Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.
Sondenbasierten quantitative PCR (qPCR) ist ein bevorzugtes Verfahren zum Messen Transkript Fluss, da es eines der am meisten empfindlichen Nachweisverfahren, die eine genaue und reproduzierbare Analyse liefert. Sondenbasierte Chemie bietet den geringsten Grundfluoreszenz im Vergleich zu anderen (Farbstoff) Chemien. Gegenwärtig gibt es verschiedene Betriebssysteme, dass die Verwendung sondenbasierte Chemie Transkript Fluss zu quantifizieren. qPCR in einer 96-Well-Platte ist die routinemßig verwendete Verfahren ist jedoch nur ein Maximum von 96 Proben oder miRNAs kann in einem einzigen Durchlauf getestet werden. Dies ist zeitraubend und mühsam, wenn eine große Anzahl von Proben / miRNAs analysiert werden. Hochdurchsondenbasierten Plattformen wie Mikrofluidik (zB TaqMan Array Card) und nanofluidics Arrays (zB Openarray) bieten eine einfache reproduzierbar und effizient die Fülle von mehreren mikroRNAs detektieren in einer großen Anzahl von Proben in einer kurzen Zeit. Hier zeigen wir, den Versuchsaufbau einnd Protokoll für die miRNA-Quantifizierung von Serum oder Plasma-EDTA-Proben, mit Sonde-basierte Chemie und drei verschiedenen Plattformen (96-Well-Platte, Mikrofluidik und Nanofluidik Arrays) mit steigendem Durchsatz.
Mikro-RNAs (miRNAs) sind ~ 22 Nukleotid nicht-kodierenden (NC-) RNAs, die als Regulatoren der Genexpression 1-3. Die meisten miRNAs bei Tieren funktionieren durch sequenzspezifische Basenpaarung mit einer mRNA, zur Förderung der 3'-UTR, die negative Regulation der Genexpression 2-4 führt. Dies erfolgt in der Regel über eine Hemmung der mRNA-Translation oder durch ribosomale Drop-off. miRNAs Umlauf ist gezeigt worden, Biomarkern in Forschungs- und klinischen Gebieten für eine Vielzahl von Krankheiten, wie Diabetes 5-7, Eierstock- 8, 9 Prostata und Brustkrebs 10,11, Hepatitis B 12 und anderen Autoimmunerkrankungen 13 sein. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um reichlich miRNAs in verschiedenen Zellen oder Gewebe zu identifizieren, ebenso wie im Umlauf aus menschlichem Plasma und Serumproben, die besser zugänglich und weniger invasiv ist 9,11-15.
Verschiedene Methoden der miRNA Quantifizierung wurden established mit mehreren Plattformen, wie beispielsweise die Standard-96-Well-Platte Plattform 4,12,16-18, der Mikrofluidik Kartenplattform 12,18-23 und der Nanofluidik Array-Plattform 17,24. Quantitative real-time PCR (qPCR) bietet die Möglichkeit, relative oder absolute Zahl der Transkripte Messung mit mehreren (Farbstoff- oder Sonde-basierte) Chemie. Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Chemie bietet den Vorteil der niedrigen Hintergrundfluoreszenz und eine hohe Empfindlichkeit, eine einzige Abschrift Kopie zu erkennen. Es ist relativ kostengünstig, einfach zu bedienen und sehr gut reproduzierbar, so dass es eine bevorzugte Methode zur Quantifizierung und Bestimmung miRNA-Expression 25. Probe qPCR-basierte Verfahren umfasst im Allgemeinen zwei Schritte: die reverse Transkription (RT) und qPCR 4,26,27. RT ist, wo der Stamm-Schleifen-RT-Primer an einem reifen oder primären miRNA-Molekül hybridisiert und komplementären (c) DNA umgewandelt. Quantifizierung der cDNA-Produkt wird dann unter Verwendung miRNA-spezifischen PCR Primern26-28. Das Prinzip der sondenbasierten qPCR basiert auf dem Nachweis von Komplementärstrangverlängerung in Echtzeit, was die Hydrolyse des fluoreszenzmarkierten Sonde beinhaltet bezogen. Diese Sonden wurden entwickelt, um einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher, die nur voneinander entfernt sind, um FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) erlauben. Detektion der Emission von der Fluoreszenzreporter (Emitter) von der Nähe des Löschermolekül maskiert. Wenn Taq-Polymerase (pol) sich von der Stromaufwärts-Primer und erreicht eine Gabel (das 5'-Ende der Sonde), hydrolysiert das Taq Pol-Exonukleaseaktivität der Sonde, was zu einer physikalischen Dissoziations / Trennung des fluoreszierenden Emitters vom Quencher. Diese Version von einem einzigen Molekül Fluoreszenzemitter wird durch den Detektor erfasst und als eine inkrementelle Erhöhung des Fluoreszenzsignals von diesem gut / Reaktions dargestellt. Der Anstieg in der Fluoreszenz ist proportional zu der Menge an PCR-Produkt erzeugt wird, so dass eine genaue quantification des amplifizierten Ziel 26,28.
Mit zunehmender Nachfrage miRNA Quantifizierung mittlere bis hohe Durchsatz-Technologien wurden entwickelt, damit eine größere Anzahl von Proben in einer kurzen Zeit verarbeitet werden. TaqMan Low Density Array (TLDA) ist ein mittelDurch innovative mikrofluidische Design auf Sondenbasis qPCR Chemie bietet eine Erhöhung der Zahl von miRNAs auf einer Platte analysiert. TLDA beinhalten die Verwendung eines vorgegebenen Pool von RT-Primer, die verwendet werden, um die cDNA zu synthetisieren. Diese cDNAs werden anschließend in einen kunden 384er mikrofluidischer Karte gesponnen, um die Expression mehrerer miRNAs mittels qPCR 22,26,29 bestimmen. Jede Vertiefung der Karte enthält getrockneten Primer und Sonden zur spezifischen miRNA (en) zu verstärken, also bis zu 384 Reaktionen können in Einzel TLDA Karte 26 verarbeitet werden.
Die nanofluidics Array ein Hochdurchsatz-Plattform, die zum Nachweis von Gen-Transkripte verwendet wird <sup> 24 unter Verwendung der gleichen Sonde basierenden Chemie. Es nutzt eine proprietäre Matrix mit hydrophoben hydrophilen Wechselwirkungen einfache Laden der 33 Nanoliter-Reaktionsmischung in einer Anordnung von 3072 Durchgangslöcher auf einem Edelstahl-Schlitten 24 zu erleichtern. Dieser Artikel befasst sich zeigen, wie diese Methoden zur Quantifizierung von miRNAs im Serum / Plasma durchgeführt werden und die kritischen Faktoren, die berücksichtigt werden müssen bei der Durchführung und Interpretation dieser Daten. Getroffen, um Konto, werden ihre individuellen Vor- und Nachteile in diesem Artikel beschrieben werden.
Die kritischen Schritte innerhalb der Sonde qPCR-basierte Protokolle, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, sind Sie sicher, dass es 1) das gleiche Volumen und die Konzentration der RT-Produkt wird in jedem qPCR Reaktions geladen, 2) die richtigen Verhältnisse und Mengen der Komponenten benötigt qPCR Reaktion vorbereitet und gut gemischt, 3) die korrekte und einheitliche Volumina sind miteinander qPCR Reaktion gegeben, und 4) die Vorbereitung und Laden von jeder Probe und Reaktionsgemisch wird in kürzester Zeit wie möglich durchgeführt, während immer noch darauf achten, die obigen kritischen Schritte bereits erwähnt.
Die Mikrofluidik Array Karten müssen geeignete Zentrifuge und spezifische Eimer. Jede Schaufel kann bis zu 3 Karten (beladen / leer) zu halten. Achten Sie immer darauf, dass alle 3 Slots eines Becher belegt sind und die Schaufel, indem ähnliche Eimer (Eimer dies sollte auch 3 Karten, entweder leer oder voll enthalten) in die entgegengesetzte Schlitz der Zentrifuge ausgeglichen. Beim Aufsetzen der Karte in der bucket Halter, stellen Sie sicher, dass die 8 Stauseen projizieren nach oben und Reaktionsfeldern vor der Außenwand der Zentrifuge. Dreh die Karten bei 331 × g für 1 min bei Raumtemperatur. Nach dem ersten Durchlauf, öffnen Sie die Zentrifuge und optisch sicher, dass die Reaktionsmischung wurde durch die 384 Vertiefungen verzichtet. Wiederholen Sie den Spin bei gleichen Einstellungen für ein weiteres Mal. Entfernen Sie die Karte aus Eimer und sicherzustellen, dass das Niveau der Reaktionsmischung in jedem der acht Stauseen einheitlich ist. Etwaige Unstimmigkeiten bei den in den Behältern links Flüssigkeitsvolumen machen die Karte ungeeignet zum weiteren Gebrauch.
Um die gleiche Konzentration der RT-Produkt haben, wird dieselbe Eingangskonzentration von RNA in jedem RT-Reaktion gegeben. Die Gesamt-RNA-Konzentration wird unter Verwendung eines Mikro volumespectrophotometer gemessen. Die beobachtete 260/280 Verhältnis so niedrig wie 1.3 für die RNA aus Plasma / Serum isoliert werden; dies scheint nicht zu wirken auf den nachgelagerten qPCR bezogene Verfahren oder Daten erzeugt 30. Ebenso ist die 260/280 Verhältnisdie hier getesteten RNA-Proben lagen zwischen 1,3 bis 1,7 ohne abnormale Effekte in der qPCR beobachtet.
Bei Verwendung einer geringen Gehalt an RNA-Proben, wie die aus biologischen Flüssigkeiten, kann es schwierig werden, um RNA vor der Verarbeitung zu quantifizieren. Wir empfehlen die Verwendung von synthetischen Spike-in an der RNA-Isolierung sowie die reverse Transkription Stufen. Nach unserer Erfahrung Arabidopsis thaliana miRNA-Kandidaten (ath-miR-159a und ath-miR-172a) über Caenorhabditis elegans miRNAs (wie cel-miR-39 oder cel-miR-54), die in unserer Erfahrung können höher sind bevorzugt Homologie als die von A. thaliana. Die Verwendung einer solchen stufenspezifischen Spike-in kann für die Normalisierung der miRNA Daten über mehrere Proben zu verschiedenen Zeitpunkten getestet ausmachen. Mit einem festen Eingangslautstärke von RNA für die cDNA-Synthese-Reaktion wird auch empfohlen 32,33.
Die drei Sonden-basierte Protokolle für miRNA Quantifizierung hier beschriebenen erfordern unterschiedliche MengenGesamt-RNA-Eingang, unterschiedliche Workflows und Kosten. Jeder der Abläufe sind entworfen, um unterschiedliche Durchsätze, basierend auf der Anzahl der miRNA und der Anzahl der zu analysierenden Proben zu bieten. Mit zunehmendem Durchsatz (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), die Kosten pro Reaktion mit einer Zunahme in der Menge an Daten über eine Zeiteinheit erhalten wird. Da alle diese Plattformen nutzen TaqMan Chemie, kann die Qualität der erhaltenen Daten erwartungsgemäß ähnlich sein werden. TaqMan qPCR ist ein etabliertes Verfahren zur Identifizierung der Fülle von miRNAs im Serum / Plasma Proben 9,11,27. Obwohl die drei Plattformen hier diskutierten dieselbe Chemie, eine Abnahme der Reaktionsvolumen führt zu einer Verringerung des dynamischen Bereichs des Transkripts Detektion (Farr RJ et al., Unveröffentlichte Daten). Der 96-Loch-qPCR-Plattform ist eine geringeren Durchsatz, aber hohe Empfindlichkeit Plattform und unserer Ansicht nach der "Goldstandard" für alle sondenbasierten (oder dye based) PCR-Plattformen. Dies kann jedochdie wirtschaftlichste und effiziente Plattform nicht sein, wenn mehrere Hundert oder Tausende von Proben, die untersucht und für mehrere microRNAs. Mikrofluidik (TLDA) und nanofluidics (OA) Plattformen mit hohem Durchsatz / Content-Plattformen zur Akquisition von größeren Daten in kürzerer Zeit zu ermöglichen. Obwohl Chargenunterschiede wurden in den TLDA Karten beobachtet worden ist, kann diese durch Anfordern TLDA Karten aus dem gleichen Ansatz minimiert werden. Wir beobachten, dass TLDA Plattform (Abbildung 3) zeigten signifikante Unterschiede in 17% der Mitte – geringe Häufigkeit miRNAs bei der Prüfung mit dem gleichen Probe auf unterschiedliche Chargen TLDA Karten. Wir empfehlen daher die gleichen Chargennummern für die Analyse mit TLDA Karten. Diese Variante könnte auch aufgrund der technischen Variabilität inklusive eventueller Beladung und Pipettierfehlern sein. Wir empfehlen jedoch, Bestellung / Anforderung der gleichen Charge von TLDA Karten. Keine signifikante Batch-Variante wurde auf die OA-Plattform beobachtet. Trotzdem TaqMan basierend experimental qPCR nähert Angebot Leichtigkeit, um die Fülle von miRNAs im Plasma / Serum Proben zu messen. Die niedrigen, mittleren und hohen Durchsatz Ansätze hier nicht an die Flexibilität, um eine Reihe von Proben und miRNAs mit einem hocheffiziente, reproduzierbare und sauber (geringem Hintergrundrauschen) Chemie analysieren.
The authors have nothing to disclose.
Alle Autoren erkennen die Infrastruktur Unterstützung der NHMRC CTC, University of Sydney, der Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien und den Rebecca Cooper Foundation, Australien. Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Australian Research Council (FT110100254) und der JDRF, Australien (CRN201314) finanziert, um WW, RJF AAH und MVJ durchgeführt alle Nasslabor Experimente durchgeführt ASJ Datenanalyse. WW schrieb den ersten Entwurf. AAH geplant das Studium und die Daten analysiert. Alle Autoren lesen und einigten sich auf die endgültige Fassung der Handschrift, Zahlen und Arbeitsblätter zur Veröffentlichung eingereicht.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |