Introduction
초파리의 연구 현상의 넓은 범위의 유전자 조절에 큰 통찰력을 제공하고 있습니다. oogenesis 티슈 패터닝 셀 극성의 변화, 세포주기 스위칭, 및 병진 규제 1,2,3,4- 등 다양한 발달 과정을 조사하기 취급 용이 한 방법을 제공하기 때문에 특히, 계란 개발에 대한 광범위한 연구가있어왔다. oogenesis 때 중요한 형태 발생 이벤트 (5 검토) 테두리 세포라는 세포의 집합의 명세서, 운동성의 취득 및 마이그레이션이다. 세포 이동하기 때문에 동물 형태 발생의 중요한 특징이며,이 프로세스의 유전자 조절이 잘 보존되어 있기 때문에, 파리 결정 메커니즘은 다른 상황에서 중요 할 것으로 보인다. 따라서, 우리는 경계 세포 이동의 분자 제어를 조사하고있다. 우리의 연구를 위해, 우리는 계란을 개발하는 전방 극을 관찰 할 수있는 새로운 방법을 개발했다,경계 셀이 발생하는 경우, 그들이 어떻게 발달 상세히 검토한다.
난소 내에서 다양한 발달 단계에서 계란 챔버는 얇은 외피 (그림 1A)에 싸여있다 ovarioles라는 체인을 따라 존재한다. 각 달걀 챔버는 한 계란을 형성에 갈 것입니다. oogenesis 동안 여러 종류의 세포 조화롭게 개발해야한다. D. 달걀 melanogaster의 챔버는 단일 모낭 상피 층 (6)에 의해 둘러싸인 하나의 난자를 포함한 16 생식계 세포로 구성된다. 극성 세포라는 특수한하는 소수의 세포는 상피의 전후방 극에서 발생한다. 6-8 테두리 세포 극성 세포에 의해 유도 된 5,7- 달걀 챔버의 전방 상피에서 발생. 중간 oogenesis (단계 9)에서, 경계 셀들이 이웃으로부터 분리하고 계란 5,7- 챔버의 후방에 도달하는 난자 세포 간호사 사이에 이동한다. 이 운동은 달성해야테두리 세포 집단이 세포 이동의 유형 만드는 두 운동성 극성 주변 세포 클러스터에 남아있다. 경계 셀 클러스터의 성공적인 마이그레이션 수정에 필요한 달걀 껍질의 micropyle의 적절한 개발을 보장합니다.
전방 극성 세포 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 경계 셀 운명 지시. 폴라 난자 세포의 발달 8,9 스테이지 (8) 중에 모낭 인접 셀에, 경막 수용체 Domeless (DOME)에 결합하는 사이토킨으로 독립 (UPD)를 분비한다. UPD의 결합은 야누스 티로신 키나제 (JAK)의 전사 (STAT) 8,10,11의 신호 변환기 및 활성제를 인산화됩니다. STAT는 전사를 활성화하기 위해 핵으로 이동합니다. 느린 테두리 세포 (SLBO)는 STAT의 직접 전사 대상이며, 또한 테두리 세포 이동 (12)에 요구되는 전사 인자이다. 계란 챔버의 측면보기는 t을 나타냅니다모자 STAT 활동은 전방 상피 8,11,13에 걸쳐 그라데이션으로 조절된다. 극성 세포에 가장 가까운 여포 세포 따라서 그들이 경계 셀과 인접되어 생식계 조직 침입, STAT 활성화의 가장 높은 수준을 갖는다.
국경 세포 내에서 지정 및 상피 세포에서 분리하는 방법을 이해하기 위해, 우리는 조직이 어떻게 구성되어 있는지 관찰해야합니다. 우리가 전방-에 관점에서 계란 챔버를 보면, 우리는 극성 세포를 둘러싸고있는 여포 세포에서 STAT 활동의 반경 대칭을 기대. 최종에서보기는 더 정확하게 이전에 다른 초점면에 세포를 비교하는 것보다 분리하는 동안 막 단백질과 세포 - 세포 인터페이스의 차이를 보여 것입니다. 달걀 챔버 직사각형과 줄기 세포에 의해 서로 연결되어 있기 때문에 어려운 전방 구조를 관찰하기 위해, 측 방향 슬라이드 상에 정착. 따라서, 달걀 챔버의 극의 세포에 대한 많은 정보가 있습니다측면 뷰에서 유추 된. 일부 정보는 photobleaching에 광학 부, 광 산란의 알고리즘 3-D 재구성 및 Z 축에서의 해상도 불량한 한계를 통해 얻어 질 수 있지만, 초 - 해상도 현미경 (14)과 같은 고가의 기술이없는 경우에이 정보는 이하 상세하고 신뢰성을 . 섹션 기반 이미징의 다른 종류 (예를 들어, 전자 현미경 또는 마이크로톰 절편)는 아티팩트 가능성을 증가, 탈수 포함한 조직의 광범위한 조작을 필요로한다. 따라서, 우리는 이미지 D.에 새로운 방법을 개발 똑바로 동안 melanogaster의 달걀 챔버. 이 방법은 이미 (검토중인 대표 결과와 매닝 등을 참조) 운동성이있는 세포가 운명하는 방법을 아는데 도움이 검증 된, 그리고 더 넓게 가치 oogenesis의 다른 측면의 연구 될 가능성이있다.
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Protocol
Ovarioles 1. 해부
- 추가 활성 건조 효모와 신선한 플라이 식품 유리 병에 약 15 ~ 4 일 된 여성 파리와 몇 명의 남성을 전송합니다. 바이알을위한 마개로 솜을 사용하여, 높은 습도를 유지하는면에 몇 방울의 물을 추가한다.
- 14-16 시간 동안 25 ° C의 배양기에서 찾는 바이알 스테이지 8-10 달걀 챔버의 개수를 최대화한다.
참고 : 배양 시간은 온도와 원하는 단계에 따라 달라집니다. - 다음날에 필요한 해부 미디어를 준비, 0.1M KPO 4 NP40 솔루션 (자료 참조).
- CO 2를 사용하여 파리를 마취하고, 해부 현미경으로 배치합니다. 피펫 유리 우울증 슬라이드의 각 공동으로 해부 미디어를 몇 방울.
- 한 여성 비행 아래로 날개를 가진 테이블 상단과 동양에 약 30 ° 각도로 각 손에 집게를 잡습니다. 당신의 비 지배적 인 손으로, 그녀를 잡고, 집게를 사용하여 여성을 데리러흉부 근처 복부의 nterior 및 우울증 슬라이드 (그림 1A 인세 트)의 해부 미디어에 그녀의 잠수함.
- 포셉의 다른 쌍으로, 복부의 복부 후방에서 외골격을 잡고 관통. 후방 끝에 난소를 잡고, 다음 복부에서 그들을 끌어와 우울증 슬라이드의 반대편에 신선한 미디어에 배치합니다. (그림 1A 인세 트). 장 떨어져 당겨하지 마십시오. 시체를 버리십시오.
- 모든 난소를 해부 할 때까지 다른 여성 파리로 반복합니다. 남성을 폐기하십시오.
- 포셉 한 쌍, (가장 큰 달걀 챔버 근처) 후방 끝에 난소를 잡고 다른 손으로 가장 앞쪽에 계란 챔버 (germarium) 중 하나를 꼬집어 집게 한 쌍을 사용합니다. (도 1a).
- 천천히 그리고 꾸준히, 난소 칼집에서 ovariole 체인을 당깁니다. 원하는 모든 계란 챔버 R 때까지 개별적으로 ovarioles를 해부 계속emoved.
- 반복하여 모든 해부 난소에 대한 1.7-1.8 단계를 반복합니다.
- 완료되면, 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 0.6ml 튜브에 ovarioles를 전송할 수 있습니다.
- ovarioles는, 튜브의 바닥에 정착 한 후 고정 및 염색 단계로 진행하자.
Ovarioles 2. 면역 형광 (IF) 염색
- 조심스럽게 피펫 ovarioles에서 해부 용지를 제거합니다. 어떤 ovarioles 또는 달걀 챔버를 제거하지 마십시오. ovarioles 및 해부 미디어의 약 50 μl를 남겨주세요.
- 튜브에 0.1 M KPO 4 버퍼의 150 μl의 16 % 파라 포름 알데히드의 50 μl를 추가하고이를 해결하기 위해 계란 챔버에 솔루션을 추가합니다. 10 분 동안 흔들 동안 품어. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다.
- 정착액을 제거하고 0.5 ml의 NP40 세척 버퍼로 두 번 씻어.
- RT에서 15 분 각각 두 번 씻으십시오.
- 다음 단계에 대한 표준 IF 프로토콜 15을 참조하십시오.
- 간단히, 고정 후, 추가적절한 희석에 차 항체와 4 ° C에서 O / N을 품어. (200 희석 1) 다음 이차 항체를 추가, NP40 여러 번에 씻으십시오.
- NP40에서 여러 번 세척 한 후 DAPI (1 : 1,000)를 추가 10 분 동안, 다음 세척을 반복합니다. 프로토콜이 완료되면 일단, 계란 챔버에 PBS에 50 % 글리세롤 200 μl를 추가하고 2 시간 동안 실온에서 앉아 보자.
- , 용액을 제거 PBS에 70 % 글리세롤로 교체하고, 호일 커버. 설치 준비가 될 때까지 4 ᵒC에서 샘플을 놓습니다. 한편, 3 단계를 계속합니다.
글리세린 젤리 슬라이드 3. 사전 준비
- 글리세린 젤리 주걱을 이용하여 적어도 4 mL로 측정하고 반쯤 마크에 유리 셀 배양 관을 채운다. 30 분 동안 55 ℃에서 수욕 글리세린 젤리 녹아.
- 두 현미경 슬라이드 상 스톡 용액으로부터 글리세롤의 작은 방울, 약 300 μL를 붓는다. 조직을 사용하여 얇은 라 글리세롤 확산yer의 각 슬라이드에 걸쳐. 이 기반을 제공하고 단계 5.6에서 글리세린 젤리 쉽게 제거 할 수 있습니다.
- 필터링 된 1,000 μL 피펫 팁 오프 끝을 잘라. 사용 컷 피펫 팁 천천히 각 현미경 슬라이드에 따뜻한 글리세린 젤리 1,000-1,500 μl를 전송합니다. 거품을 방지하기 위해 필요한주의를 기울입니다.
- 글리세린 젤리 슬라이드 설정 실온에서 5 분 동안 앉아 보자.
- 60mm × 15mm 페트리 접시에 각각의 글리세린 젤리 슬라이드를 삽입하고 플라스틱 포장으로 덮고. 4 ° CO / N에서 장소. 선택적으로, 상점은 4 ° C에서 최대 5 일 동안 젤리 슬라이드 글리세린.
4. 계란 챔버 장착
- 단계 2.5, 하나의 글리세린 젤리 슬라이드에 걸쳐 70 % 글리세롤 계란 챔버의 피펫 여러 3 μL 상품에서 샘플을 사용. 모든 계란 챔버이 슬라이드 때까지 피펫 3 μL 상품을 계속합니다. 각각의 강하가 적어도 10 달걀 챔버가 포함되어 있는지 확인합니다. 한편, 55 ° C의 물을 욕조에 글리세린 젤리의 문화 튜브를 가열.
- 해부 현미경으로 계란 챔버와 글리세린 젤리 슬라이드를 놓습니다. 계란 챔버의 한 방울의 시야 (도 1b)에 있도록 배율을 조정한다.
- 원하는 단계 달걀 챔버를 데리러, 숟가락으로 30 게이지 바늘을 사용. 시 칼 등을 이용하여 바늘 ovariole 체인에서 필요한 별도 소망 달걀 챔버.
- 영상을 방해 할 수있는 파편을 피하기 위해, 왼쪽 (그림 1E -1)에 직면 전방에, 두 번째 글리세린 젤리 슬라이드에 계란 챔버를 전송합니다. 적어도 7 계란 챔버 열 (그림 1C)에 줄 지어있을 때까지 반복합니다.
- 원하는 모든 계란 챔버가 제 2 글리세린 젤리 슬라이드로 전송 될 때까지 일곱의 새 열을 형성합니다.
- 조직과 트위스트의 작은 조각을 떼어냅니다. 가볍게 하나 하나를 만져 계란 챔버에서 초과 PBS-글리세롤을 흡수하는 데 사용합니다. 달걀 챔버를 제거하지 않도록주의하십시오.
- 잘라필터링 된 200 μL 피펫 팁의 끝. 계란 챔버의 모든 열을 충당하기 위해 젤리 글리세린의 150 μl를 전송하는 데 사용합니다.
주 : 칼럼을 커버하기 위해 필요한 글리세린 젤리의 양을 알 챔버 단계 및 열 번호에 기초한다. 사용량이 적절히 조절 될 수있다. - 글리세린 젤리 상부층 완전히 (도 1D) 고화 될 때까지 장착 달걀 챔버 RT에서 5 분 방치.
- 장소 60mm × 15mm 페트리 접시에 장착 된 계란 챔버 슬라이드 및 플라스틱 포장으로 덮고. 4 ° CO / N 스토어는 (photobleaching에 대한 우려가있는 경우 어두운 장소) 글리세린 젤리 층이 함께 응고 허용합니다.
이미징 계란 챔버 5. 준비
- 해부 현미경 아래에 장착 계란 챔버의 슬라이드를 놓습니다. 계란 챔버 한 열만이 시야에 있도록 배율을 조정한다.
- 45 ° 각도 소형 메스를 사용하여, straig를 잘라(계란 챔버의 후방에 가까운 측) 달걀 챔버의 첫 번째 열의 우측에 HT 라인. (그림 1D-E)
- 다음에, 열의 마지막 달걀 챔버 맨 먼저 계란 챔버의 상하 절단. 이 시점에서 달걀 챔버 열 삼면 절단 예정.
- 계란 챔버 (도 1E -3)의 전방 측에 최대한 가깝게 microknife 열의 왼쪽의 슬라이스를 이용.
- 절단 된 열을 통해 감기 1X PBT 100 μl를 피펫.
- 슬라이드에 나머지를 떠나, 계란 챔버 및 폐기의 절단 열 세 가지 측면 주위에 여분의 글리세린 젤리를 제거하기 위해 둥근 가장자리 주걱을 사용합니다.
- 계란 챔버의 전방 측에 만든 컷 주걱을 삽입하고 기본 글리세린 젤리 블록에서 열을 구분합니다.
- 샘플 중 하나를 반전 (5.8.1) 또는 수직 (5.8.2) 현미경을 준비합니다.
- 거꾸로 현미경의 경우 : 전송 t계란 챔버의 앞쪽면이 아래로 향하게하여 커버 슬립에 계란 챔버 그는 열입니다. 글리세린 젤리의 모든 열 제거 및 장착 될 때까지 반복 5.2-5.8 단계를 반복합니다. 마르지 않도록 달걀 챔버의 각 블록에 50 % PBS-글리세롤의 몇 방울을 추가합니다. 직접 커버 슬립에 이미지 계란 챔버.
- 직립 현미경의 경우 : 전방면이 위로 향하게하여 현미경 슬라이드에 계란 챔버의 열을 전송합니다. 글리세린 젤리의 모든 열을 제거하고 현미경 슬라이드에 장착 될 때까지 반복 5.2-5.9 단계를 반복합니다. # 1 ½ coverslip에 계란 챔버 커버 블록의 각 블록에 50 % PBS-글리세롤의 몇 방울을 추가합니다.
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Representative Results
똑바로 이미징 방법은 우리가 단 8시에 전방 모낭 상피 세포의 직접 조직을 볼 수 여포 세포 운명의 일반적인 마커, 눈에 결석 (EYA) 단백질뿐만 아니라 핵 DNA 마커 DAPI, 심지어 표현을 보여 주었다 세포의이 들판을 가로 질러, 모든 세포가 비슷한 염색 강도 (그림 2B ")로 볼 수 있다는 것을 보여 주었다. 사이토킨 UPD에 응답하여 조절 단백질 그러나, 가변 패턴 및 발현 수준을 보였다. 극 세포는 계란 개발 16, 17의이 단계에 치근단 이전에 UPD를 해제, 그래서 우리는 STAT 때때로 사건이었다 극성 세포에 대해 반경 방향으로 활성화 될 것으로 예상. 종종하지만, 우리는 SLBO 포함 STAT의 다운 스트림 대상, 관찰 더 복잡한 발현 패턴을 가지고 있었다. 예를 들어, SLBO 발현 GFP 기자 전부는 아니지만, 대부분의 극성 세포를 둘러싸 세포 (그림 2B 등장하고, 맨 참조ING 등 검토 중 등). 우리는 접착력의 변화를 반영 할 수있다 E-cadherin의 발현 / 현지화 (그림 2B ')에서 약간의 차이를 발견하지만, 더 많은 작업을 정량화하고이 결과를 해석하는 데 필요합니다. 이러한 미묘한 차이는 무대 달걀 챔버의 측면 입체 재건 (그림 2C-D)를 통해 검출되지 않았다. 모낭 세포의 정단-기저 축의 차이는 또한 직립 방법을 이용하여 구별 될 수있다. 우리는 원형질막 18 (도 3A)의 꼭대기 영역에 존재하는 고리 운하 단백질 Visgun (VSG)에 대한 리포터 라인을 사용했다. 업라이트 촬상 확인 VSG 발현 극성 세포 (도 3B)의 가장 좁은 부분 근처 여포 세포의 꼭대기 부에서 검출되었다.
우리는 또한 직립 이미징 방법은 단 9 계란 챔버에 전방 상피를 볼 잘 작동 것을 발견했다. 이 (STABLE)에서opmental 단계는 경계 셀 극성 세포 (도 4A)의 주위에 서로 합체. 우리는 말에 영상 (그림 4B-C)를 사용하여 이러한 압축 클러스터를 관찰 할 수있다. slbo의 -GFP뿐만 아니라 활성화 된 핵 STAT는 운동성 테두리 세포 (도 4b 및도 4c)를 표시하면서 스테이지 (8)에서, 우리는 모든 상피 세포 (도시 생략)에 EYA 발현 비슷한 수준을 발견 하였다. FAS3 단백질의 현지화는 극성 세포 극성 셀 인터페이스 (그림 4B)을 지적했다. DAPI 또는이 메소드는 생식선 세포 또는 배아 세포의 연구에 유용 할 것이다 제안 피질 액틴 (도시 생략)의 팔로이 딘 염색법으로 표시된 바와 같이 또한, 두 단계 8 및도 9에서는, 큰 간호사 셀을 볼 수 있었다 -follicle 세포 상호 작용.
초파리 계란 챔버의 그림 1. 수직 장착의. (A) 초파리의 난소는 난자 실, 칼집, 그리고 ovariole를 나타내는. 묘사 난소 시스 천천히 ovariole 당기는 집게의 위치를 나타낸다. 삽입 된 해부 용 파리의 위치를 보여줍니다. 여성 파리의 복부 쪽이 위쪽에 직면 해있다. A-전방, P-후방. 달걀 챔버를 장착 (BD) 절차. (B) 70 % 글리세롤 PBS 계란 챔버의 작은 방울, 해부 실체 현미경을 볼. 노란색 화살표는 ovariole 체인을 나타냅니다; 노란색 화살표는 개별 계란 챔버를 나타냅니다. 빨간 화살표는 글리세롤 PBS 방울의 가장자리를 나타낸다. 고화 된 글리세린 젤리의 얇은 층에 배치 된 계란 챔버 (C) 열. 노란색 화살표는 개별 계란 챔버를 나타냅니다. (D) 용융 글리세린 젤리의 두 번째 얇은 층을 포함하는 계란 챔버 열을 다룹니다. 상처가 4ᵒC에서 O / N 배양 이후에해야하는 위치를 노란색 점선을 나타냅니다. 빨간색 화살표가 표시글리세린 젤리 제 2 층의 가장자리. 빨간 숫자는 달걀 챔버 열 (수평 상부 및 하부 컷이 도시되지 않음)의 절단 순서를 나타낸다. 전방 왼쪽에있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
초기 단계 8 계란 챔버의 전방 상피 2. 이미지를 그림. (A) 단계 8 느린 경계 세포 (slbo) 유전자 기자 달걀 챔버의 측면보기 : DAPI와 GFP> 표시 등 또는 slbo에 대한 차 항체로 염색 (유전자형 slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19, 20,. 아르마딜로 (ARM)는 β-catenin이의 비행 동체입니다. 앞부분 (A)는 우측 좌측 후방 (P)이다. (BB ') 달걀 차 조망상의 단부mber. 표시된 바와 같이 단계 8 slbo- 유전자 기자 달걀 챔버의 Z 스택 이미지의 3 차원 재구성은 똑바로 차 항체로 염색 탑재. 마젠타 별표 극성 세포를 나타냅니다. DAPI는 핵을 표시합니다. (B ') slbo>가 GFP 만 추정 경계 세포 (SLBO)로 표현된다. E-헤린 (E-CAD)는 테두리 세포에서 막에 지역화 및 농축 유착 분자이다. (B '') 눈 결석 (EYA) 균일 극성 세포를 제외한 모든 모낭 세포의 핵에서 발현 발견된다. (C) 표준 측면 GFP에 대한 DAPI (파란색) 및 항체 (SLBO, 녹색), ARM (적색)로 염색 slbo의 -reporter 단계 8 계란 챔버의보기 및 FAS3 (흰색). 인세 축을 나타낸다 : X 축 (초록색 화살표) 아래이며, Y 축은 왼쪽 (적색 화살표) 방향이고, Z 축은 뷰어 (파란색)을 향한다 (D) 새로운 기술에 관한 비교를 위해. 이 패널은 끝에보기 CREA을 보여줍니다C. 인셋에 도시 달걀 챔버의 측면 이미지 Z 스택을 사용 Volocity 소프트웨어로 처리 삼차원 재구성 의해 테드 턴 축을 나타낸다 : X 축이 다운 (초록색 화살표), Z 축이며 이제 좌측 (파란색 화살표), 및 Y 축 방향으로 뷰어 (적색)을 향한다. 각 셀은 Z 축에 낮은 해상도로 인해 희미된다; 따라서, B에 표시된 새로운 접근 방식은 상당한 이미지 개선을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 스테이지 (8) 달걀 챔버의 모낭 상피 및 전방 측 도메인에 단백질 발현을 비교하는 단계를 포함하는 방법. (A) visgun (VSG)의 단계 8 계란 챔버 -GFP 기자의 측면보기의 재건 <SUP> 21-23, GFP 또는 ARM (흰색)에 대한 항체에 대한 스테인드. DAPI는 파란색으로 핵을 표시하고 큰 간호사 세포 핵은 분명하다. VSG는 모낭 세포의 링 운하 (녹색)에 지역화합니다. (BB ') 최종의 단계 8 VSG-GFP 기자 달걀 챔버의 이미지의 Z 스택의 달걀 chamber.Three 차원 재건의 전망, 염색 차 항체는 표시로. SLBO 단백질 (적색) 극성과 경계 세포핵 모두에서 검출된다. ARM은 여포 세포막을 표시하고 셀 테두리에 농축된다; DAPI는 핵을 레이블. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
초기 단계 9 계란 챔버 4. 이미지를 그림. (A) 초기 단계 9 SL의 측면보기보 -reporter 계란 챔버. 경계 세포 (녹색) 전방 상피 세포 (흰색 화살표) 내에서 클러스터했다. BC) 최종에 계란 챔버의 전망. 초기 단계 9 slbo- 유전자 리포터 계란 챔버로부터 이미지 Z 스택의 3 차원 재구성, 지시 또는 GFP로 단백질에 대해 지시 차 항체를 사용하여 염색이. (B)는 slbo> GFP는 (녹색) 테두리 세포에서 발현되고 , Fasciclin 3 (FAS3가 백색) 두 셀 간의 극성이 높은 막 국소화 동안; DAPI는 핵 (파란색)를 표시합니다. 마젠타 별표 극성 세포를 나타냅니다. (C)를 E-cadherin의가 (E-CAD) 여포 세포의 세포막을 표시하고 DAPI는 핵을 나타내고 두 핵 (활성화) STAT 및 slbo>는 GFP 발현은, 단지 경계 세포에서 발견된다. 마젠타 별표 극성 세포를 나타냅니다. 염색 결과를 개별적으로 slbo에 대해 표시됩니다> GFP (C ')와 STAT (C를' ') 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 말에 관점에서 계란 챔버를 개발, 탑재하는 방법을 설명하고 이미지 작은. 영상 계란 챔버의 일반적인 기술은 측면 플레이에 최적화 된 형광 항체 염색을 할 때 주로 메디 오 - 측면 모낭 세포의 정확한 시각화를 허용하고 있습니다. 여러 초점면을 볼 수있는 Z-스택 또는 3 차원 재구성 보조기구의 사용,하지만 여전히 타원형의 달걀 실 (그림 2D)의 극의 서브 세포 해상도 부족하다. 이에 따라서, 초 - 해상도 이미징 최신 기술 현미경으로 부분적 극복 될 수 있지만, 이러한 방법은 고가이고 항상 사용할 수 없습니다. 초파리는 24, 25은 훨씬 더 작은 달걀 챔버에 사용되는 배아에 대해 우리는 똑바로 이미징 프로토콜을 적용했다. 배아 비교 달걀 챔버 훨씬 작은 크기를 고려하는 방법에있어서 몇 가지 중요한 변경이있다. 설명 된 기술의 핵심 구성 요소는 물리적 인 separ배아의 필요하지 않은 개인 실의 ATION. 또 다른 변화는 (4.4)를 장착하는 동안 제 글리세린 젤리 슬라이드의 사용이다. 계란 챔버의 크기와 다른 계란 챔버에 줄기 세포를 통해 첨부 파일이 바늘 조작을 필요로하고 글리세린 젤리의 파괴로 이어집니다. 따라서, 달걀 챔버 (4.5)를 장착하기위한 새로운 글리세린 젤리 슬라이드에 바늘로 전송해야합니다. 강직 한 이미지는 계란 개발하는 동안 조직 조직에 대한 새로운 정보를 공개, 측면 또는 수평의 전경이 흐려 분야의 시각화 수 있습니다. 이 패터닝 이벤트에 대한 새로운 통찰력을 주도, 우리는이 방법이 oogenesis의 추가 측면을 탐구하는 데 사용될 수 있음을 제안한다.
우리는 성공적인 수직 장착 몇 가지 중요한 단계를 결정했다. 우리는 그것이 필요 해부 동안 칼집에서 완전히 ovariole 체인을 제거하는 것, 원하는 계란 챔버 ovariol에서 잘라해야합니다 발견전자 체인. ovariole에서 무료로 달걀 챔버에 실패 어려운 올바른 단계 달걀 챔버 (4.3 단계)를 선택 할 수 있습니다. 우리는 튜브에 분취하여 그것을 한번에 글리세린 젤리 소량 작업 추천. 반복 가열 일관성을 변경하고 적절하게 (3.1) 고화를 방지하기 때문에 두 배 이상 젤리 더 글리세린 가열하지 마십시오. 피펫으로 젤리를 흡입 방지하기 위해 필터 팁을 사용합니다. 글리세린 젤리가 4 ° C에서 최소 8 시간 동안 현미경 슬라이드에 응고 허용합니다. 이 단계를 단축하는 것은 어려운 계란 챔버 (3.6)를 설치한다. 그것은 장착 달걀 챔버 (4.6)에서 모든 PBS 글리세롤을 흡수 할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 너무 많은 액체가 존재하는 경우, 바닥에 부착 된 글리세린 젤리의 상부층을 방지한다. 이 경우, 계란 챔버 플로트와 위치를 변경할 수 있습니다. 최고의 이미징 결과를 들어, 젤리 블록 글리세린하는 것은 물리적으로 가능한 계란 챔버의 전방 측면 (5.4)에 가깝게 잘라해야합니다. 이에 너무 많은 글리세린 젤리측면으로 인해 표본 및 커버 슬립 사이의 증가 거리 이미지 품질을 감소시킨다.
글리세린 젤리에 샘플을 장착 몇 가지주의 사항이있다. 하나의 경우, 시료와 대물 렌즈 사이의 거리를 증가시킨다. 고배율이 거리는, 대물 오일을 사용하는 동안, 특히, 이미지 품질을 초래할 수 시험편에 집중 어려움을 만들 수있다. 이 감안할 때, 그것은 계란 챔버에 매우 근접 글리세린 젤리 블록을 개척하는 것이 매우 중요합니다. 글리세린 젤리 광학적 분명하지만, 몇 가지 빛을 defract 않습니다. 또 다른 제한은 항체 시그널 인해 작업의 대물 거리 글리세린 젤리의 두께의 조합으로 감소 될 수 있다는 것이다. 일차 항체 및 / 또는 이차 모두의 농도 증가는 종종이 문제를 감소 시키는데 도움을 줄 수있다. 이 항체에 의해 다르지만, 우리는 일반적으로 보조 개미 두 배의 농도를 사용하여 더 나은 이미지를 획득직립 이미징 ibody 표준 촬상 측에서 사용 양에 비해. 우리는 똑바로 달걀 챔버를 장착 젤리 글리세린없이 대안을 알고. 아가 로스 및 폴리 아크릴 아미드와 같은 다른 물질이 시도되었지만 모두 촬상하면서 선명도의 손실을 일으키는 더 많은 광을 심각 defracted. 따라서,이 장착 기술은 표준 현미경에 사용할 현재 사용할 수있는 최선입니다.
우리가 경계 셀 사양 및 운동성의 개시 단계에 초점을 맞춘 반면, 다른 단계의 달걀 챔버는 단지 약간의 손이 프로토콜에서 사용될 수있다. 가장 중요한 것은, 니들의 게이지는 다른 크기 및 발달 단계의 달걀 챔버를 조작하도록 변경 될 수있다. 단계 7-10를 들어, 30 G 바늘 계란 챔버 경사에 쉽게 맞게 잘 때문에 작동합니다. 초기 단계 달걀 챔버 용 큰 게이지 바늘 (작은 베벨) 표기와 마찬가지로 작은 게이지 (큰 경사)에 대해서는 세인트 사용해야세 계란 챔버. 이전 발달 단계에서 무엇이든이 게이지 (4.3)에 대한 너무 큰 것입니다. 또한 계란 챔버 중 어느 쪽을 향해 대물 관심 영역 계란 챔버 글리세린 젤리 블록을 배열하여,이 기술을 이용하여 묘화 될 수있다.
글리세린 젤리 지원 작은 샘플을 설치하는 것은 여러 상황에서 유용 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 이 전략은 단지 하나의 관점에서 샘플을 검사하는 것이 불충분 할 때, 특히 다른 생물로부터 작은, 고정 된 조직의 다른 유형을 시각화하는데 이용 될 수있다. 이 기술을 습득하면, 그것은 달걀 챔버가 젤리에 배치하는 방법에 따라 임의의 원하는 각도로 계란 챔버를 뷰잉하는데 사용될 수있다. 이 방법은 세포 조직의 훨씬 더 입체적인 이해를 만들 순 시청자 수 있습니다. 면역 형광 항체 염색과 함께 계란 챔버 업라이트 촬상 단백질의 정확한 검출을 허용표준 설치 조건에 따라 가능하지 않을 것입니다들과 세포 - 세포 접촉. 우리는 상피의 경계 셀 클러스터의 합체와 분리를 허용하는 세포 - 세포 상호 작용을 매핑에이 방법을 사용할 계획입니다. 이 때, 직립 영상 법 라이브 샘플 사용 할 수있는 것이 아니라,이 장애물을 극복하기 위해 일하고있다. 우리는이 방법은 또한 초파리 oogenesis의 다른 측면의 연구에 적용 할 것으로 예상, 또는 새로운 각도에서 이미지를 다른 작은 조직에 적용 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
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