Introduction
Studie van Drosophila melanogaster heeft grote inzichten in de genetische regulatie van diverse verschijnselen. Met name is er uitgebreid onderzoek ei ontwikkeling, omdat oögenese biedt handelbaar manier om veel verschillende ontwikkelingsprocessen, waaronder weefsel patronen, cel polariteit, celcyclus schakelen en translationele regulering 1,2,3,4 onderzoeken. Een belangrijke morfogene gebeurtenis tijdens oögenese is de specificatie verwerving van motiliteit en migratie van een set cellen genaamd grens cellen (beoordeeld in 5). Aangezien celmigratie is een belangrijk kenmerk van dierlijke morfogenese en omdat de genetische regulatie van dit proces is goed geconserveerd mechanismen vastgesteld vliegen waarschijnlijk belangrijk in andere contexten zijn. Zo onderzoeken we de moleculaire controle van de grens cel migratie. Voor onze studies hebben we een nieuwe methode om de voorste polen ontwikkelen eieren observeren ontwikkeldwaar de grens cellen ontstaan, te onderzoeken hoe ze zich ontwikkelen in detail.
In de eierstok, ei kamers in verschillende ontwikkelingsstadia bestaan langs ketens genaamd ovarioles, die zijn ingekapseld in een dunne omhulling (Figuur 1A). Elk ei kamer zal gaan om een ei te vormen. Tijdens oögenese, moet een aantal verschillende celtypen te ontwikkelen op een gecoördineerde manier. De D. melanogaster ei kamer bestaat uit 16 kiembaan cellen, waaronder één eicel, omgeven door een single-layer folliculair epitheel 6. Een klein aantal gespecialiseerde cellen, genaamd poolcellen, ontstaat op de voorste en achterste polen van het epitheel. De 6-8 grens cellen ontstaan in de voorste epitheel van het ei kamer, veroorzaakt door de polaire cellen 5,7. Medio oögenese (fase 9), de grens cellen los te maken van hun buren en migreren tussen de verpleegkundige cellen om de eicel te bereiken op de achterkant van het ei kamer 5,7. Deze beweging moet worden bereiktterwijl de grens cellen blijven in een cluster rond twee niet-polaire beweeglijke cellen, waardoor dit een soort collectieve celmigratie. Succesvolle migratie van de grens celcluster zorgt voor een goede ontwikkeling van de micropyle van de eierschaal, die nodig is voor bevruchting.
De voorste polaire cellen instrueren grens lot van de cel door het activeren van een signaaltransductie cascade. Polar cellen scheiden een cytokine, Unpaired (UPD), dat bindt aan een transmembraan receptor, Domeless (DOME), op aangrenzende follikel cellen tijdens fase 8 van eicelontwikkeling 8,9. De binding van UPD veroorzaakt Janus tyrosine kinase (JAK) tot fosforylering het Signal Transducer en Activator van de transcriptie (STAT) 8,10,11. STAT dan naar de kern om transcriptie te activeren. Langzaam Border Cells (SLBO) is een transcriptiefactor die een directe transcriptionele doel van STAT en is ook vereist voor grens celmigratie 12. Zijdelings uitzicht ei kamers geven thoed STAT activiteit wordt geregeld in een gradiënt over de voorste epitheel 8,11,13. Follikelcellen dichtst bij de polaire cellen de hoogste niveaus van geactiveerde STAT aldus worden zij rand cellen en binnenvallen aangrenzende kiemlijn weefsel.
Om te begrijpen hoe de grens cellen worden gespecificeerd binnen en losmaken van het epitheel, moeten we om te zien hoe het weefsel wordt georganiseerd. Als we ei kamers bekijken vanuit een anterieure-on perspectief, zouden we radiale symmetrie van STAT activiteit verwachten in de follikel cellen rondom de polaire cellen. Een eindaanzicht ook beter verschillen van membraaneiwitten en cel-cel-interfaces tonen vóór en tijdens losmaken dan vergeleken cellen in verschillende beeldvlakken. Omdat ei kamers zijn langwerpig en aan elkaar steel cellen, zij regelen op objectglaasjes lateraal, waardoor het moeilijk om de voorste architectuur observeren. Zo veel informatie over de cellen bij de polen van de ei kamer heeftis afgeleid uit een zijdelings uitzicht. Hoewel sommige informatie kan worden verkregen via algoritmische 3-D reconstructies van optische secties, lichtverstrooiing, fotobleken, en de armere grenzen van de resolutie in de Z-as te maken van deze informatie minder gedetailleerd en betrouwbaar in de afwezigheid van dure technieken als super-resolutie microscopie 14 . Andere soorten doorsnede Beeldvormende (bijvoorbeeld elektronenmicroscopie of microtoom snijden) dat uitgebreide manipulatie van weefsels, zoals uitdroging, waardoor de kans op artefacten. Zo, een nieuwe methode om de afbeelding D. ontwikkelden we melanogaster ei kamers terwijl rechtop. Deze methode heeft zijn nut al bewezen in het ophelderen hoe beweeglijke cellen zijn gedoemd (zie Representatieve resultaten en Manning et al, onder review), en zal waarschijnlijk meer in het algemeen waardevol in studies van andere aspecten van oögenese zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissectie van Ovarioles
- Breng ongeveer vijftien 2-4 dagen oude vrouwtjes en een paar mannetjes om een frisse vlieg voedsel flacon met toegevoegde actieve droge gist. Gebruik katoen als een plug voor de flesjes, en voeg een paar druppels water aan de katoen om de luchtvochtigheid hoog te houden.
- Plaats flacon in een 25 ° C incubator gedurende 14-16 uur bij podiummonitoren 8-10 ei kamers maximaliseren.
OPMERKING: Incubatie varieert afhankelijk van de temperatuur en de gewenste fase. - Bereid dissectie media, 0,1M KPO 4 en NP40 oplossingen als nodig is voor de volgende dag (zie Materials).
- Verdoven de vliegen met CO2 en onder een dissectie microscoop. Pipet enkele druppels dissectie media in elke holte in het glas depressie glijbaan.
- Houd pincet in elke hand op een ongeveer 30 ° hoek met de tafelblad en oriënteren één vrouwelijke vliegen met de vleugels naar beneden. Met uw niet-dominante hand, pak je de vrouw met behulp van een tang, grijpen haar op de eennterior van de buik, in de buurt van de thorax, en dompel ze in de dissectie media in de depressie dia (Figuur 1A inzet).
- Met de andere tang, pakt het exoskelet op de ventrale achterste van de buik en doorboren. Pak de eierstokken aan het achterste einde, en trek ze uit van de buik en plaats in het vers medium aan de andere kant van de depressie dia. (Figuur 1A inzet). Vermijd elkaar trekken van de darmen. Gooi het karkas.
- Herhaal dit met de andere vrouwelijke vliegen totdat alle eierstokken worden ontleed. Gooi de mannetjes.
- Met een pincet, bezit een eierstok aan het achterste uiteinde (dichtbij de grootste ei kamers), en met de andere hand te gebruiken pincethelften één van de meest voorste ei kamers (germarium) knijpen. (Figuur 1A).
- Langzaam en gestaag, trek een ovariole ketting uit de eierstok schede. Blijven ovarioles individueel ontleden tot alle gewenste ei kamers zijn removed.
- Herhaal stap 1,7-1,8 voor ontleed eierstokken.
- Eenmaal voltooid, overdragen ovarioles naar een 0,6 ml buis met behulp van een plastic transferpipet.
- Laat ovarioles naar de bodem van de buis, dan overgaan tot vaststelling en vlekken stappen.
2. Immunofluorescente (IF) kleuring van Ovarioles
- Verwijder dissectie media voorzichtig uit ovarioles met een pipet. Zorg ervoor dat u geen ovarioles of ei kamers te verwijderen. Laat ongeveer 50 ul van ovarioles en dissectie media.
- Voeg 50 ul van 16% paraformaldehyde 150 gl 0,1 M KPO 4 buffer in een buis en voeg oplossing ei kamers ze op te lossen. Incubeer terwijl schommelen gedurende 10 min. LET OP: paraformaldehyde is giftig.
- Verwijder fixatief en spoel tweemaal met 0,5 ml NP40 wasbuffer.
- Was tweemaal gedurende 15 min elk bij kamertemperatuur.
- Raadpleeg standaard IF-protocol 15 voor vervolgstappen.
- Kort na fixatie toevoegenprimaire antilichamen op geschikte verdunningen en geïncubeerd O / N bij 4 ° C. Was in NP40 meerdere malen, voeg dan secundaire antilichamen (1: 200 verdunningen).
- Was verscheidene malen in NP40, voeg DAPI (1: 1000) gedurende 10 min en herhaal wasbeurten. Zodra IF protocol is voltooid, voeg 200 pl 50% glycerol in PBS met ei kamers en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Verwijder oplossing, deze vervangen door 70% glycerol in PBS, en dek af met folie. Plaats monster bij 4 ᵒC tot klaar voor montage. Ondertussen, verder met stap 3.
3. Advance Voorbereiding van Glycerine Jelly Slides
- Meet minstens 4 ml glycerine gelei met een spatel en vul een glazen celcultuur buis naar het halverwege merk. Smelt glycerine gelei in een waterbad bij 55 ° C gedurende 30 min.
- Giet een kleine druppel glycerol, ongeveer 300 ul, uit de voorraad oplossing op twee objectglaasjes. Met een tissue, glycerol uitgespreid in een dunne layer over elk van de schuiven. Dit verschaft een basis en maakt gemakkelijke verwijdering van glycerine gelei in stap 5.6.
- Snijd de tip van een gefilterde 1.000 III pipettip. Gebruik cut pipettip 1000-1500 pi warme glycerine gelei overdragen langzaam aan elke microscoop dia. Zorg om bellen te voorkomen.
- Laat glycerine jelly dia zitten 5 minuten bij kamertemperatuur te stellen.
- Plaats elke glycerine gelei dia in 60 mm × 15 mm petrischaal en afdekken met folie. Plaats bij 4 ° CO / N. Eventueel opslag glycerine jelly dia tot 5 dagen bij 4 ° C.
4. Montage Egg Chambers
- Met behulp van monsters uit stap 2.5, pipet meerdere 3 pl druppels ei kamers in 70% glycerol aan weerszijden van een glycerine gelei glijbaan. Doorgaan pipetteren 3 pl druppels totdat alle ei kamers zijn op deze dia. Zorg ervoor dat elke druppel bevat ten minste tien ei kamers. Verhit ondertussen een cultuur buis van glycerine gelei in een 55 ° C waterbad.
- Plaats de glycerine gelei dia met ei kamers onder een dissectie microscoop. Stel vergroting zodat slechts één druppel ei kamers in het gezichtsveld (figuur 1B).
- Met behulp van een 30 gauge naald als een lepel, pak je de gewenste stadium ei kamer. Indien nodig, aparte gewenste ei kamers van een ovariole keten met de naald als een mes.
- Om vuil die kunnen interfereren met de beeldvorming te voorkomen, brengt u de ei kamer op de tweede glycerine gelei glijbaan, met de voorste naar links kijkt (figuur 1E -1). Herhaal dit tot er minstens zeven ei kamers opgesteld in een kolom (figuur 1C).
- Vorm nieuwe kolommen van zeven tot alle gewenste ei kamers worden overgedragen naar de tweede glycerine gelei dia.
- Scheur een klein stukje weefsel en twist. Gebruik dit om het overtollige PBS-glycerol absorberen uit het ei kamers door lichtjes aanraken van elk een. Zorg ervoor dat geen ei kamers te verwijderen.
- Snijd detip van een gefilterde 200 ul pipetpunt. Gebruik dit om 150 ul overdragen van glycerine gelei om alle kolommen van ei kamers te dekken.
OPMERKING: De hoeveelheid glycerine gelei nodig kolommen dekken is gebaseerd op ei kamer fasen en het aantal kolommen. Bedrag kan worden aangepast. - Laat gemonteerd ei kamers zitten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur totdat de bovenste laag van glycerol gelei volledig gestold (figuur 1D).
- Plaats dia van gemonteerde ei kamers in een 60 mm × 15 mm petrischaal en afdekken met folie. Bewaren bij 4 ° CO / N om de glycerine gelei lagen samen te stollen (plaats in het donker als er bezorgdheid over fotobleking).
5. Voorbereiding van Egg Chambers for Imaging
- Plaats dia van gemonteerde ei kamers onder een dissectie microscoop. Stel vergroting zodat slechts één kolom ei kamers in het gezichtsveld.
- Met behulp van een hoek van 45 ° miniatuur scalpel, snijd een straight lijn langs de rechterkant van de eerste kolom van ei kamers (dicht bij de achterste zijde van het ei kamers). (Figuur 1D-E)
- Vervolgens bezuiniging de eerste ei kamer boven en onder de laatste ei kamer in de kolom. Op dit punt de kolom ei kamers aan drie zijden worden afgesneden.
- Met een microknife, doorsnede is langs de linkerkant van de kolom zo dicht mogelijk bij de voorste kant van het ei kamers (figuur 1E -3).
- Pipet 100 ul koud 1X PBT over de kolom cut.
- Gebruik een ronde randen spatel om de overtollige glycerine gelei rond drie zijden van de snede kolom van ei kamers en gooi te verwijderen, en de rest op de dia.
- Plaats de spatel in de snede gemaakt aan de anterieure zijde van ei kamers en scheiden de kolom uit de primaire glycerine gelei blok.
- Bereiden monsters voor een van beide omgekeerd (5.8.1) of rechtop (5.8.2) microscopie.
- Voor omgekeerde microscoop: Transfer tHij kolom van ei kamers om een dekglaasje met anterieure zijde van ei kamers naar beneden. Herhaal stap 5,2-5,8 totdat alle kolommen glycerine gelei verwijderd en gemonteerd. Voeg een paar druppels van 50% PBS-Glycerol op elk blok van ei kamers om te voorkomen dat ze uitdrogen. Afbeelding ei kamers direct aan het dekglaasje.
- Voor Upright Microscoop: Breng de kolom van ei kamers om een microscoop dia met de anterieure zijde naar boven. Herhaal de stappen 5,2-5,9 totdat alle kolommen van glycerine gelei zijn verwijderd en gemonteerd op de microscoop dia's. Voeg een paar druppels van 50% PBS-Glycerol op elk blok van ei kamers en deksel blokken met een # 1 ½ dekglaasje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De opstaande beeldvormingswerkwijze konden we direct de organisatie van cellen in de voorste folliculaire epithelium zien in stap 8. een algemene merker voor follikel lot van de cel, de ogen Afwezig (EYA) proteïne, alsmede de nucleaire DNA merker DAPI vertoonde zelfs expressie in dit gebied van cellen, en dat voor alle cellen konden worden waargenomen met gelijke kleuring intensiteit (Figuur 2B "). Eiwitten geregeld in reactie op de cytokine UPD toonde echter variabele patronen en expressieniveaus. Polar cellen los UPD apicaal voordat dit stadium ei ontwikkeling 16,17, dus verwacht STAT radiaal activeren de polaire cellen, die soms het geval was. Vaak, hoewel, we geconstateerd dat downstream targets van STAT, waaronder SLBO, had meer complexe expressie patronen. Bijvoorbeeld GFP reporter voor SLBO expressie verscheen in de meeste, maar niet alle, cellen die de polaire cellen omgeven (figuur 2B, en zie Manning et al onder review). Merkten we kleine verschillen in E-cadherine / lokalisatie (Figuur 2B), die veranderingen in de hechting kunnen weerspiegelen, maar meer werk nodig zal zijn te kwantificeren en dit resultaat te interpreteren. Deze subtiliteiten waren niet detecteerbaar door laterale driedimensionale reconstructie van geënsceneerde ei kamers (figuur 2C-D). De verschillen in de apicale-basale as van de follikel cellen kunnen ook worden onderscheiden met de staander methode. We gebruikten een reporter lijn voor de ring kanaal eiwit Visgun (VSG), dat in het apicale gebied van plasmamembranen 18 (figuur 3A) is. Rechtop imaging bevestigde VSG-expressie werd gedetecteerd in het apicale deel van de follikel cellen, nabij het smalste deel van de polaire cellen (Figuur 3B).
We hebben ook gevonden dat de opstaande beeldvormende methode werkt goed op de voorste epitheel weergeven in fase 9 ei kamers. Op dit develkelingsdoeleinden stadium de grens cellen coalesceren samen rond de polaire cellen (Figuur 4A). We kunnen deze verdicht clusters met eind-over imaging (Figuur 4B-C) waarnemen. Zoals in fase 8, vonden we een vergelijkbaar niveau EYA expressie in de epitheelcellen (niet getoond), terwijl slbo GFP alsook geactiveerde nucleaire STAT was het beweeglijke grens cellen (Figuur 4B en 4C). Lokalisatie van FAS3 eiwit aangegeven de polaire cel-polaire cel interface (Figuur 4B). Bovendien, in beide trappen 8 en 9 konden grote verpleegster cellen zien, zoals aangegeven door DAPI of phalloidin-kleuring van corticale actine (niet getoond), wat suggereert deze methode ook nuttig in de studie van kiembaancellen of kiemcellen zijn -follicle cel interacties.
Figuur 1. Rechtop montage van Drosophila ei kamers. (A) Drosophila eierstok aangeeft ei kamer, schede, en ovariole. Afbeelding illustreert de positie van een tang voor langzaam trekken de ovariole uit de eierstok schede. Inzet toont positionering van vlieg voor dissectie. Ventrale zijde van vrouwelijke vlieg naar boven wijst. A-anterior, P-posterior. (BD) Procedure van montage ei kamers. (B) Een kleine druppel ei kamers in 70% glycerol-PBS, bekeken onder een dissectie stereomicroscoop. De gele pijl geeft een ovariole keten; gele pijlpunt geeft aan een individu ei kamer. Rode pijl geeft de rand van de glycerol-PBS druppel. (C) Kolommen van ei kamers aangebracht op dunne laagje gestolde glycerine gelei. Gele pijlpunt geeft aan een individu ei kamer. (D) een tweede dunne laag van gesmolten glycerine gelei bedekt de ei kamer kolommen om ze in te sluiten. Gele stippellijn geeft aan waar de sneden moeten worden gemaakt na O / N incubatie bij 4ᵒC. Rode pijl geeft derand van de tweede laag van glycerine gelei. Rode cijfers geven de volgorde van het ei kamer kolommen (horizontale bovenste en onderste delen niet getoond) te snijden. Anterior is aan de linkerkant. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Beeldvorming van de voorste epitheel van een vroeg stadium 8 ei kamer. (A) Zijdelingse weergave van een etappe 8 langzame grens cellen (slbo) gen reporter ei kamer (genotype: slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, gekleurd met DAPI en primaire antilichamen zoals aangegeven of voor slbo> GFP. armadillo (ARM) is de vlieg homoloog van β-catenine. Anterior (A) is naar links, achterste (P) naar rechts. (BB ") End-on uitzicht op een ei chamber. Driedimensionale reconstructie van Z-stack beelden van een etappe 8 slbo- gen reporter ei kamer gemonteerd rechtop, gekleurd met primaire antilichamen zoals aangegeven. Magenta sterretjes geven polaire cellen. DAPI geeft de kernen. (B) slbo> GFP expressie alleen in de veronderstelde grens cellen (SLBO). E-cadherine (E-CAD) is een adhesie molecuul gelokaliseerd in het membraan en verrijkt in de grensregio cellen. (B '') Eyes Afwezig (EYA) wordt gevonden gelijkmatig uitgedrukt in de kernen van alle follikel cellen behalve polaire cellen. (C) Standaard zijaanzicht van een slbo reporter stadium 8 ei kamer met DAPI (blauw) en antilichamen tegen GFP (SLBO, groen), ARM (rood), en FAS3 (wit). Inzet waarop de assen: de X-as omlaag (groene pijl) Y-as naar links (rode pijl) en de Z-as naar de kijker (blauw) (D) ter vergelijking met de nieuwe techniek. Dit paneel toont een eind on-view created door een driedimensionale reconstructie, verwerkt Volocity software met een Z-stapel laterale beelden van het ei kamer getoond in C. Inzet toont de gedraaide assen: de X-as omlaag (groene pijl) Z-as Nu naar links (blauwe pijl), en de Y-as naar de kijker (rood). Individuele cellen zijn wazig vanwege lage resolutie in de z-as; Zo, de nieuwe aanpak wordt in B is een belangrijke beeldvorming verbetering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Het vergelijken van eiwitexpressie in laterale en anterieure domeinen van de folliculaire epitheel van een etappe 8 ei kamer. (A) Reconstructie van een zijaanzicht van een etappe 8 ei kamer van visgun (VSG) GFP reporter <sup> 21-23, gekleurd voor antilichamen gericht tegen GFP of ARM (wit). DAPI markeert de kernen in het blauw, en grote verpleegkundige celkernen zijn duidelijk zichtbaar. VSG lokaliseert de grachten van follikel cellen (groen). (BB) End-on meningen van een ei chamber.Three-dimensionale reconstructie van een Z-stapel afbeeldingen van een trap 8 VSG-GFP reporter ei kamer, gekleurd met primaire antilichamen zoals aangegeven. SLBO eiwit (rood) wordt gedetecteerd in zowel polaire als grens celkernen. ARM markeert follikel celmembranen en verrijkt border cellen; DAPI labels kernen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Imaging van vroeg stadium 9 ei kamers. (A) Zijdelingse weergave van een vroeg stadium 9 slbo reporter ei kamer. De grens cellen (groen) zijn geclusterd binnen de voorste epitheel (witte pijl). BC) End-on uitzicht op het ei kamers. Drie dimensionale reconstructie van een Z-stapel afbeeldingen in een vroeg stadium 9 slbo- gen reporter ei kamer, gekleurd met primaire antilichamen tegen de eiwitten aangegeven of GFP. (B) slbo> GFP expressie wordt gebracht in het grensgebied cellen (groen) , terwijl fascicline 3 (FAS3, wit) lokaliseert sterk aan het membraan tussen de twee polaire cellen; DAPI markeert de kernen (blauw). Magenta sterretjes geven polaire cellen. (C) Beide nucleaire (geactiveerd) STAT en slbo> GFP expressie zijn alleen te vinden in het grensgebied cellen, terwijl de E-cadherine (E-CAD) markeert de membranen van follikel cellen, en DAPI geeft de kernen. Magenta sterretjes geven polaire cellen. Kleuring resultaten worden afzonderlijk voor slbo> GFP (C ') en STAT (C') Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een methode beschrijven we te monteren en het imago kleine, ontwikkelen ei kamers van een end-on perspectief. Gemeenschappelijke technieken voor beeldvorming ei kamers zijn geoptimaliseerd voor een zijdelings uitzicht en in de eerste plaats maken een nauwkeurige visualisatie van medio-laterale follikel cellen na kleuring met fluorescerende antilichamen. Het gebruik van Z-stacks of 3-D reconstructies helpt bij het bekijken van meerdere focale vlakken, maar is nog steeds onvoldoende voor subcellulaire resolutie van de polen van elliptische ei kamers (figuur 2D). Hoewel dit ten dele kan worden overwonnen met de nieuwste microscopie zoals super-resolutie afbeelding, deze methoden zijn duur en niet altijd beschikbaar. We hebben opstaande beeldvormingsprotocollen aangepast Drosophila embryo 24,25 worden gebruikt voor de veel kleinere ei kamers. Er zijn verschillende belangrijke wijzigingen in de werkwijze overeenkomt met het veel kleinere omvang van ei kamers tegenover embryo. Een belangrijk onderdeel van de beschreven techniek is de fysieke SEPARatie van afzonderlijke kamers, die niet verplicht embryo. Een andere verandering is het gebruik van een tweede glycerine gelei schuif tijdens montage (4.4). De grootte van het ei kamers en de bevestiging door stengel cellen met ander ei kamers vereist manipulatie met de naald en leidt tot vernietiging van glycerine gelei. Daarom moet ei kamers worden overgedragen met een naald om een nieuw glycerine jelly glijbaan montage (4.5). Rechtop beeldvorming zorgt voor visualisatie van de vertroebeld door laterale of horizontale uitzicht gebieden, onthullende nieuwe informatie over het weefsel organisatie tijdens de eieren ontwikkeling. Dit leidde tot nieuwe inzichten over de patronen gebeurtenissen en we stellen dat deze methode kan worden gebruikt om extra aspecten van oögenese verkennen.
We hebben een aantal cruciale stappen in het succesvol staande montage bepaald. We vonden dat is het nodig om ovariole ketens volledig uit het omhulsel te verwijderen tijdens de dissectie en gewenste ei kamers moeten van de ovariol worden gesnedene-keten. Het niet vrij ei kamers van het ovariole maakt het moeilijk te halen de juiste fase ei kamer (stap 4.3). We raden werken met kleine hoeveelheden glycerine gelei op een door aliquoting deze in buisjes. Niet verwarmen glycerine jelly meer dan twee keer, omdat herhaalde verwarming verandert de consistentie en voorkomt dat het op de juiste (3.1) stollen. Gebruik filter tips om te voorkomen dat het aanzuigen van gelei in pipetten. Laat glycerine gelei stollen op objectglaasje gedurende ten minste 8 uur bij 4 ° C. Verkorting van deze stap maakt het monteren van de ei kamers moeilijk (3.6). Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alle PBS-glycerol absorberen uit gemonteerd ei kamers (4.6). Als teveel vloeistof aanwezig is, verhindert het de bovenste laag van glycerine gelei hechten aan de bodem. In dit geval kan ei kamers drijven combineerbaar. Voor de beste beeldvormende resultaten moet glycerine gelei blokken dicht bij de voorste zijde van ei kamers fysiek mogelijk (5.4) worden gesneden. Teveel glycerine gelei op dezekant vermindert de beeldkwaliteit als gevolg van de toegenomen afstand tussen het monster en het dekglaasje.
Er zijn wel enkele voorwaarden van montage monsters in glycerine gelei. Voor een, verhoogt de afstand tussen het monster en de doelstelling. Deze afstand bij hoge vergroting, vooral bij gebruik van olie-objectief kan problemen creëren gericht op het monster, hetgeen kan leiden tot een slechte beeldkwaliteit. Op grond hiervan is het zeer belangrijk om spitten glycerine jelly blokken dichtbij het ei kamers. Hoewel de glycerine gelei is optisch helder, het doet defract wat licht. Een andere beperking is dat antilichaam signaal kan worden gereduceerd door een combinatie van de werkafstand van het doel en de dikte van glycerine gelei. Een verhoging van de concentratie van primaire en / of secundaire antilichamen kunnen soms helpen bij het verminderen van dit probleem. Hoewel het verschilt per antilichaam, we meestal betere beelden verkregen met behulp van het dubbele van de concentratie van secundaire mieribody rechtop beeldvorming ten opzichte van de gebruikte standaard laterale imaging hoeveelheid. Wij kennen geen alternatieven voor glycerine gelei voor montage ei kamers rechtop. Andere materialen zoals agarose en polyacrylamide werden geprobeerd, maar alles defracted licht strenger, waardoor een verlies van helderheid, terwijl beeldvorming. Aldus is deze bevestigingstechniek is het beste dat momenteel beschikbaar is voor gebruik met standaard microscopie.
Terwijl we ons gericht op de stadia van de grens celspecificatie en initiatie van de beweeglijkheid, kon ei kamers van verschillende stadia worden gebruikt in dit protocol met slechts een paar kleine aanpassingen. Het belangrijkste is, kan de meter van de naald worden veranderd om ei kamers van verschillende grootte en ontwikkelingsstadia te manipuleren. Voor podia 7-10, een 30 G naald werkt goed omdat het ei kamers passen gemakkelijk in de schuine kant. Voor eerder stadium ei kamers een grotere naald (kleinere schuine) worden gebruikt en zo ook een kleinere spoorbreedte (grotere afschuining) moet worden gebruikt voor latere stei kamers verouderd. Even wat bij een oudere ontwikkelingsstadium zou te groot voor deze meter (4.3) zijn. Ook een bijwerking van het ei kamer kan worden afgebeeld met behulp van deze techniek aanbrengen glycerine gelei blok ei kamers met het aandachtsgebied naar de doelstelling.
Montage kleine monsters ondersteund glycerine gelei het potentieel bruikbaar in meerdere contexten zijn. Deze strategie kan worden gebruikt om verschillende soorten kleine, gefixeerde weefsels uit andere organismen te visualiseren, vooral wanneer het onvoldoende is om de monsters te beoordelen vanuit één perspectief. Wanneer deze techniek beheerst, kan het worden gebruikt om ei kamers op elk gewenste hoek, afhankelijk van het ei kamers worden geplaatst in de gelei. Deze methode zorgt voor een uniek uitzicht op het creëren van een veel betere driedimensionale begrip van cellulaire organisatie. Rechtop beeldvorming van ei kamers in combinatie met immunofluorescentieantistoffentest kleuring maakt een nauwkeurige detectie van eiwits en cel-cel contacten die niet mogelijk is onder standaard montage omstandigheden. We zijn van plan om deze methode te gebruiken in kaart brengen van de cel-cel interacties die de coalescentie en onthechting van de grens cel cluster van het epitheel mogelijk te maken. Op dit moment kan de staander beeldvormende techniek niet worden gebruikt met levende monsters, maar werken ook dit obstakel te overwinnen. We verwachten dat deze methode zal ook van toepassing te studeren van andere aspecten van Drosophila oögenese zijn, of kunnen worden aangepast aan het andere kleine weefsels op nieuwe invalshoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L.
- Bastock, R., St Johnston, D.
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al.
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al.
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
