Cirkulerande mikroRNA har nyligen dykt upp som lovande och nya biomarkörer för olika cancerformer och andra sjukdomar. Målet med denna artikel är att diskutera tre olika probbaserad realtids-PCR-plattformar och metoder som finns tillgängliga för att kvantifiera och avgöra överflödet av cirkulerande mikroRNA.
Probe-baserade kvantitativ PCR (qPCR) är en gynnad metod för att mäta avskrift överflöd, eftersom det är en av de mest känsliga detektionsmetoder som ger en exakt och reproducerbar analys. Sond-baserad kemi ger det minsta bakgrundsfluorescens jämfört med andra (färgbaserat) kemier. För närvarande finns det flera plattformar tillgängliga att använda sondbaserad kemi för att kvantifiera transkriptet överflöd. qPCR i en 96 brunnar är det mest rutinmässigt använt metoden, men bara högst 96 prover eller miRNA kan testas i en enda körning. Detta är tidskrävande och tröttande, om ett stort antal prover / miRNA skall analyseras. Hög kapacitet sondbaserade plattformar som mikrofluidik (t.ex. TaqMan Array kort) och nanofluidik kedjor (t.ex. OpenArray) erbjudande lätthet att reproducerbart och effektivt upptäcka överflödet av flera mikroRNA i ett stort antal prover på kort tid. Här visar vi den experimentella uppställningen ennd protokoll för miRNA kvantifiering från serum eller plasma-EDTA prover, med hjälp av sond baserad kemi och tre olika plattformar (96 brunnar, mikrofluidik och nanofluidik arrayer) erbjuder ökande genomströmning.
MicroRNAs (miRNA) är ~ 22 nukleotid icke-kodande (nc) RNA, som fungerar som regulatorer av genuttryck 1-3. De flesta miRNA hos djur fungerar genom sekvensspecifik basparning med ett mRNA, med inriktning på 3 'UTR, vilket leder till negativ reglering av genuttryck 2-4. Detta sker oftast via hämning av mRNA translation eller genom ribosomal drop-off. miRNA i omlopp har visat sig vara nya biomarkörer inom forskning och kliniska områden för en mängd olika sjukdomar, såsom diabetes 5-7, äggstocks 8, prostata 9 och bröstcancer 10,11, hepatit B 12 och andra autoimmuna sjukdomar 13. Forskning har utförts för att identifiera rikliga miRNA i olika celler eller vävnader, samt i omlopp från human plasma och serumprov, som är mer tillgänglig och mindre invasiv 9,11-15.
Olika metoder för miRNA kvantifiering har established använder flera plattformar, såsom standard 96-brunnar plattform 4,12,16-18, den mikrofluidik kortplattform 12,18-23 och nanofluidik arrayen plattformen 17,24. Kvantitativ realtids-PCR (qPCR) erbjuder möjligheten att mäta relativa eller absoluta antalet utskrifter med hjälp av multipel (dye- eller probbaserad) kemi. Sondbaserad realtids-PCR kemi erbjuder fördelen av låg bakgrundsfluorescens och hög känslighet för att detektera en enda transkript kopia. Det är relativt kostnadseffektivt, enkelt att använda och mycket reproducerbar, vilket gör det en gynnad metod för att kvantifiera och bestämma miRNA uttryck 25. Sondbaserad qPCR metod involverar i allmänhet två steg: omvänd transkription (RT) och qPCR 4,26,27. RT är där stammen loop RT primer hybridiseras till en mogen eller primär miRNA molekyl och omvandlas till kompletterande (c) DNA. Kvantifiering av cDNA-produkten genomförs sedan med användning av miRNA-specifika PCR-primrar26-28. Principen för sondbaserad qPCR är baserad på detektion av komplementär sträng förlängning i realtid, vilket innebär hydrolys av fluorescent-märkta proben. Dessa sönder är utformade för att innehålla en fluorescerande reporter och en utsläckare som är bara från varandra för att tillåta FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Detektion av emissionen från fluorescens reportern (emitter) är maskerat av närheten av släckningsmolekylen. När Taq-polymeras (pol) sträcker sig från den uppströms primern och når en gaffel (5'-änden av sonden), hydrolyserar Taq Pol-exonukleasaktivitet sonden, vilket leder till en fysisk dissociering / separation av den fluorescerande emittern från släckningsenheten. Denna frisättning av en enda molekyl av fluorescens emitter registreras av detektorn och presenteras som en inkrementell ökning av fluorescenssignal från det väl / reaktion. Ökningen i fluorescens är proportionell mot mängden av PCR-produkt som genererats, vilket möjliggör en noggrann quantification av den amplifierade mål 26,28.
Med ökande efterfrågan i miRNA kvantifiering, har medium till teknik med hög kapacitet utvecklats för att möjliggöra ett större antal prover som ska behandlas på kort tid. TaqMan Low Density Array (TLDA) är en medel genomströmning innovativ mikroflödes design baserad på sondbaserad qPCR kemi som erbjuder en ökning av antalet miRNA analyserade på en platta. TLDA involverar användningen av en fördefinierad pool av RT-primrar som används för att syntetisera cDNA. Dessa cDNA sedan spinns till en anpassad 384 väl mikrofluid kort för att bestämma uttrycket av flera miRNA använder qPCR 22,26,29. Varje brunn av kortet innehåller torkade primers och prober för att förstärka specifika miRNA (s), alltså upp till 384 reaktioner kan behandlas i singel TLDA kort 26.
Den nanofluidik array är en hög genomströmning plattform som används för detektion av gentranskript <sup> 24 med användning av samma prob-baserad kemi. Det använder en egenutvecklad matris som erbjuder hydrofoba-hydrofila interaktioner för att underlätta enkel lastning av 33 nanoliter reaktionsblandningen in i en matris av 3072 genomgående hål på ett objektglas 24 rostfritt stål. Denna artikel fokuserar på att visa hur dessa metoder för att kvantifiera miRNA i serum / plasma utföras och de kritiska faktorer som måste beaktas när du utför och tolkning av sådana uppgifter. Taken till kontot, kommer deras individuella fördelar och begränsningar diskuteras i denna artikel.
De kritiska steg inom probbaserade qPCR protokoll för att få exakta och reproducerbara resultat är att se till att 1) samma volym och koncentration av RT-produkt är laddat i varje qPCR reaktion, 2) rätt nyckeltal och volymer av komponenterna som behövs för qPCR reaktion bereds och blandas väl, 3) korrekta och konsekventa volymer läggs till varje qPCR reaktion, och 4) förberedelse och lastning av varje prov och reaktionsblandning är klar på kortast tid som möjligt, men ändå medveten om ovanstående kritiska stegen nämnde tidigare.
De mikrofluidik array korten behöver lämplig centrifug och specifika hinkar. Varje hink kan innehålla upp till 3 kort (lastad / tom). Se alltid till att alla 3 platser i en hink är ockuperat och skopan balanseras genom att placera liknande skopa (denna hink bör även innehålla 3 kort, antingen tomma eller fulla) i motsatt slits centrifugen. Medan placera kortet i Bucket hållare, se till att de åtta reservoarer skjuter uppåt och reaktionsbrunnar möter yttervägg centrifug. Snurra korten på 331 xg under 1 min vid rumstemperatur. Efter första spin, öppnar centrifugen och visuellt se reaktionsblandningen har dispense igenom de 384 brunnarna. Upprepa spinn på samma inställningar för mer 1 gång. Ta ut kortet ur hinken och se till att nivån på reaktionsblandningen i varje av de åtta reservoarer är jämn. Eventuella inkonsekvenser i de flytande volymer kvar i behållarna gör kortet olämpligt att använda ytterligare.
Att ha samma koncentration av RT-produkten, är samma ingångskoncentration av RNA sattes in i varje RT-reaktion. Den totala RNA-koncentrationen mäts med en mikro volumespectrophotometer. Den observerade 260/280 förhållandet kan vara så låg som 1,3 för RNA isolerats från plasma / serum; Detta verkar inte ha en effekt på nedströms qPCR relaterad process eller data genererade 30. Likaså 260/280 förhållandet avRNA testade häri prover var mellan 1,3-1,7 utan onormala effekter i qPCR observerade.
Vid användning av låga innehåll prover RNA, såsom de från Biofluids, kan det vara svårt att kvantifiera RNA före behandling. Vi rekommenderar användning av syntetiska spik in på RNA isolering samt omvänd transkription stegen. Enligt vår erfarenhet Arabidopsis thaliana miRNA kandidater (ATH-MIR-159A och ath-MIR-172a) är att föredra framför Caenorhabditis elegans miRNA (såsom cel-MIR-39 eller cel-MIR-54), vilket enligt vår erfarenhet kan ha högre homologi än de från A. thaliana. Användningen av en sådan skedesspecifik spike-in kan svara för en normalisering av miRNA data över flera prover analyserades vid olika tidpunkter. Med hjälp av en fast ingångsvolym RNA för cDNA-syntes reaktion rekommenderas också 32,33.
De tre sondbaserade protokoll för miRNA kvantifiering beskrivs här kräver varierande mängderav total RNA-ingång, olika arbetsflöden och kostnader. Var och en av arbetsflöden är utformade för att tillgodose olika genomströmningar baserade på antalet miRNA mål och antalet prover som skall analyseras. Med ökande genomströmningen (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), kostnaden per reaktion minskar med en ökning av mängden data som erhålls under en tidsenhet. Eftersom alla dessa plattformar utnyttjar TaqMan kemi, kan förväntas kvaliteten på data som erhållits för att vara liknande. TaqMan qPCR är en väletablerad metod för att identifiera överflödet av miRNA i serum / plasmaprover 9,11,27. Fastän de tre plattformar som diskuteras här har samma kemi, en minskning av reaktionsvolymen leder till en minskning av dynamiskt intervall av transkriptet detektering (Farr RJ et al., Opublicerade data). Den 96-väl qPCR plattformen är en lägre genomströmning, men hög känslighet plattform och i våra ögon, den "gyllene standarden" för alla sondbaserade (eller färgämne baserat) PCR-plattformar. Detta kan dockinte vara det mest ekonomiska eller effektiv plattform om flera hundra eller tusen prover som analyseras och för flera mikroRNA. Mikrofluidik (TLDA) och nanofluidik (OA) plattformar är hög genomströmning / innehållsplattformar som syftar till att möjliggöra förvärv av större uppgifter på kortare tid. Även sats skillnader har observerats i TLDA korten, kan detta minimeras genom att begära TLDA kort från samma parti. Vi observerar att TLDA plattform (Figur 3) visade signifikant variation i 17% av mitten – låga överflöd miRNA vid testning med hjälp av samma prov på olika partier av TLDA kort. Vi rekommenderar därför att använda samma batchnummer för analys med hjälp TLDA kort. Denna variation kan också bero på den tekniska variabilitet inklusive eventuella lastnings- och pipetteringsfel. Vi rekommenderar dock beställning / begär samma parti TLDA kort. Ingen signifikant batch variation observerades på OA-plattformen. Trots detta TaqMan baserade experimental qPCR närmar erbjudande lätthet att mäta förekomsten av miRNA i plasma / serumprover. De metoder genomströmning låg, medium och hög diskuteras här erbjuder den flexibilitet för att analysera en rad prover och miRNA använder en mycket effektiv, reproducerbar och ren (lågt bakgrundsljud) kemi.
The authors have nothing to disclose.
Samtliga författare erkänna det stöd infrastrukturen från NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien och Rebecca Cooper Foundation, Australien. Denna forskning har finansierats genom bidrag från svenska forskningsrådet (FT110100254) och JDRFEN, Australien (CRN201314) att Aah WW, RJF och MVJ utfört alla våta lab experiment, ASJ utfört dataanalys. WW skrev det första utkastet. AAH planerade studien och analyserade data. Alla författare läst och godkänt på den slutliga versionen av manuskriptet, siffror och kalkylblad som lämnats för publicering.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |