Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.
Bir doğru ve tekrarlanabilir bir analiz sağlayan en hassas algılama yöntemlerinin biri olduğu sistemi tabanlı bir kantitatif PCR (qPCR), kopya çokluğunu ölçmek için tercih edilen bir yöntemdir. Probe-tabanlı kimya diğer (boya-tabanlı) kimyaları ile karşılaştırıldığında en az arka plan floresan sunuyor. Halen, transkript bolluğu ölçmek için kullanan prob-tabanlı kimya kullanılabilir çeşitli platformlar vardır. 96 oyuklu bir plaka içerisinde QPCR ancak 96 numune veya miRNA'ların sadece maksimum tek bir çalışma olarak test edilebilir en rutin olarak kullanılan bir yöntemdir. Numunelerin büyük bir sayı / miRNA'ların analiz edilecek ise, bu, zaman alan ve sıkıcı bir iştir. Örneğin, mikroflüidik (örneğin TaqMan® Dizi Card) NANO AKIŞKAN diziler (örneğin, OpenArray) teklif kolaylığı gibi yüksek verimli tarama sistemi tabanlı platformların yeniden üretilebilir ve etkili bir şekilde kısa bir süre içinde numune çok sayıda çok sayıda mikroRNA bolluk tespit etmek. Burada, deneysel kurulum a göstermeknd hacmi artan düzeyi sunan sistemi tabanlı kimya ve üç değişik platformlar (96 boşluklu plaka, mikroflüidik ve NANO AKIŞKAN dizileri) kullanılarak, serum ya da plazma örnekleri EDTA gelen MiRNA nicelendirilmesi için protokol.
MikroRNA'lar (miRNA'ların) gen ifadesinin 1-3 düzenleyicileri olarak işlev, ~ 22 nükleotid kodlayıcı olmayan (NC) RNA bulunmaktadır. Hayvanlarda çoğu miRNA'ların gen ifadesinin 2-4 negatif regülasyonuna yol açar 3 'UTR, hedef, bir mRNA ile sekansa özel baz eşleştirme yoluyla işlev görür. Bu, genellikle, mRNA dönüşümünün bir engellenmesi ile veya ribozomal açılan kapalı gerçekleşir. Dolaşımdaki miRNA'ların diyabet 5-7, yumurtalık 8, prostat 9 ve meme kanseri 10,11, hepatit B 12 ve diğer otoimmün hastalıklar 13 gibi hastalıkların, çeşitli araştırma ve klinik alanlarında yeni biyomarkerler olduğu gösterilmiştir. Araştırma daha erişilebilir ve 9,11-15 daha az invaziv insan plazma ve serum örneklerinden, dolaşımı gibi, farklı hücrelerde veya dokularda bol miRNA'lar tespit için yapılmıştır.
MiRNA miktar Farklı yöntemler, e olmuşturBu tür standart 96-plaka platformu 4,12,16-18, Mikroakiskan kartı platformu 12,18-23 ve NANO AKIŞKAN dizisi platformu 17,24 gibi birden çok platform kullanarak stablished. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) çoklu (dye- veya prob-bazlı) kimyaları kullanarak transkript göreceli veya mutlak sayıları ölçmek için yeteneği sunar. Probe-tabanlı gerçek zamanlı PCR kimya, tek bir transkript kopya tespit etmek için düşük eşiğe ve yüksek hassasiyet yarar vardır. Nispeten miktarının ve miRNA ifade 25 belirlemek için ona bir tercih yöntemi yaparak, etkin kullanımı basit ve son derece tekrarlanabilir mal edilir. Transkripsiyon (RT) ve qPCR 4,26,27 ters: Probe-tabanlı qPCR yöntemi genellikle iki adımdan oluşur. Sap-halka RT primer olgun veya birincil MiRNA molekülüne hibridize tamamlayıcı (c) DNA haline dönüştürülür burada RT. CDNA ürününün miktarının belirlenmesi sonra MiRNA özgü PCR primerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir26-28. sistemi tabanlı qPCR prensibi floresan-etiketli prob hidrolizini içerir, gerçek zamanlı olarak tamamlayıcı şerit uzantısı, tespitine dayanmaktadır. Bu sondalar, bir flüoresan raportör ve FRET (flüoresan rezonans enerji transferi) izin vermek için sadece ayrı olan bir söndürücü içerecek şekilde dizayn edilmiştir. Floresan muhabiri (verici) den emisyon Algılama söndürücü molekülünün yakınlığı ile maskelenir. Taq polimeraz (POL) ve yukarı akan primerde uzanır ve bir çatal (probun 5 'ucu) ulaştığında, Taq pol ekzonükleaz aktivitesi söndürücü floresan damlatıcının fiziksel ayrılma / ayrılmasına yol açan sonda hidrolize eder. Floresan vericisi tek bir molekülün Bu sürüm, detektör tarafından kaydedilir ve çok iyi / reaksiyonundan flüoresan sinyalinde bir artış kademesi olarak sunulmuştur. Floresanstaki artış doğru qu izin üretilen PCR ürününün miktarı ile orantılıdıramplifiye edilmiş hedef 26,28 arasında antification.
MiRNA miktarının artan talep ile birlikte, yüksek hacimli teknolojilere ortam numunelerinin daha fazla sayıda kısa bir miktarda işleme izin vermek için geliştirilmiştir. TaqMan Düşük Yoğunlukta Dizi (TLDA) bir plaka üzerinde analiz miRNA'ların sayısında bir artış sağlar sistemi tabanlı qPCR kimyasına dayanan bir orta akış yenilikçi mikroakışkan tasarımdır. TLDA cDNA'yı sentezlemek için kullanılan RT-primerler, önceden tanımlanmış bir havuz kullanılmasını içerir. Sonra, bu cDNA'lar qPCR 22,26,29 kullanarak birden fazla miRN'nın ekspresyonunu belirlemek için özelleştirilmiş bir 384 gözlü mikro-akışkan kart içine döndürülmektedir. Kartın her çukuru, bu nedenle tek bir TLDA kartı 26 içinde işlenebilir 384 reaksiyonlara, spesifik miRNA (ler) çoğaltmak için primerler ve problar, kurutuldu içerir.
NANO AKIŞKAN dizi gen transkriptlerinin saptanması için kullanılan yüksek verimli bir platformdur <sup> 24 ile aynı prob bazlı kimyası kullanılarak. Bu geçiş delikleri paslanmaz çelik slayt 24 3072 bir diziye 33 nanoliter reaksiyon karışımının kolay yüklemeyi kolaylaştırmak için hidrofobik-hidrofilik etkileşimler sunan özel bir matris kullanır. Bu makalede, serum / plazma içinde miRNA'lar ölçülmesi için bu yöntemler uygulandı ve performans ve bu verileri yorumlarken dikkat edilmesi gereken kritik faktörler nasıl gösteren odaklanır. Hesaba alındığında, bireysel fayda ve sınırlamalar, bu makalede ele alınacak.
doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek prob-temelli QPCR protokoller çerçevesinde kritik adımlar RT-ürünün aynı hacim ve konsantrasyon her qPCR reaksiyon yüklenen) emin 1 yapmak için vardır, 2) bileşenleri doğru oranları ve hacimleri için gerekli QPCR Reaksiyon hazırlandı ve de, 3) doğru ve tutarlı hacimleri qPCR reaksiyon eklenir karıştırılmış ve hala dikkatli ise 4) her bir numune ve reaksiyon, karışımın hazırlanması ve yüklenmesi, mümkün olduğu zaman, en kısa sürede tamamlanır edilir Yukarıdaki kritik adımlar daha önce belirtildiği.
Mikroakiskan dizi kartları uygun santrifüj ve özel kovalar gerekir. Her kova 3 kartları (yüklü / boş) kadar tutabilir. Her bir kova 3 slot işgal ve kepçe santrifüj karşı yuvasına benzer kova (bu kova da boş veya tam 3 kart, içermelidir) koyarak dengeli olduğundan emin olun. Kepçeli kartı yerleştirilirkent tutucu, 8 rezervuarlar yukarı proje ve reaksiyon kuyuları santrifüj dış duvar baktığından emin olun. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 331 x g'de kartları dönerler. İlk spin sonra, santrifüj açmak ve görsel reaksiyon karışımı 384 kuyudan dağıtılan olmuştur emin olun. 1 kez daha aynı ayarlarda sıkma tekrarlayın. Kova kartı çıkarın ve 8 rezervuarların her reaksiyon karışımı seviyesi muntazam olduğundan emin olun. Rezervuar sol sıvı hacminde herhangi bir tutarsızlık daha kullanmak için kart uygunsuz olun.
RT ürünün aynı konsantrasyona sahip olmak üzere, RNA aynı giriş konsantrasyonu, her bir RT reaksiyonu ilave edilir. Toplam RNA konsantrasyonu, bir mikro-volumespectrophotometer kullanılarak ölçülür. gözlenen 260/280 oranı, plazma / serum izole edilen RNA için 1.3 kadar düşük olabilir; mansap qPCR ilgili işlem veya veri 30 oluşturulan bu bir etkiye sahip görünmemektedir. Aynı şekilde, 260/280 oranıBurada test edilen RNA örnekleri gözlenen qPCR hiçbir anormal etkisi ile 1,3-1,7 arasında idi.
Bu tür Biofluids gelenler gibi düşük RNA içerik örnekleri kullanarak, bu işlemden önce RNA miktarını belirlemek için zor olabilir. Biz RNA izolasyonu sentetik başak-in kullanımı yanı sıra ters transkripsiyon aşamalarını öneririz. Bizim deneyim, Arabidopsis thaliana miRNA adayları (sporcudan-miR-159a ve sporcudan-miR-172a) bizim deneyim yüksek olabilir, (örneğin cel-miR-39 ya da cel-miR-54 gibi) Caenorhabditis elegans miRNA'lar tercih edilir A. daha benzerlik thaliana. Böyle sahne özgü başak-in kullanımı, farklı zamanlarda tahlil birden numuneler arasında miRNA veri normalleşmesi için hesap edebilirsiniz. CDNA sentez reaksiyonu için RNA sabit giriş hacmi kullanılması da 32,33 tavsiye edilir.
miRNA ölçümü için üç prob-tabanlı protokoller burada anlatılan değişen miktarlarda ihtiyaçToplam RNA girişi, farklı iş akışları ve maliyetleri. Iş akışlarının her biri MiRNA hedeflerin sayısının ve analiz edilecek numune sayısına göre farklı bir verim sağlamak için tasarlanmıştır. Artan verim (384 rxn 3072 rxn 96 rxn) ile birlikte, reaksiyon başına maliyeti, zamanda bir birim elde edilen veri miktarı bir artması ile azalmaktadır. Bu platformların her TaqMan kimyası kullanmak için, elde edilen verilerin kalitesi benzer olması beklenebilir. TaqMan qPCR serum / plazma örneklerinde 9,11,27 yılında miRNA'lar bolluğu tanımlamak için köklü bir yöntemdir. Burada ele alınan üç platform aynı kimya paylaşmalarına rağmen reaksiyon hacminde bir azalma transkript tespit dinamik aralığı içinde bir azalma (Farr, RJ ve diğ., Yayınlanmamış veriler), yol açar. 96-kuyu qPCR platformu düşük verim, ancak yüksek hassasiyet platformudur ve bizim görünümünde, tüm prob-tabanlı (ya bazlı boya) PCR platformları için "altın standart". Bununla birlikte, bu zararNumunelerin birkaç yüz veya binlerce tahlil ve birden microRNA için ediliyorsa en ekonomik ya da verimli bir platform değildir. Mikroakiskan (TLDA) ve NANO AKIŞKAN (OA) platformlar kısa sürede büyük veri alma sağlamak için tasarlanmış yüksek verimli / içerik platformları vardır. Toplu farklılıklar TLDA kartları gözlenmiştir, ancak bu aynı partiden TLDA kartı talep ile en aza indirilebilir. Düşük bolluk miRNA'lar TLDA kartları farklı gruplar aynı örneği kullanarak test edildiğinde – Biz TLDA platformu (Şekil 3) orta% 17'sinde belirgin farklılıklar gösterdiğini görüyoruz. Bu nedenle TLDA kartlarını kullanarak analiz için aynı parti numaralarını kullanarak öneririz. Bu değişim aynı zamanda olası yükleme ve pipetleme hataları da dahil olmak üzere teknik değişkenlik nedeniyle olabilir. Ancak, biz TLDA kartları aynı toplu talebinde / önerisi. Önemli bir parti değişimi OA platformunda gözlenmiştir. Buna rağmen, TaqMan experimen tabanlıtal qPCR plazma / serum örneklerinde miRNA'lar bolluğu ölçmek için teklif kolaylığı yaklaşır. Burada tartışılan, düşük, orta ve yüksek kapasiteli yaklaşımları son derece verimli, tekrarlanabilir ve temiz (düşük arka plan gürültü) kimya kullanılarak numunelerin ve miRNA'ların bir dizi analiz esneklik sunuyor.
The authors have nothing to disclose.
Tüm yazarlar NHMRC CTC, Sydney, Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (JDRF), Avustralya Üniversitesi ve Rebecca Cooper Vakfı, Avustralya altyapı desteği kabul. Bu araştırma WW, RJF Aah Avustralya Araştırma Konseyi (FT110100254) ve JDRF, Avustralya (CRN201314) hibe yoluyla finanse edildi ve MVJ tüm ıslak laboratuvar deney yürütülen, ASJ veri analizi gerçekleştirmiştir. WW ilk taslağını yazdı. AAH çalışma planlanmış ve verileri analiz. Tüm yazarlar okuma ve yayımlanmak üzere gönderilen el yazması, rakamlar ve çalışma nihai sürümü üzerinde anlaştılar.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |