Utveckling av en kvantitativ Recombinase polymeras amplifieringsanalysen med en intern positiv kontroll
Summary
Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
Abstract
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Introduction
Kvantitativ nukleinsyraamplifiering är en viktig teknik för detektering av miljö-, livsmedelsburna och vattenburna patogener samt för klinisk diagnostik. Realtids kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) är den gyllene standarden metod för känslig, specifik och kvantitativ detektion av nukleinsyror, t.ex. för HIV-1 virusmängd tester, upptäckt av bakteriella patogener, och screening för många andra organismer en – 3. Under realtids qPCR, primrar amplifierar patogent DNA i cykler, och en fluorescerande signal alstras som är proportionell mot mängden av amplifierad DNA i provet vid varje cykel. Ett prov innehållande en okänd koncentration av patogent DNA kan kvantifieras med användning av en standardkurva som relaterar den initiala DNA-koncentrationen av standardprover och den tid vid vilken den fluorescerande signalen når ett visst tröskelvärde (dvs tröskelcykeln, eller C-T).
<p class="Jove_content"> Eftersom realtid qPCR kräver dyrbar termisk cykling utrustning och flera timmar att ta emot resultat, alternativa isotermiska amplifieringstekniker, såsom rekombinas polymeras amplifiering (RPA), har utvecklats 4. Dessa plattformar ger i allmänhet resultat snabbare och amplifiera nukleinsyror på en lägre, enda temperatur, vilket kan åstadkommas med billigare, enklare utrustning. RPA, vilket är särskilt attraktiv för point-of-care-program, förstärker DNA i minuter, kräver en låg förstärkning temperatur (37 ° C), och förblir aktiv i närvaro av föroreningar 5,6. RPA-analyser har utvecklats för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive livsmedelsanalys, detektion av patogener, cancer drug screening och upptäckt av biothreat agenter 7-12. Emellertid har användningen av RPA för kvantifiering av nukleinsyror begränsats 13,14.I tidigare arbete, var det shown som i realtid kvantitativ RPA (qRPA) är genomförbart 15. Här är en mer detaljerad protokoll som avses med realtids kvantitativ RPA att kvantifiera okända prover med en standardkurva, en metod som är analog med kvantifiering med hjälp qPCR. Detta protokoll beskriver hur du utför en RPA reaktion på en värmecykeln för att upptäcka HIV-1-DNA som ett proof-of-concept, samt hur man kan utveckla en intern positiv kontroll (IPC) för att säkerställa att systemet fungerar korrekt. Datainsamling med hjälp av en värmecykeln eller mikroskop och dataanalys för att konstruera en standardkurva med träningsdata också beskrivet. Slutligen metod för kvantifiering okända prover med standardkurvan med en anpassad manus demonstreras. Denna qRPA metod möjliggör kvantifiering av prover med okända koncentrationer och har många fördelar jämfört med traditionell realtid qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att få en ändamålsenlig kvantifiering data med hjälp av MATLAB-algoritmen måste användaren välja lämpliga ingångsvärden vid uppmaning. Efter initiering varje manus i avsnitten 5 och 6, är alla ingångsvariabler automatiskt önskade i kommandofönstret och utgångar genereras automatiskt. I avsnitt 5.7 användaren uppmanas att välja en sluttning tröskel. Värdet på tröskeln lutning påverkar kvadraten på korrelationskoefficienten (r 2) i passform. Vid användning av rå fluorescens data so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har finansierats av ett anslag från Bill & Melinda Gates Foundation genom stora utmaningarna i Global Health Initiative.
Materials
| qRPA Assay | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Software | Vendor | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
References
- Yoon, J. -. Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
- Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
- Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a., Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
- Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99 (2014).
- Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
- Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082 (2012).
- Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
- Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
- Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642 (2013).
- Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730 (2014).
- Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15 (2010).
- Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
- Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
- Sollis, K. a., et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869 (2014).
- . . Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , 1-166 (2011).
