Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

doi: 10.3791/52586 Published: April 14, 2015

Summary

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Abstract

Bir doğru ve tekrarlanabilir bir analiz sağlayan en hassas algılama yöntemlerinin biri olduğu sistemi tabanlı bir kantitatif PCR (qPCR), kopya çokluğunu ölçmek için tercih edilen bir yöntemdir. Probe-tabanlı kimya diğer (boya-tabanlı) kimyaları ile karşılaştırıldığında en az arka plan floresan sunuyor. Halen, transkript bolluğu ölçmek için kullanan prob-tabanlı kimya kullanılabilir çeşitli platformlar vardır. 96 oyuklu bir plaka içerisinde QPCR ancak 96 numune veya miRNA'ların sadece maksimum tek bir çalışma olarak test edilebilir en rutin olarak kullanılan bir yöntemdir. Numunelerin büyük bir sayı / miRNA'ların analiz edilecek ise, bu, zaman alan ve sıkıcı bir iştir. Örneğin, mikroflüidik (örneğin TaqMan® Dizi Card) NANO AKIŞKAN diziler (örneğin, OpenArray) teklif kolaylığı gibi yüksek verimli tarama sistemi tabanlı platformların yeniden üretilebilir ve etkili bir şekilde kısa bir süre içinde numune çok sayıda çok sayıda mikroRNA bolluk tespit etmek. Burada, deneysel kurulum a göstermeknd hacmi artan düzeyi sunan sistemi tabanlı kimya ve üç değişik platformlar (96 boşluklu plaka, mikroflüidik ve NANO AKIŞKAN dizileri) kullanılarak, serum ya da plazma örnekleri EDTA gelen MiRNA nicelendirilmesi için protokol.

Introduction

MikroRNA'lar (miRNA'ların) gen ifadesinin 1-3 düzenleyicileri olarak işlev, ~ 22 nükleotid kodlayıcı olmayan (NC) RNA bulunmaktadır. Hayvanlarda çoğu miRNA'ların gen ifadesinin 2-4 negatif regülasyonuna yol açar 3 'UTR, hedef, bir mRNA ile sekansa özel baz eşleştirme yoluyla işlev görür. Bu, genellikle, mRNA dönüşümünün bir engellenmesi ile veya ribozomal açılan kapalı gerçekleşir. Dolaşımdaki miRNA'ların diyabet 5-7, yumurtalık 8, prostat 9 ve meme kanseri 10,11, hepatit B 12 ve diğer otoimmün hastalıklar 13 gibi hastalıkların, çeşitli araştırma ve klinik alanlarında yeni biyomarkerler olduğu gösterilmiştir. Araştırma daha erişilebilir ve 9,11-15 daha az invaziv insan plazma ve serum örneklerinden, dolaşımı gibi, farklı hücrelerde veya dokularda bol miRNA'lar tespit için yapılmıştır.

MiRNA miktar Farklı yöntemler, e olmuşturBu tür standart 96-plaka platformu 4,12,16-18, Mikroakiskan kartı platformu 12,18-23 ve NANO AKIŞKAN dizisi platformu 17,24 gibi birden çok platform kullanarak stablished. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) çoklu (dye- veya prob-bazlı) kimyaları kullanarak transkript göreceli veya mutlak sayıları ölçmek için yeteneği sunar. Probe-tabanlı gerçek zamanlı PCR kimya, tek bir transkript kopya tespit etmek için düşük eşiğe ve yüksek hassasiyet yarar vardır. Nispeten miktarının ve miRNA ifade 25 belirlemek için ona bir tercih yöntemi yaparak, etkin kullanımı basit ve son derece tekrarlanabilir mal edilir. Transkripsiyon (RT) ve qPCR 4,26,27 ters: Probe-tabanlı qPCR yöntemi genellikle iki adımdan oluşur. Sap-halka RT primer olgun veya birincil MiRNA molekülüne hibridize tamamlayıcı (c) DNA haline dönüştürülür burada RT. CDNA ürününün miktarının belirlenmesi sonra MiRNA özgü PCR primerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir26-28. sistemi tabanlı qPCR prensibi floresan-etiketli prob hidrolizini içerir, gerçek zamanlı olarak tamamlayıcı şerit uzantısı, tespitine dayanmaktadır. Bu sondalar, bir flüoresan raportör ve FRET (flüoresan rezonans enerji transferi) izin vermek için sadece ayrı olan bir söndürücü içerecek şekilde dizayn edilmiştir. Floresan muhabiri (verici) den emisyon Algılama söndürücü molekülünün yakınlığı ile maskelenir. Taq polimeraz (POL) ve yukarı akan primerde uzanır ve bir çatal (probun 5 'ucu) ulaştığında, Taq pol ekzonükleaz aktivitesi söndürücü floresan damlatıcının fiziksel ayrılma / ayrılmasına yol açan sonda hidrolize eder. Floresan vericisi tek bir molekülün Bu sürüm, detektör tarafından kaydedilir ve çok iyi / reaksiyonundan flüoresan sinyalinde bir artış kademesi olarak sunulmuştur. Floresanstaki artış doğru qu izin üretilen PCR ürününün miktarı ile orantılıdıramplifiye edilmiş hedef 26,28 arasında antification.

MiRNA miktarının artan talep ile birlikte, yüksek hacimli teknolojilere ortam numunelerinin daha fazla sayıda kısa bir miktarda işleme izin vermek için geliştirilmiştir. TaqMan Düşük Yoğunlukta Dizi (TLDA) bir plaka üzerinde analiz miRNA'ların sayısında bir artış sağlar sistemi tabanlı qPCR kimyasına dayanan bir orta akış yenilikçi mikroakışkan tasarımdır. TLDA cDNA'yı sentezlemek için kullanılan RT-primerler, önceden tanımlanmış bir havuz kullanılmasını içerir. Sonra, bu cDNA'lar qPCR 22,26,29 kullanarak birden fazla miRN'nın ekspresyonunu belirlemek için özelleştirilmiş bir 384 gözlü mikro-akışkan kart içine döndürülmektedir. Kartın her çukuru, bu nedenle tek bir TLDA kartı 26 içinde işlenebilir 384 reaksiyonlara, spesifik miRNA (ler) çoğaltmak için primerler ve problar, kurutuldu içerir.

NANO AKIŞKAN dizi gen transkriptlerinin saptanması için kullanılan yüksek verimli bir platformdur 24 3072 bir diziye 33 nanoliter reaksiyon karışımının kolay yüklemeyi kolaylaştırmak için hidrofobik-hidrofilik etkileşimler sunan özel bir matris kullanır. Bu makalede, serum / plazma içinde miRNA'lar ölçülmesi için bu yöntemler uygulandı ve performans ve bu verileri yorumlarken dikkat edilmesi gereken kritik faktörler nasıl gösteren odaklanır. Hesaba alındığında, bireysel fayda ve sınırlamalar, bu makalede ele alınacak.

Protocol

Toplam RNA, laboratuarda 30 ya da başka ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak kurulan bir protokol kullanarak serumdan izole edilebilir.

NOT: Her deneyde reaksiyon hacimleri hesaplamak için ek interaktif elektronik tablolar (% 5 fazla hacim ile pipetleme sorumluydu dahil) temin edilmiştir.

1. sistemi tabanlı Gerçek Zamanlı qPCR bir standart 96 oyuklu plaka Platform kullanılması

  1. miRNA serum / plazma RNA örnekleri üzerinde cDNA sentezi (ters transkripsiyon)
    1. Hesaplayın ve her cDNA sentez reaksiyonu için RNA 10 ng çıkar. (5 ul reaksiyon için) 1.67 ul 10 ng RNA son hacim nükleaz içermeyen su ilave edilir. Buz üzerinde örnekleri tutun.
    2. MiRNA seçin ve RT astar eritin.
    3. RT tamponu (10X), dNTP (100 mM), RNaz inhibitörü (20 U / ul): RT reaktif karışım bileşenleri çözülme. Yer enzimi tutmak asla (rekombinant moloney fare lösemi virüsü(RMoMuLV)) (recombinanat Moloney murin lösemi virüsü (rMoMuLV), buz üzerinde ters transkriptaz (50 U / ul). Gerekli olana kadar ya da bir dondurucu blok -20 ° C'de saklayın.
    4. Tablo 1A 'da tarif edildiği gibi buz üzerinde RT reaktif karışımı hazırlayın. Bu, en az 5% pipetleme hatayı telafi için fazla hacmi hazırlanması tavsiye edilmektedir.
    5. 0.2 ml PCR tüp / plaka içine RT reaktif karışımı her 2.33 ul ekleyin.
    6. Vortex RT astar tüpler 10 saniye için 10,000 xg'de sonra santrifüj kısaca karıştırın. Kendi PCR tüpleri ya da plaka miRNA özgü RT astar 1 ul ekleyin. Plaka ilgili PCR tüpleri ve çukurlara seyreltildi RNA 1.67 ul ekleyin. Buz üzerinde, tüm eklemeler yapın.
    7. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1950 x g'de, reaksiyon borusu ya da plaka santrifüjleyin.
    8. 30 dakika, 85 ° 30 dakika boyunca 16 ° C, 42 ° C: Aşağıdaki ayar koşullarda termal döngü MiRNA cDNA sentez programı ayarlama5 dakika ve beklemeye 4 ° C'de bekletilmiştir.
    9. 10 ul reaksiyon hacmi ayarlayın. Termal döngü içine reaksiyon tüpleri veya plaka yükleyin. RT çalıştırmak başlatın. Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu devam hemen değilse, -20 ° C 'de cDNA'sı (RT) tepkileri saklayın.
  2. Olgun miRNA'lar tespiti için gerçek zaman qPCR Probe-tabanlı
    1. İlgili RT ürün için seçilen prob-tabanlı qPCR deneyleri (20X) Çözülme.
    2. Şişe dönen tarafından gerçek zamanlı PCR (qPCR reaktif mix) yerindelik tek çözüm karıştırın.
    3. Her MiRNA analiz edilecek için QPCR reaktif karışımı hazırlayın. QPCR her MiRNA numunesi için bir steril 1.5ml mikrosantrifüj tüpü elde edilir ve Tablo 1B 'de tarif edildiği gibi, her bir tüpe ilave bileşenleri hazırlamak. Bu, en az 5% pipetleme hatayı telafi için fazla hacmi hazırlanması tavsiye edilmektedir.
    4. Optik 96 gözlü bir levha (ya da boruların) her oyuğuna ayrı ayrı qPCR reaktif karışımı 4.2 ul ekleyin. 0.8 ul ekleilgili cDNA reaksiyonunun ilgili oyuğuna (her MiRNA'lar Aşama 1.1 sentezlenir).
    5. Uygun optik kapaklı plaka Seal. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1950 x g'de levha (ya da boruların) santrifüj
    6. Bilgisayar, 96-plaka / Mikroakiskan dizi okuyucu açın ve nihayet yazılımı başlatmak. Makineler doğru şekilde bağlanmış ve doğru blok ve (hızlı 96 plaka için) ısıtmalı kapak yerdesiniz emin olun.
    7. Seç deney, 96 oyuklu hızlı bir blok (0.1 mi), bir standart eğri, TaqMan reaktifler ve hızlı mod. 20 saniye için 95 ° C, 50 çevrim (1 saniye, 30 saniye için 60 ° C, 95 ° C), aşağıdaki programı döngü koşulları kullanılarak gerçek zamanlı PCR ile sistemde qPCR ayarlayın.
    8. 10 ul reaksiyon hacmi ayarlayın. Aracı haline reaksiyon tüpü veya plaka yükleyin. Basın "run başlat". Program tamamlanması yaklaşık 1 saat sürecektir.

2. Probe-tabanlı Mikroakiskan Dizi Kartı (Card A ve B)

NOT: Probe-tabanlı miRNA panel iki 384-iyi mikroakışkan kartları (Dizi kartı A ve Dizi kartı B) bir dizi olarak geliyor. Her bir kart kadar 380 miRNA'lar ve kontroller için kurutulmuş Astarlar ve sondalar içerir. ile (ya da ön-amplifikasyon olmadan) kart ya da kart B özel cDNA Ürün, gerçek zamanlı PCR için karşılık gelen bir dizi yüklenir.

  1. Ters transkripsiyon (RT)
    1. 1-1,000 ng toplam RNA girişi için bu protokolü kullanın. Giriş 1-350 ng arasında ise, bir ön-amplifikasyon (pre-amp) adımı gerçekleştirmek. 350 ng girişler için, ön-amp olmadan dizi kartları doğrudan cDNA yükleyin.
      Not: Serum MiRNA profil için, toplam RNA 100 ng ile başlar. Tam bir miRNA profili için, numune başına RT reaksiyonlar (Havuz A ve B Grubu) RT-primer setleri önceden tanımlanmış iki havuzları çalıştırın.
    2. Buz üzerinde aşağıdaki reaktifler çözülme. RT primerleri (10x): Havuz A ve Havuz B, dTTP (100 mM), RT tamponu (10x), MgCI2 (25mM), RNaz inhibitörü (20 U / & sahip dNTP'ler181. l). Buz üzerinde enzim (yeniden birleştirici Moloney murin lösemi virüsü (rMoMuLV)) ters transkriptaz (50 U / ul), tutun. Gerekli olana kadar -20 ° C'de saklayın.
    3. Yavaşça enzim hariç, tüm reaktifler vorteks ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de tüpler santrifüj.
    4. Iki tüp içine, Tablo 2A'da tarif edildiği gibi, reaktif birleştirin; Havuz A tek bir boru, Havuz B için diğer her tüp, pipetleme hatasını telafi etmek için, en az 5% fazla hacmi hazırlamak için tavsiye edilir Havuz A ve Havuz B ile ilgili ya da RT primer kümesinin sadece önceden tanımlanmış bir havuz içerecektir .
    5. Karıştırmak için ters çevirin ve 10 saniye boyunca 10,000 xg'de sonra santrifüj kısaca. Kısım 100, yeni bir tüp içine Her RNA numunesinin ng, daha sonra 3 ul'lik bir toplam yapmak nükleaz içermeyen uygun bir su hacmi ekleyin.
    6. Kısım ilgili tüpler içine uygun RT reaktif karışımı 4.5 ul. Karıştırmak için ters çevirin ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de santrifüj. Buz üzerinde inkübe5 dakika karıştırıldı.
    7. Bir ısıl-döngü birimi içerisine ve aşağıdaki koşullar kullanılarak RT başlangıç ​​yeri örnekleri: 40 döngü (2 dakika için 16 ° C, 1 dakika için 42 ° C, 1 saniye için 50 ° C), 5 dakika boyunca 85 ° C, 4 ° tutma C. Mağaza cDNA ° C -25 -15 RT-primerler bu önceden tanımlanmış havuzu kullanılarak oluşturulan ya da hemen kullanılır.
  2. Ön amplifikasyon
    1. Buz üzerinde pre-amp primerlerin önceden tanımlanmış havuzu çözülme. Yavaşça vorteks primerleri ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de santrifüj. Girdap TaqMan PreAmp reaktif karışımı nazik dokunarak (2X), karıştırın.
    2. Iki tüp içine, Tablo 2B'de tarif edildiği gibi, reaktif birleştirin; Havuz A tek tüp, Havuz B. diğer
      NOT: Yukarıda açıklandığı gibi, A pre-amp primerler tüp A gidecek ve Havuz B primerleri en az 5% pipet hatasını telafi etmek için aşırı hacim hazırlamak için tavsiye edilir tüp B'ye gitmek gerekir.
    3. Karıştırmak için ters çevirin ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de santrifüj.Kısım Yeni tüpler içine uygun PreAmp reaktif karışımı 22.5 ul. Kısım ilgili tüp içine (RT aşamasında elde edilmiştir) bir cDNA numunesinin 2.5 ul.
    4. Karıştırmak için ters çevirin ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de santrifüj. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Bir termalcycler içine yerleştirin örnekleri ve ön-amp döngüsü başlar. Devir koşulları şunlardır: 10 dakika sonra 2 dakika süre ile 55 ° C, 2 dakika, 12 döngü (15 saniye için 95 ° C, 4 dakika için 60 ° C), 10 dakika boyunca 99.9 ° C sıcaklıkta 72 ° C, 95 ° C tutmak 4 ° C'de ilave edildi.
    5. Invert 10 saniye boyunca 10,000 x kısaca santrifüj sonra karıştırmak cDNA önceden güçlendirilmiş ve. (1: 4 seyreltme) 0.1x TE tamponu (pH 8.0) içinde önceden büyütülmüş cDNA 75 ul ekle. Karıştırmak için seyreltilmiş pre-amp örnekleri haricindekileri ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de santrifüj. Mağaza bir haftaya kadar -15 ila -25 ° C 'de cDNA önceden büyütülmüş, ya da hemen kullanılabilir seyreltilmiştir.
  3. Mikroakiskan kartları yükleme ve qPCR performans
    1. Mikroakışkanları tutundışında en az yarım saat için miRNA kartları oda sıcaklığına ulaşmasını. Buz üzerinde seyreltilmiş önceden güçlendirilmiş cDNA çözülme ve kısa bir spin ardından tüpler ters çevrilerek karıştırın. Şişe dönen tarafından QPCR reaktif karışımı karıştırın.
    2. Yeni tüp içinde seyreltilmiş ön amplifikatörle yükseltilmiş cDNA 9 ul QPCR reaktif karışımı 450 ul ilave edin. Kart A için, önceden güçlendirilmiş ürün 900 ul son hacim yapmak için astar Havuz A. nükleaz ücretsiz su 441 ul ekleyin kullanılarak hazırlanan kullanın. Karıştırmak için tüp ters çevirin ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de santrifüj.
    3. Ambalajından TLDA kartı (bu ulaştığında oda sıcaklığı) çıkartın ve aşağı folyo yüzü temiz bir alanda koyun. Kartında 8 dolgu bağlantı noktasının her PCR reaksiyon karışımı 100 ul ekle. Rezervuarın her birine 2 bağlantı noktası (her kartta toplam 8 rezervuar) vardır.
      NOT: havalandırma ağzı küçük delik ise dolgu liman, reaksiyon karışımı ilave edilir büyük delik. Her miRNA TLDA kartı 8 rezervuar vardırs, her böylece aynı PCR reaksiyon karışımı ile karttaki 384 kuyu yükleme, 48 Kuyular (bir sütun x 2 sütun 24 kuyulara) yol açar. O Havuz A olun ve her numunenin Havuzu B ilgili TLDA kartlarında yüklenir. Santrifüj uzman Mikroakiskan dizi kart sahibinin kova dizi kartı yerleştirin.
    4. Mikroakiskan dizi kartları için, ve (örneğin, "TaqMan Dizi Kart" sahipleri gibi) belirli kovalar (örneğin Heraeus Multifuge 3SR, 230V santrifüj gibi) uygun bir santrifüj kullanın. Her kova 3 kartları (yüklü / boş) kadar tutabilir. Her bir kova 3 slot işgal ve kepçe santrifüj karşı yuvasına benzer kova (bu kova da boş veya tam 3 kart, içermelidir) koyarak dengeli olduğundan emin olun. Kova yuvasına kartı yerleştirerek iken, 8 rezervuarlar yukarı proje ve reaksiyon kuyuları santrifüj dış duvar baktığından emin olun.
      1. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 331 x g'de kartları dönerler. Sonraİlk spin, santrifüj açmak ve görsel reaksiyon karışımı 384 kuyudan dağıtılan olmuştur emin olun. 1 kez daha aynı ayarlarda sıkma tekrarlayın. Kova kartı çıkarın ve 8 rezervuarların her reaksiyon karışımı seviyesi muntazam olduğundan emin olun. Rezervuar sol sıvı hacminde herhangi bir tutarsızlık daha kullanmak için kart uygunsuz olun.
    5. Microfluidics dizi kart hassas bir kalem düzeneği (taşıma) bir dizi sıvı dağıtım kanallarını kapatır ve aynı (toplam reaksiyon hacmi, 1 ul / çukur), tüm kaynaklarda Reaksiyon karışımı dağıtmak için olan özel bir sızdırmazlık maddesi gerekir.
    6. Başlangıç ​​pozisyonuna getirin ve taşıyıcısını folyo tarafı mühürleyen yüklenen kartı takın ve mühürleyen üzerinde kalemle pimleri dizilmiş. Bu mühürleyen bitiş noktası ulaşana kadar bir, yavaş istikrarlı ve tek tek tip inme, kartın üzerinde taşımayı itin. Mühürlü dizi kartını çıkarın ve daha sonra rezervuar kestimakas kullanılarak kartından s.
    7. Doğru blok, ısıtmalı kapak ve örnek taşıyıcı Mikroakiskan dizi gerçek zamanlı PCR sistemi / makine yüklü olduğundan emin olun.
    8. Bilgisayarda sonra Mikroakiskan dizi sistemini açın ve nihayet yazılımı başlatmak. Makineler doğru bağlandığından emin olun. Dizi kartı, standart eğri, TaqMan reaktif ve standart modu olarak seçin deney. Kart A ve B iki kart için kurulum dosyalarını içe dosyayı kaydedin.
    9. Cihazın önüne doğru sol üst köşedeki ve barkod de hiç A1 ile alet tepsisine mühürlü kart yerleştirin. Basın "Başlat Çalıştır". Program tamamlamak için yaklaşık 2 saat sürecektir.

3. Probe-tabanlı NANO AKIŞKAN İnsan miRNA Paneli

  1. Ters transkripsiyon (RT)
    1. Ancak 100 ng çoğu örnekler için uygun olan, 50-200 ng toplam RNA girişi için bu protokolü kullanın. Tam bir miRNA profili için, iki predefi çalıştırmakNumune başına RT reaksiyonlar (Havuz A ve B Grubu) RT-primer setleri ned havuzları.
    2. DTTP (100 mM), RT tamponu (10x), MgCl2 (25mM), RNaz inhibitörü (20 U / ul), RT primer seti (10X), dNTP önceden tanımlanmış pool buz üzerinde reaktif çözülme. Buz üzerinde enzim (rekombinant moloney fare lösemi virüsü (rMoMuLV) ters transkriptaz (50 U / ul) tutmayın. -20 ° C'de saklayın gerektiği kadar. Nazikçe enzim hariç, tüm reaktifler vorteks ve kısaca 10,000 onları santrifüj 10 saniye için xg.
    3. Iki tüp içine, Tablo 3A'da tarif edildiği gibi, reaktif birleştirin; Havuz A tek bir boru, Havuz B için diğer her tüp, Havuz A ve Havuz B ile ilgili ya da RT-primer kümesinin sadece önceden tanımlanmış bir havuz içerecek en az 5% pipetleme telafi etmek için fazla hacmi hazırlanması önerilir Hata.
    4. Pipet karıştırın ve 10 saniye boyunca 10,000 x g'de santrifüj sonra kısa bir süre için. Kısım 100, yeni bir tüp içine Her RNA numunesinin ng, daha sonra uygun bir hacim kazandırmaknükleaz içermeyen su 3 ul'lik bir toplam yapmak. Kısım ilgili tüpe uygun RT reaktif karışımı 4.5 ul.
    5. Karıştırmak için ters çevirin ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de santrifüj. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Bir termalcycler içine yerleştirin örnekleri ve RT programını başlatın. Devir koşulları şunlardır: 40 kez, sonra 5 dakika süreyle 85 ° C (2 dakika, 1 dakikada, 1 saniye için 50 ° C, 42 ° C 16 ° C), 4 ° C'de tutun. Mağaza cDNA -15 -25 ° C'de set RT-astar bu önceden tanımlanmış havuzu kullanılarak ya da hemen kullanın üretti.
  2. Ön amplifikasyon (pre-amp)
    1. Buz üzerinde belirlenen ön-amp astar önceden tanımlanmış havuzu çözülme. Yavaşça vorteks primerler, daha sonra kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de santrifüj. Girdap TaqMan PreAmp reaktif karışımı (2X) karıştırın.
    2. Iki tüp içine, Tablo 3B'de tarif edildiği gibi, reaktif birleştirin; Havuz A tek tüp, Havuz B. diğer Her tüp ya fr RT-primer setleri sadece önceden tanımlanmış bir havuz içerecektirom Havuz A veya Havuz B'den en az 5% hatası pipetle telafi etmek için aşırı hacim hazırlamak için tavsiye edilir.
    3. Pipet karıştırın ve daha sonra kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de onları santrifüj. Kısım Yeni tüpler içine uygun PreAmp reaktif karışımı 22.5 ul. Kısım ilgili tüp içine cDNA örnek 2.5 ul. Karıştırmak için ters çevirin ve ardından kısa bir süre 10 saniye 10,000 xg'de tüpler santrifüj. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
    4. Place termalcycler içine örnekler ve ön-amp çalıştırın. 25 ul ayarlayın reaksiyon hacmi. Devir koşulları şunlardır: 10 dakika sonra 2 dakika süre ile 55 ° C, 2 dakika, 12 döngü (15 saniye için 95 ° C, 4 dakika için 60 ° C), 10 dakika boyunca 99.9 ° C sıcaklıkta 72 ° C, 95 ° C tutmak 4 ° C'de ilave edildi.
    5. Invert 10 saniye boyunca 10,000 x kısaca santrifüj sonra karıştırmak cDNA önceden güçlendirilmiş ve. Yeni tüplerde 0.1x TE Tamponu, pH 8.0 (1:40 seyreltme), 156 ul önceden büyütülmüş cDNA 4 ul ekle. Sulandırılmış karıştırmak için pre-amp örnekleri, ve sonra kısaca ce haricindekileri10 saniye için 10,000 x g'de ntrifuge. Mağaza seyreltildi ve en fazla bir hafta boyunca -15 ila -25 ° C'de seyreltilmemiş ön yükseltilmiş cDNA, ya da hemen kullanılır.
  3. NANO AKIŞKAN Diziler Yükleme ve qPCR Sahne
    1. NANO AKIŞKAN dizi slayt seri numarasını kullanarak web sitesinden 31 ilgili plaka dosyası (.tpf) indirin. Bu özel NANO AKIŞKAN dizi slayt için çalışma bilgilerini içerir.
    2. Çözülme seyreltilmiş ön-yükseltilmiş cDNA ve TaqMan Real-Time qPCR reaktif karışımı buz üzerinde (ilk defa kullanıyorsanız). Şişe dönen tarafından QPCR reaktif karışımı karıştırın. Yeni tüplerde seyreltilmiş ön amplifikatörle yükseltilmiş cDNA 22.5 ul QPCR reaktif karışımı 22.5 ul ekleyin. Yavaşça girdap karıştırmak ve ardından kısa bir süre, 10 saniye boyunca 10,000 x g'de santrifüj.
    3. Kısım NANO AKIŞKAN dizi iş akışı 384 gözlü numune plakasının 8 kuyu içine her bir numune 5 ul (2 kolon, 4 sıra). Her numunenin Havuz A ve B Grubu komşu 8-kuyu bloklar halinde olduğundan emin olun (bkz Figure 1 veya Ek) düzeni için levha excel.
      1. Her numune plaka örneklerinin değer kadar sekiz slayt içerebilir. Ancak, NANO AKIŞKAN dizi için sistem sadece tek bir vadede 4 NANO AKIŞKAN dizileri işleyebilir. Numunelerin değerinde fazla dört slaytlar bir örnek plaka üzerinde yüklü olması ise, kalan bölümler mühürlü emin olun. OpenArray örnek plaka kapatıcı ile mühür.
        NOT: Bu tavsiye edilir gerekli bölüme mühürleyen önceden kesilmiş, bu yüzden bölümler buharlaşmayı azaltmak için bireysel olarak mühürsüz / kapatılabilir. Seçenek olarak ise, plaka dokunulmamış kapatıcısıyla kapatıldı olabilir ve yüklenirken bundan sonra da kesimler bireysel olarak kesilebilir.
    4. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 490 x g'de santrifüje plaka. 1 saat içinde NANO AKIŞKAN dizi slaytları yükleyin. Nedeniyle slaytlar mühür izin sınırlı bir süre için, bir defada yalnızca bir slayt yüklemek lütfen. Dondurucu NANO AKIŞKAN dizi slayt çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyinerature (~ 15 dakika).
    5. Doğru blok, ısıtmalı kapak ve örnek taşıyıcı NANO AKIŞKAN dizisi sistemde yüklü olduğundan emin olun. Bilgisayar ve real-time PCR sistemi ve yükleme sistemi açın. İlgili yazılıma erişmek ve makineler bağlandığından emin olun. Ambalajından yükleme sistemi sarf (Dizi slayt kapağı, fiş ve daldırma sıvısı) sökün.
    6. Yavaşça gevşetin daldırma sıvısı şırınga pistonu çekin. , Kapağını çıkarın ucundan itibaren ucu ve gömme havayı yerleştirin. Makinenin içindeki yükleme sistemi ipuçları yerleştirin ve kapağı çıkarın. PCR sistemi içinde örnek plakasını yerleştirin.
    7. Eldivenleri koyun. Yanlışlıkla slayt kapağı işaretleme riskini en aza indirmek için sıkı uydurma olduğundan emin olun. Dikkatlice açın slayt ambalaj. Yavaş yavaş eline slayt ipucu. Slayt üst dokunmayın.
    8. Soldaki barkodlu, PCR sisteminin içine slayt yerleştirin. Yükleme amaçlı numune plaka kısmından mühürleyen çıkarın. Yükleme sistemini kullanınYazılım slayt barkod girmek için, pozisyon, örnek konumu ve ucu yapılandırmasını kaydırın.
    9. ilgili tüm kontroller tamamlandıktan basın yük slayt. PCR sistemi slayt yüklerken, slayt kapağın altından açık ve kırmızı plastik çıkarın. Yükleme bittiğinde, dikkatlice çıkarın ve 90 saniye içinde slayt mühür.
      1. Plaka kelepçe içinde slayt yerleştirin. Slayt üzerine slayt kapağını yerleştirin. 30 saniye için kelepçe. Bu barkod doğru görüntülenir, böylece kapak yerleştirildiğinden emin olun. Plaka kelepçe gelen aksamını çıkarın.
      2. Slayt içinde Pozisyon daldırma sıvısı şırınga ucu kapağa karşı basarak böylece. Yavaş yavaş kapak boyunca sıvı çalışır sağlanması, daldırma sıvısı ile slayt doldurun. Tam kez, kolu kırılır kadar vidayı çevirerek, fişi ile slayt mühür.
      3. Slayt kapağının üstündeki plastik kapağı çıkarın ve sonra dikkatlice real-time PCR sistemi slayt taşıyıcı içine yerleştirin. Su olduğundan emin olunaniden düşmemesi ve slayt üst dokunmayın böylece slayt altındaki versitenin o indirdi ediliyor gibi. Bu 1 saat içinde qPCR programı slayt / cassette.Initialize PCR sisteminin kenarlarına dokunacak ve başlatmak için Tamam.
    10. PCR sistem yazılımı içinde "OpenArray" seçiniz. Basın "Slayt kimlikleri bulun". Bu birkaç dakika sürer. Yazılım plaka numarası bulamıyorsanız elle girilmesi için, o soracaktır.
    11. Basın "Plaka Merkezleri Onayla". Yine, bu bir kaç dakika sürer. Kırmızı nokta merkezi içinde olduğunu ve slayt üstüne hiçbir parmak izi / izleri olup olmadığını kontrol edin. Her slayt için ilgili .tpf dosyasını yükleyin ve bir sonuç dosya adı ve konumu belirtin. Basın "Başlat Çalıştır". Program tamamlamak için yaklaşık 2 saat sürecektir.

Representative Results

Bir miRNA prob-bazlı analiz qPCR reaksiyonu için önerilen hacim 20 ul. NOT: 5 ul bir reaksiyon hacmi 20 ul hacim 4,7,30 kullanılarak elde edilenlere benzer sonuçlar elde etmek mümkün olduğunu doğrulamıştır. 5 ul reaksiyon hacmi düşürülmesi duyarlılığında önemli bir kayıp olmadan reaktif maliyetlerinde% 75'lik bir azalmaya da izin verir. Şekil 2'de de görüldüğü gibi, reaksiyon, 20 ul hacimler ve 5 ul kadar (0.92 r 2, p = 0.0002) ile 39 döngü kadar güçlü bir eş ilişki olduğunu göstermektedir.

Mikroflüidik dizisi, geleneksel 96 plaka PCR'ler kıyasla çoklu örnekleri analiz daha etkili bir yoldur, (Kart A ve B Kart için) yaklaşık 5 saat içinde bir numunede ifade 754 miRNA'lar verileri elde etmek için bir araç sağlar. <B Bland-Altman arsa (gösterir - Biz aynı örnek için miRNA Mikroakiskan dizi kartları karşılaştırıldığında (Örnek A ve A tekrarlama Numune) Şekil 3A.Güçlü> Şekil 3A), bu örnekler için test edilen bütün 754 miRNA'ların korelasyonu arsa (3B). Kartları (Kart A ve B) birden çok yerde hem rastgele yerleştirilmiş 3 farklı kontrol miRNA'ların (U6, RNU44 ve RNU48) vardır. U6 döngüsü eşiği (Ct) değerleri 2 koşular arasında karşılaştırıldığında, biz değerler (Tablo 4) arasında anlamlı farklılık gözlenmedi. Bu U6 değerlendirildi numunedeki fazla bolluk (alt Ct değeri) olarak ifade edilmektedir ki burada dikkat etmek de önemlidir. Daha sonra genel olarak katsayısı% 98 tayini (Şekil 3C-D) miRNA'ların içindeki ifade vardı çalışır (n = 150), hem de 0-19,99 arasında Ct değerleri, tüm miRNA'lar karşılaştırıldı. Betwee anlamlı fark miRNA'lar sayısı. - Her iki çalışır, 20 ve 29,99 arasında Ct değerlerine sahip 277 miRNA'lar, 16 Mirs özgün ve tekrar çalışır (F Şekil 3E) arasında anlamlı farklılıkCt değerleri, her iki çalışır (- H Şekil 3G) için 30-40 arasında seçildi zaman n çalışır (327 89) artmıştır.

NANO AKIŞKAN dizi platformu Şekil 4A'da gösterildiği gibi, test edilen her serum / plazma numunesinden 754 miRNA'ların için veri sağlar Bu amplifikasyon eğrileri incelemek için önemlidir -., tüm qPCR olduğu gibi - sonuç doğru amplifikasyon göstergesi olduğundan emin olmak için. 48 altdizilimlerden Her (Şekil 1) de üç en popüler "temizlik" ncRNAs için bir deneyi içerir:. U6, RNU44 ve RNU48 Şekil 4B U6 tipik bir kümelenme tek örnek çoğaltır göstermektedir. Bu çoğaltır düşük standart sapma (SD <0.5) görüntüler ve böylece güvenilirlik bir göstergesidir. Seçenek olarak ise, Şekil 4C, bir ikinci numunede U6 çoğaltır (SD> 0.5) daha fazla değişkenlik gösterir. Bu geçerlilik o ortadan kaldırmamaktadırKalan deneyleri f, her ne kadar daha kapsamlı bir eleştirisini gerektirecek yapar. U6, biyolojik sıvılarda en "temizlik" miRNA'lar gibi, bir değişken ifade olabilir. Bu Şekil 4C'de belirtilen örneklerin biri Şekil 4B'de sunulmaktadır daha az U6 içeriği 4 kat görüntüler dikkate alınmalıdır. 4C'de sunulan numunede U6 seviyesi bir panel 4B'de sunulmaktadır daha başlamak üzere% 75 daha az olduğu için, daha büyük bir teknik değişkenlik küçük reaksiyon hacmi 17 daha da ağırlaştırmaktadır transkript Poisson dağılımına bağlı olarak tahmin edilmektedir.

Çalışma tamamlandıktan sonra başka bir araçtır ihracat için kullanılabilir Kalite kontrol (QC) görüntüleri vardır. Bu bir seçim, her geçiş deliği doğru (Şekil 5) yüklenmiş olduğunu doğrulamak için ROX, qPCR reaktif karışımı bulunan pasif boya, flüoresansmı kullanır. Tr bir delik ya da gerçekten bir Lastik altdizilim, yetersiz numune hacmi, buharlaşma, 384-numune plaka tamamen Accufill sistemi ya da ipuçları içinde örnek plaka mühür, ya da kusurları kaldırmak için başarısızlık kuyulardan mevcut kabarcıklar nedeniyle yük değil. Delikler aracılığıyla-gerçekte tahlil yüklü hiç zaman, "saptanamaz" olarak etiketleme miRNA'lar önlemek için tespit edilmelidir Herhangi boşaltılır. Bu sorun, karşılaşılırsa örnek / master en az 5 ul 384 gözlü numune plakasının her oyuğuna yüklü olduğundan emin, Numune levhası, uygun bir şekilde, yükleme öncesinde santrifüjlenir, folyo conta tamamen uzaklaştırıldı, ve yüklenen OpenArray slayt mühürlü ve izleyen tüm koşular için ayrılan süre içinde çalıştırılır. Yükleme sorunları hala devam ediyorsa, bu daha büyük olasılıkla belirli bir toplu veya dizilerin çok veya ilgili sarf malzemeleri ve daha fazla yardım ilişkin olabilir üretici ile aranmalıdır.

"Src =" / files / ftp_upload / 52.586 / 52586fig1.jpg "/>
Şekil 1: NANO AKIŞKAN Dizi iş akışı için numunelerin Düzeni: (A) Her 384 numune plaka kadar 8 NANO AKIŞKAN diziler için örnekleri tutabilir. (B) ile seyreltildi, ön-yükseltilmiş cDNA komşu 8 oyuklu grupları Havuz A ve Havuz B, 8 oyuk (4 sıra 2 sütun) yerleştirilir. Her daire bir kuyu temsil eder. (Cı) bir numunesi, plakanın her bir NANO AKIŞKAN dizinin bir alt dizisinde yüklenecektir. Her küçük kare bir SubArray temsil eder.

Şekil 2,
Şekil 2: Geleneksel 96-PCR platformları için Co-ilişki analizi: 20 ul ve BT değerleri (39 döngü) standart 96-plaka platformunu kullanarak TaqMan Gerçek zamanlı qPCR üzerinde 5 ul reaksiyon birimler arasında eş ilişkisi. 4 Farklı microRNA göre (miR-375, 4 farklı insan serum ve plazma örneklerinin miR-30c, miR-30d ve miR-7). Diğerleri saptanamayan beri sadece 11 veri noktaları çizilir. R, 2 = 0.92, p = 0.0002.

Şekil 3,
. Şekil 3: (- B A) Mikroakiskan dizi kartlarını kullanarak miRNA profilleme Sirkülasyon 2 Mikroakiskan kartları (kart-A ve kart-B) kullanarak, 754 miRNA'lar bir profil oluşturulur. Burada gösterildiği gibi, biz 2 Mikroakiskan dizi için aynı örneği kullanılan Mikroakiskan kartı sonuçlarının tekrarlanabilirliği kontrol etmek çalışır. Bu 0-19,99 arasında Ct değerleri ile, genel olarak miRNA'ların benzer bir ifade, gözlenen (Cı - D). Tekrar çalışır arasında 20-29,99 ve önemli farklılıklar (F - E) arasında Ct değerleri ile birkaç miRNA'lar (277 16) vardır. 327 Seksen dokuzyüksek Ct değerleri ile mikroRNAlar (30-40) Her iki çalışır (- H G) arasında önemli farklılıklar sergiledi.   Veriler eşleştirilmiş T testi kullanılarak analiz edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: PCR Ürün Amplifikasyon Curves Temsilcisi Profili: Bir insan plazma numunesi için tüm miRNA hedefler kombine (A) amplifikasyon eğrileri temsili figür var. U6 için bir deney (ortak bir kontrol ncRNA) her alt dizisinde yerleştirilir. (B) örnek <(0.5 (C), yüksek standart sapma SD) gösterirken (0.5 düşük değişkenlik SD)> U6 çoğaltır içinde gösterir. Her iki numune de tota olaninsan plazmasından izole l RNA. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: NANO AKIŞKAN Diziler QC Analizi: Bir doğru yüklendiğinden NANO AKIŞKAN dizi (solda) ve bir yanlış yüklenmiş NANO AKIŞKAN dizi (sağda) Kalite kontrolü (QC) görüntüler. (qPCR reaktif karışımı mevcut) pasif boya, ROX, bir doğru yüklendiğinden yoluyla-delik göstermek için fluoresces. Sağdaki dizi geçiş delikleri qPCR reaktif karışımı ile yüklenmez ve bu yanlış negatif PCR reaksiyonları olarak tespit edilmelidir birkaç Altdizilim / vardır.

Bileşenler 5 ul reaksiyon başına Hacim (ul) RT tamponu (10x) 0.5
dNTP (100 mM) 0.05
RNaz inhibitör 0.6
Nükleazlar içermeyen su 1.39
Ters Transkriptaz 0.33
Toplam hacim 2.33

Tablo 1A: Standart bir 96-çukurlu plaka platformu kullanılarak TaqMan gerçek zamanlı qPCR için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri.

Bileşenler 5 ul reaksiyon başına Hacim (ul) 20 ul reaksiyon başına Hacim (ul)
Hızlı PCR masterkarışım (2x) 2.5 10
TaqMan qPCR tahlil (20x) * 0.25 1
Nükleazlar ücretsizsu 1.45 5.8
Toplam Hacim: 4.2 16.8

* Test, seçilen miRNA göre tahlil bileşeni.

Tablo 1B: Standart bir 96-çukurlu plaka platformu kullanılarak TaqMan gerçek zamanlı qPCR bir 5 ya da 20 ul qPCR Reaksiyon hazırlanmasında QPCR reaktif karışım bileşenleri.

Bileşenler Reaksiyon başına Hacim (ul)
Megaplex RT Astarlar (10x) 0,8
dTTP (100 mM) ile, dNTPler 0.2
Multiscribe Ters Transkriptaz (50 U / ul) 1.5
10X RT Tampon 0,8
MgCl2 (25 mM) 0.9
RNaz inhibitör & # 160; (20 U / ul) 0.1
Nükleazlar ücretsiz su 0.2
Toplam 4,5

Tablo 2A: TLDA MiRNA panel için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri.

Bileşenler Reaksiyon başına Hacim (ul)
TaqMan PreAmp master (2x) 12.5
Megaplex PreAmp Astarlar (10x) 2.5
Nükleazlar içermeyen su 7.5
Toplam 22.5

Tablo 2B: TLDA MiRNA panel için bir 25 ul önceden amplikasyon Reaksiyon hazırlanmasında PreAmp reaktif karışım bileşenleri.

"Cellspacing =" 0 "> Bileşenler Reaksiyon başına Hacim (ul) Megaplex RT Astarlar (10x) 0.75 dTTP (100 mM) ile, dNTPler 0.15 Multiscribe Ters Transkriptaz (50 U / ul) 1.5 10X RT Tampon 0.75 MgCl2 (25 mM) 0.9 RNaz inhibitör (20 U / ul) 0.09 Nükleazlar ücretsiz su 0.35 Toplam 4,5

Tablo 3A: sistemi tabanlı NANO AKIŞKAN MiRNA panel için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri.

Bileşens Reaksiyon başına Hacim (ul)
TaqMan PreAmp master (2x) 12.5
Megaplex PreAmp Astarlar (10x) 2.5
Nükleazlar içermeyen su 7.5
Toplam 22.5

Tablo 3B:. Prob-bazlı NANO AKIŞKAN miRNA paneli için bir 25 ul öncesi amplikasyon reaksiyon hazırlık PreAmp reaktif karışımı bileşenleri NOT: etkileşimli ek, üç platformlar için sağlanan excel tabloları zaten hata pipetle telafi etmek için% 5 ek hesaplar.

Numune A Bir tekrarı Örnek
15,535 16,156
15,471 15,652
15.623 16,063
15,963 15,889
14,006 13,993
14,502 14,623
14,907 14,384
13,732 14,946

Tablo 4: Mikroakiskan dizisi kartını kullanarak miRNA U6 profil Sirkülasyon. İki Mikroakiskan dizi kartları (A ve B) kullanma. Örnek A U6 kontrol miRNA Cı-değerleri (toplam = 8). Koşular arasında gözlenen Tutarlı U6 kontrolü miRNA bolluğu.

Discussion

doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek prob-temelli QPCR protokoller çerçevesinde kritik adımlar RT-ürünün aynı hacim ve konsantrasyon her qPCR reaksiyon yüklenen) emin 1 yapmak için vardır, 2) bileşenleri doğru oranları ve hacimleri için gerekli QPCR Reaksiyon hazırlandı ve de, 3) doğru ve tutarlı hacimleri qPCR reaksiyon eklenir karıştırılmış ve hala dikkatli ise 4) her bir numune ve reaksiyon, karışımın hazırlanması ve yüklenmesi, mümkün olduğu zaman, en kısa sürede tamamlanır edilir Yukarıdaki kritik adımlar daha önce belirtildiği.

Mikroakiskan dizi kartları uygun santrifüj ve özel kovalar gerekir. Her kova 3 kartları (yüklü / boş) kadar tutabilir. Her bir kova 3 slot işgal ve kepçe santrifüj karşı yuvasına benzer kova (bu kova da boş veya tam 3 kart, içermelidir) koyarak dengeli olduğundan emin olun. Kepçeli kartı yerleştirilirkent tutucu, 8 rezervuarlar yukarı proje ve reaksiyon kuyuları santrifüj dış duvar baktığından emin olun. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 331 x g'de kartları dönerler. İlk spin sonra, santrifüj açmak ve görsel reaksiyon karışımı 384 kuyudan dağıtılan olmuştur emin olun. 1 kez daha aynı ayarlarda sıkma tekrarlayın. Kova kartı çıkarın ve 8 rezervuarların her reaksiyon karışımı seviyesi muntazam olduğundan emin olun. Rezervuar sol sıvı hacminde herhangi bir tutarsızlık daha kullanmak için kart uygunsuz olun.

RT ürünün aynı konsantrasyona sahip olmak üzere, RNA aynı giriş konsantrasyonu, her bir RT reaksiyonu ilave edilir. Toplam RNA konsantrasyonu, bir mikro-volumespectrophotometer kullanılarak ölçülür. gözlenen 260/280 oranı, plazma / serum izole edilen RNA için 1.3 kadar düşük olabilir; mansap qPCR ilgili işlem veya veri 30 oluşturulan bu bir etkiye sahip görünmemektedir. Aynı şekilde, 260/280 oranıBurada test edilen RNA örnekleri gözlenen qPCR hiçbir anormal etkisi ile 1,3-1,7 arasında idi.

Bu tür Biofluids gelenler gibi düşük RNA içerik örnekleri kullanarak, bu işlemden önce RNA miktarını belirlemek için zor olabilir. Biz RNA izolasyonu sentetik başak-in kullanımı yanı sıra ters transkripsiyon aşamalarını öneririz. Bizim deneyim, Arabidopsis thaliana miRNA adayları (sporcudan-miR-159a ve sporcudan-miR-172a) bizim deneyim yüksek olabilir, (örneğin cel-miR-39 ya da cel-miR-54 gibi) Caenorhabditis elegans miRNA'lar tercih edilir A. daha benzerlik thaliana. Böyle sahne özgü başak-in kullanımı, farklı zamanlarda tahlil birden numuneler arasında miRNA veri normalleşmesi için hesap edebilirsiniz. CDNA sentez reaksiyonu için RNA sabit giriş hacmi kullanılması da 32,33 tavsiye edilir.

miRNA ölçümü için üç prob-tabanlı protokoller burada anlatılan değişen miktarlarda ihtiyaçToplam RNA girişi, farklı iş akışları ve maliyetleri. Iş akışlarının her biri MiRNA hedeflerin sayısının ve analiz edilecek numune sayısına göre farklı bir verim sağlamak için tasarlanmıştır. Artan verim (384 rxn 3072 rxn 96 rxn) ile birlikte, reaksiyon başına maliyeti, zamanda bir birim elde edilen veri miktarı bir artması ile azalmaktadır. Bu platformların her TaqMan kimyası kullanmak için, elde edilen verilerin kalitesi benzer olması beklenebilir. TaqMan qPCR serum / plazma örneklerinde 9,11,27 yılında miRNA'lar bolluğu tanımlamak için köklü bir yöntemdir. Burada ele alınan üç platform aynı kimya paylaşmalarına rağmen reaksiyon hacminde bir azalma transkript tespit dinamik aralığı içinde bir azalma (Farr, RJ ve diğ., Yayınlanmamış veriler), yol açar. 96-kuyu qPCR platformu düşük verim, ancak yüksek hassasiyet platformudur ve bizim görünümünde, tüm prob-tabanlı (ya bazlı boya) PCR platformları için "altın standart". Bununla birlikte, bu zararNumunelerin birkaç yüz veya binlerce tahlil ve birden microRNA için ediliyorsa en ekonomik ya da verimli bir platform değildir. Mikroakiskan (TLDA) ve NANO AKIŞKAN (OA) platformlar kısa sürede büyük veri alma sağlamak için tasarlanmış yüksek verimli / içerik platformları vardır. Toplu farklılıklar TLDA kartları gözlenmiştir, ancak bu aynı partiden TLDA kartı talep ile en aza indirilebilir. Düşük bolluk miRNA'lar TLDA kartları farklı gruplar aynı örneği kullanarak test edildiğinde - Biz TLDA platformu (Şekil 3) orta% 17'sinde belirgin farklılıklar gösterdiğini görüyoruz. Bu nedenle TLDA kartlarını kullanarak analiz için aynı parti numaralarını kullanarak öneririz. Bu değişim aynı zamanda olası yükleme ve pipetleme hataları da dahil olmak üzere teknik değişkenlik nedeniyle olabilir. Ancak, biz TLDA kartları aynı toplu talebinde / önerisi. Önemli bir parti değişimi OA platformunda gözlenmiştir. Buna rağmen, TaqMan experimen tabanlıtal qPCR plazma / serum örneklerinde miRNA'lar bolluğu ölçmek için teklif kolaylığı yaklaşır. Burada tartışılan, düşük, orta ve yüksek kapasiteli yaklaşımları son derece verimli, tekrarlanabilir ve temiz (düşük arka plan gürültü) kimya kullanılarak numunelerin ve miRNA'ların bir dizi analiz esneklik sunuyor.

Disclosures

Madde işleme / yayın masrafları yayın için bu yazının kabul edilmesini müteakip, Life Technologies tarafından karşılanmıştır.

Acknowledgments

Tüm yazarlar NHMRC CTC, Sydney, Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (JDRF), Avustralya Üniversitesi ve Rebecca Cooper Vakfı, Avustralya altyapı desteği kabul. Bu araştırma WW, RJF Aah Avustralya Araştırma Konseyi (FT110100254) ve JDRF, Avustralya (CRN201314) hibe yoluyla finanse edildi ve MVJ tüm ıslak laboratuvar deney yürütülen, ASJ veri analizi gerçekleştirmiştir. WW ilk taslağını yazdı. AAH çalışma planlanmış ve verileri analiz. Tüm yazarlar okuma ve yayımlanmak üzere gönderilen el yazması, rakamlar ve çalışma nihai sürümü üzerinde anlaştılar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well-platform
For Reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays INV SM  Applied Biosystems
 
4427975 https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
 
4366597 or 4366596 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.
For qPCR run on a 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG  Applied Biosystems
 
4367846 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on  the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml  Applied Biosystems 4346907 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399966 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 
4444281 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
OR OR
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 Applied Biosystems
 
4444750 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
For Pre-amplification
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems
 
4391128 or 4488593 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0  Applied Biosystems
 
4444303 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399233 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml) Invitrogen 12090-015 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0  Applied Biosystems 4444913 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
For Pre-amplification
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)
To load and run the slides
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) Applied Biosystems
 
4470187 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit  Applied Biosystems
 
4469576 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384-well Sample Plates   Applied Biosystems
 
4406947 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix Applied Biosystems
 
4462159 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
OpenArray AccuFill System Tips  Applied Biosystems
 
4457246 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
Others
Nuclease-Free Water Qiagen 129117 http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24 (2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89 (2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148 (2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292 (2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. e50294 (2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167 (2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).
Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).More

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter