekt på nedstrøms qPCR-relaterede proces eller data genereret 30. Ligeledes 260/280 forholdetde testede heri RNA-prøver var mellem 1,3-1,7 med unormale effekter i qPCR observeret.
Ved anvendelse af lave RNA indhold prøver, såsom dem fra Biofluids, kan det være vanskeligt at kvantificere RNA før forarbejdning. Vi anbefaler brug af syntetisk spike-in på RNA-isolering samt revers transkription etaper. Det er vores erfaring, Arabidopsis thaliana miRNA kandidater (ATH-miR-159A og ATH-miR-172a) er foretrukket frem Caenorhabditis elegans miRNA (såsom cel-miR-39 eller cel-miR-54), som efter vores erfaring kan have højere homologi end dem fra A. thaliana. Anvendelsen af sådanne trinspecifik spike-in kan redegøre for en normalisering af miRNA data på tværs af flere prøver analyseret på forskellige tidspunkter. Ved hjælp af en fast input volumen af RNA til cDNA-syntese reaktion anbefales også 32,33.
De tre probe-baserede protokoller for miRNA kvantificering beskrevet her kræver varierende mængderaf total RNA input forskellige arbejdsgange og omkostninger. Hver af de arbejdsgange er designet til at imødekomme forskellige gennemløb baseret på antallet af miRNA mål og antallet af prøver, der skal analyseres. Med stigende gennemløb (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), den pris pr reaktion falder med en stigning i mængden af data, der er opnået i løbet af en tidsenhed. Da alle disse platforme benytter TaqMan kemi, kan kvaliteten af data forventes at være ens. TaqMan qPCR er en veletableret metode til at identificere den overflod af miRNA i serum / plasma prøver 9,11,27. Selv om de tre platforme diskuteret her deler den samme kemi, et fald i reaktion volumen fører til et fald i dynamikområde transkript detektion (Farr RJ et al., Upublicerede data). Den 96-godt qPCR platform er en lavere overførselshastighed, men høj følsomhed platform og efter vores mening "gold standard" for alle sonde-baserede (eller farvestofbaseret) PCR-platforme. Men dette kanikke være den mest økonomiske eller effektiv platform, hvis flere hundrede eller tusindvis af prøver, der analyseres og for flere microRNA'er. Microfluidics (TLDA) og nanofluidics (OA) platforme er high-throughput / indholdsplatforme formål at muliggøre køb af større data på kortere tid. Selv om der er observeret batch forskelle i TLDA kort, kan dette blive minimeret ved at anmode TLDA kort fra det samme parti. Vi observerer, at TLDA platform (figur 3) viste betydelig variation i 17% af midten – lav hyppighed miRNA ved test under anvendelse af samme prøve på forskellige batches af TLDA kort. Vi anbefaler derfor, at bruge de samme batchnumre til analyse ved hjælp TLDA kort. Denne variation kan også skyldes den tekniske variation, herunder eventuelle lastning og pipetteringsfejl. Men vi anbefaler bestilling / anmodning om samme parti TLDA kort. Ingen signifikant batch variation blev observeret på OA platform. På trods af dette, TaqMan baseret eksperimenterendetal qPCR tilgange tilbyde lethed at måle overflod af miRNA i plasma / serumprøver. De lave, medium og høj tilgange diskuteres her tilbyde fleksibilitet til at analysere en række prøver og miRNA ved hjælp af en meget effektiv, reproducerbar og ren (lav baggrundsstøj) kemi.
The authors have nothing to disclose.
Alle forfattere anerkender infrastrukturen støtte fra NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien og Rebecca Cooper Foundation, Australien. Denne forskning blev finansieret via tilskud fra forskningsrådet australske (FT110100254) og JDRF, Australien (CRN201314) til AAH WW, RJF og MVJ gennemført alle våde lab eksperimenter, ASJ gennemført dataanalyse. WW skrev det første udkast. AAH planlagde undersøgelsen og analyseres dataene. Alle forfattere læst og accepteret af den endelige udgave af de håndskrevne, tal og regneark indsendt til offentliggørelse.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |