A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.
Cellfria system ger en flexibel plattform för att sondera särskilda nätverk av biologiska reaktioner som isolerats från komplexet resursdelning (t.ex. globalt genuttryck, celldelning) påträffas i levande celler. Men sådana system, som används i konventionella makroskala bulk reaktorer, ofta misslyckas med att ställa ut de dynamiska beteenden och effektivitetsvinster som är karakteristiska för sina levande mikroskala motsvarigheter. Förstå effekterna av interna cellstruktur och skalan på reaktionsdynamik är avgörande för att förstå komplexa gennätverk. Här rapporterar vi en mikro enhet som begränsar cellfria reaktioner i cellulära skala volymer samtidigt flexibel karakterisering av den bifogade molekylära systemet. Denna flerskiktade poly (dimetylsiloxan) (PDMS) enheten innehåller femtoliter skala reaktionskamrar på en elastomermembran som kan påverkas (öppen och sluten). Vid påverkan kamrarna begränsa cellfri proteinsyntes (CFPS) reaktioneruttrycker ett fluorescerande protein, vilket möjliggör visualisering av reaktionskinetik över tid med hjälp av tidsförlopp fluorescensmikroskopi. Här kan vi visa hur denna anordning kan användas för att mäta brusstruktur CFPS reaktioner på ett sätt som är direkt analoga med de som används för att karakterisera cellulära system, vilket möjliggör användningen av bullerbiologiska tekniker som används i cellulära system för att karaktärisera CFPS gen kretsar och deras interaktioner med cellfria miljö.
Cellfria system erbjuder en förenklad och flexibel plattform för visning biologiska reaktioner fria från komplicerande faktorer såsom kondition, division, och mutation som är oundvikliga i studiet av levande celler. Sådana metoder har använts för att studera cellulära system inklusive karakterisering av membranproteiner en, den sondering av proteininteraktioner 2, och utforskandet av grundläggande aspekter av översättnings 3-7. Nyligen cellfria system har börjat få fotfäste som livskraftiga plattformar för syntetisk biologi 8-10. Överklagandet av sådana metoder är att de fria syntetisk biologi från resursdelning och "yttre brus" som påverkar reaktionsdynamik i levande celler. Men frågorna kvarstår om hur den fysiska miljön där cellfria reaktioner är inbäddade påverkar progression och resultatet av reaktionen. Cellfria reaktionsmiljöer – särskilt begränsad miljöäldrar som närmar cell relevanta volymer – förblir dåligt karaktäriseras. Cellfritt proteinsyntes (CFPS) är konventionellt tanken på att vara "skalfria," uppvisar likvärdiga kinetik i en rad mikroliter till liter skala reaktionsvolym 11. Ändå har begränsande reaktioner på cellulära skala volymer visats signifikant påverka proteinuttryckshastigheter 12.
Den stokastiska natur cellfria reaktioner – särskilt som dessa systemtänkande eller ens gå under femtoliter volymer – kan vara av särskild betydelse. Buller i genuttryck är en egenskap starkt präglat av instängdhet som små cellvolymer och höga tätheter av komponenter tvingar många av de viktiga molekyler till mycket låga befolkningsnivåer – till exempel Escherichia coli gränserna inom en 1 fl volym så många som 4.300 olika polypeptider enligt den inducerbara kontroll över flera hundra olika promotorer 13. Denna egenbullret har varit inblandad som en central drivkraft i många biologiska processer inklusive kemotaxi 14, HIV beslut mellan aktiv replikering och latens 15, beslutet om λ fag mellan lys och lysogeni 16,17, och beslutet Bacillus subtillus mellan kompetens och sporulering 17. Cellfritt syntetisk biologi ger då både en möjlighet att utforska de stokastiska egenskaper cellulära gen kretsar och nätverk, och manipulera dessa beteenden för att uppnå specifika tekniska mål. Medan buller beteende cellulära system har väl studerade 18-27, har det funnits lite utforskning av den grundläggande brus beteende cellfria system 8, särskilt vid den cellulära skalan.
Här presenterar vi en plattform för studier av stokastiska effekter i cellfritt syntetisk biologi. Denna mikrofabricerad plattform innehåller femtoliter skala reaktions cHambers vilka kan snabbt övergått mellan öppna (fri diffusion in och ut ur kammaren) och stängda (reaktanter tillstängda inuti kammaren) stater. I det stängda tillståndet, vi begränsar cellfri protein Syntes (CFPS) reaktanter som uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP), och följa genuttryck med time-lapse fluorescensmikroskopi 28 (figur 1). Vi karakteriserar denna cellfri miljö genom att mäta strukturen hos de stokastiska variationer i genuttryck på ett sätt direkt analogt med de som används för att karakterisera celler 25. Icke-mikrofabrikationsmetoder för innestängcellfria reaktioner innefattar vesiklar och liposomer 29-32, vatten-i-olja-emulsioner 12 och porösa medier 33. Men även om dessa metoder kan ge kontroll över storleksfördelningen av de trånga volymerna 34, mikrofabrikationsmetoder skapa mycket reproducerbara funktioner med tätt angivna mått, även på nanonivå.Dessutom kan dessa stela strukturer lätt spåras över tid utan att vara känslig för avdunstning eller förändringar i den yttre miljön. Mikrofabricerad container designer som används i tidigare arbete 8,35 kan inte snabbt täta reaktionskammare följande reaktion initiering, komplicerar tydligt uppdrag av tiden när reaktionen initierades (tiden noll). Med användning av metoden som presenteras här, behövs endast 4-5 min mellan initiering och visualisering av reaktionen på enheten, varigenom en väl definierad "tiden noll". Följande protokoll beskriver metoder för att tillverka och testa den här enheten, inklusive optisk litografi, enhet montering, enhet testning och metoder för bildanalys.
Genuttryck i celler är till sin natur bullriga på grund av små cellulära volymer och låga kopieantal av viktiga reaktanter. Buller biologi fokuserar ofta på de källor, bearbetning och biologiska konsekvenser av fluktuationer i populationer, koncentrationer, positioner, eller tillstånd av molekyler som styr gen kretsar och nätverk 44. Den stora majoriteten av detta arbete har utförts i cellulära system, som har fördelen av att titta bullret av en gen krets inom naturliga ramen för de genetiska nätverk inom cellen. Men cellfria system gör det möjligt att karakterisera inneboende fluktuationer i en individuell gen krets utan störande yttre effekter 18 som inte kan undvikas i cellulära system. Analys av buller kan erbjuda viktiga fysikaliska insikter i hur genetiska kretsar är uppbyggda och hur de fungerar, och har använts i cellulära system för att karaktärisera negativ 25 och positiv <sup> 27 auto, yttre och inre bidrag till uttrycksljud 18, och transkription spricker 45,46. Här beskriver vi studiet av ett cellfritt expressionssystem i mikrofluidikanordningar som möjliggör samtidig styrning av reaktorstorlek och reaktions initiering tider, för att bättre förstå de roller som instängdhet och trängsel 47,48 har på inneboende proteinuttryck buller utan komplikationer associerade med levande celler.
Nyckeln möjliggör inslag av designen är integreringen av matriser av femtoliter-volym (micron skala) reaktionskammare som används för att begränsa reaktanterna i ett cellfritt proteinuttryckssystem, med en elastisk "reglerventil" membran i PDMS som fångar den reaktanter vid en väldefinierad, "tiden noll" för reaktion initiering (Figur 1). Denna kontroll tillåter kinetiken för de reaktioner som ingår i proteinsyntes som skall follskyldig i realtid med hög precision. Som sådan, är det viktigt att hantera cellfria reaktanter så att inter-experimentella variabiliteten minimeras så mycket som möjligt. Denna kontroll tillåter oss att utvärdera brusstruktur av cellfria genetiska kretsar på ett sätt som är analogt med tekniker som tidigare använts för att utvärdera genuttryck i levande celler.
Såsom reaktanter som användes i CFPS system kan vara känsliga för frysnings-upptiningscykler, är det viktigt att hålla reaktanterna kalla och minimerar den tid reaktanterna spenderar upptining på is. Det är en god vana att regelbundet testa uttrycket av CFPS systemet i bulk för att identifiera förändringar i expressionsnivåer över tiden – detta kan göras på ett 10-15 ^ il reaktion i ett Eppendorf-rör, eller i en anordning som en mikroplattläsare , som utför multipla läser över tiden för att fånga reaktionskinetik. Noterar ålder och upptiningstider reaktanterna för varje experiment kommer att hjälpa när du felsöker lågt uttryck levels. Vidare, vid montering CFPS reagens, är det viktigt att notera att reaktionen börjar när den är helt monterad och avlägsnas från isen. För att upprätthålla en konsekvent "tid noll", är det till hjälp att registrera den tid efter initieringen av CFPS reaktionen efter den slutliga tillsatsen av DNA-ingång, och att tillämpa reaktionen så snabbt som möjligt till den inkuberade enheten. Denna process bör ta ca 4-5 min, och fluorescens bör inte vara synlig inom reaktionskammare. Denna styrning säkerställer att den tillgängliga tiden för att visualisera tillväxt delen av reaktionskurvan är maximerad.
Innan du kör CFPS reaktioner på enheten, är det lämpligt att köra kvalitetskontroller för att kontrollera att det inte finns något läckage från kamrarna. En FRAP test kan utföras (som i figur 2D) genom att tillämpa en fluorofor till enheten och utsätta en enskild väl tills brunnen är helt blekt. Om kamrarna ärväl tillslutna, ingen återhämtning ska vara synlig inne i väl – det bör finnas en skarp kontrast mellan väggarna i facket och de inre och yttre utrymmen. Om fluorescens återhämtning är uppenbar eller väggar reaktionskammaren är inte väl definierade, bör trycket på styrventilen ökas eller enheten bör kontrolleras för läckage eller delaminering från glasskiva.
Detta protokoll har testats med CFPS reagenser från en kommersiell E. coli cellfri proteinexpressionskit (skalas till 25 | il), även om andra robusta CFPS system kan användas. Det är möjligt att använda volymerna mycket lägre än 25 l vid tillämpningen reaktioner på enheten, vilket kan vara till hjälp när reagens kostnaden är en begränsande faktor i experiment. När reaktanter läggs till enheten och reaktionskamrarna är förseglade, är det inte möjligt att lägga reaktanter till lösningen utan de-aktivering av styrventilen – alltså den här enheten är inte suitable för reaktioner som kräver tillsats av reagens under reaktionsförloppet. Denna enhet är också inte optimerade för att observera CFPS reaktioner som kan köras längre än 3 h – effekterna av uttorkning och torkning av enheten efter denna tidsperiod har inte utvärderats. Om längre reaktionstider önskas, kan dessa effekter mildras genom att täta anordningen för att förhindra avdunstning, ändra inkubationstemperaturen, eller genom användning av en fuktkammare. Ändringar av enhetens utformning, såsom nanoporösa strukturer i kammarväggarna 49,50 eller införandet av ett poröst membran skikt, representerar några metoder som kan ge reagens utbyte och därmed förlänga reaktionstidsramar.
Mikrofabricerad reaktions fack jämn volym är värdefulla för att upprätthålla konsekventa dimensioner över experiment och mycket lämplig för utredning "sidoreaktioner" med fackväggarna. Till skillnad från metoder som använder ingenn-mikroteknik, dessa reaktioner måste utvärderas i litet antal, och ger inte dimensionell flexibilitet under experimenten. Emellertid är den styrbara designen för dessa reaktionskamrar mycket lämplig för tidsförlopp mikroskopi, och kan vara en lysande komplement till en hög genomströmning metod för inneslutning.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
23 ga needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
#0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
100x oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
sharp 23 ga needles | Precision Glide | 305129 | |
Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
S30 E coli protein expression system | Promega | L1110 | |
Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Alexafluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.46r | |
Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |