Introduction
キイロショウジョウバエの研究は、現象の広い範囲の遺伝的調節に大きな洞察を提供してきました。卵形成は、組織パターニング、細胞極性の変化、細胞周期の切り替え、および翻訳調節1,2,3,4を含む多くの異なる発生プロセスを調査する扱いやすい方法を提供するので、特に、卵の開発に関する広範な研究があった。卵形成時の重要な形態形成のイベントは（5で検討）ボーダー細胞と呼ばれる細胞のセットの仕様、運動性の獲得、および移行である。細胞移動するので、動物の形態形成の重要な特徴であり、このプロセスの遺伝的調節は、よく保存されているため、ハエで決定メカニズムは、他の文脈において重要である可能性が高い。従って、我々は国境細胞遊走の分子制御を研究している。私たちの研究のために、我々は、発展途上の卵の前極を観察する新しい方法を開発した、ここで、境界セルは、それらが詳細に開発かを検討するために、発生する。
卵巣内では、様々な発生段階の卵室が薄いシース（ 図1A）に収められていovariolesと呼ばれるチェーンに沿って存在する。各卵室は、1個の卵を形成するために移動します。卵形成の間に、いくつかの異なる細胞型が協調して開発しなければならない。 D.ショウジョウバエの卵室は、単層濾胞上皮6に囲まれた1卵母細胞を含む16生殖細胞から成る。特殊化した細胞の小さな数は、上皮の前部および後部の極で発生する、極性細胞と呼ばれる。 6-8ボーダー細胞は極性細胞5,7により誘導された卵室の前方上皮、に由来する。中期卵形成（ステージ9）では、ボーダー細胞は、その隣人から切り離し、卵室5,7の後部に卵母細胞に到達するために看護師セル間で移動する。この移動は、達成されなければならない境界セルは、この集団の細胞遊走の種類て、2つの非運動性極性細胞の周囲のクラスタに残っている。境界セルクラスタの移行を成功さは受精のために必要がある、卵の殻の卵門の適切な発展を保証します。
前極細胞は、シグナル伝達カスケードを活性化することにより、境界細胞の運命を指示する。ポーラー細胞は卵母細胞の発達8,9の段階8の間に包細胞を、隣接上、Domeless（DOME）、膜貫通受容体に結合するサイトカイン、不対（UPD）を、分泌する。 UPDの結合は、転写のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子（STAT）8,10,11をリン酸化するヤヌスチロシンキナーゼ（JAK）を引き起こす。 STATはその後転写を活性化するために、核に移動します。遅い境界細胞（SLBO）STATの直接的な転写ターゲットであり、また、境界細胞遊走12に必要とされる転写因子である。卵室の側面図は、Tを示している帽子STAT活性は、前方上皮8,11,13-全体の勾配で規制されている。極性細胞に最も近い包細胞は、このように、彼らは国境細胞になると、隣接する生殖系列の組織に侵入、活性化したSTATの最高レベルを持っている。
ボーダー細胞が内で指定されているかを理解し、上皮から切り離すために、我々は組織が編成されているかを観察する必要があります。我々は、前·オン視点から卵室を表示する場合は、極性細胞周囲の毛包細胞中のSTAT活動の放射状の対称性を期待する。エンド上のビューは、より正確に前と異なる焦点面で細胞を比較するより剥離時の膜タンパク質と細胞間のインタフェースの違いを示すであろう。卵室が楕円形と茎細胞によって互いに取り付けられているので、それらが困難前方アーキテクチャを観察すること、横方向にスライド上に沈降する。このように、卵室の極にある細胞に関する多くの情報があります側面図から推測されて。一部の情報は、光退色光セクション、光散乱、のアルゴリズムの3-D再構成、及びZ軸方向の分解能の悪い限界を介して取得することができるが、超解像顕微鏡14のような高価な技術が存在しない場合、この情報は、以下の詳細および信頼性を高める。セクションベースのイメージング（例えば、電子顕微鏡またはミクロトーム切片）他の種類のアーチファクトのために可能性を増加させる、脱水を含む組織の大規模な操作を必要とする。従って、我々は画像Dに新しい方法を開発キイロ卵室直立している。この方法は、すでに（ 審査中で、代表的な結果とマニングらを参照）運動性の細胞が運命づけられているかの解明に有用であることが証明され、卵形成の他の側面の研究でより広く貴重である可能性が高いしている。
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Protocol
Ovariolesの1。解剖
- 追加された活性乾燥酵母を新鮮なフライ食品のバイアルに約15 2-4日齢の雌のハエや少数の男性を転送します。バイアル用のプラグとして綿を使用し、高湿度を保つために綿に水を数滴を追加します。
- 段8-10卵室の数を最大にするために14〜16時間、25℃のインキュベーター内の場所バイアル。
注：インキュベーション時間は、温度および所望の段階に応じて変化する。 - 次の日のために、必要に応じて解剖メディアを準備し、0.1M KPO 4とNP40ソリューションは、（材料を参照）。
- CO 2を使用してハエを麻酔し、解剖顕微鏡下に置く。ピペットガラスうつ病スライド内の各キャビティ内に解剖メディアの数滴。
- 一人の女性フライダウン翼を持つテーブルトップと東洋へ約30度の角度でそれぞれの手で鉗子を持ちます。あなたの非利き手では、Aで彼女を把握し、ピンセットを用いて、女性を拾う胸部の近くに腹部のnterior、およびうつ病のスライド（ 図1Aの挿入図）で解剖メディアに彼女を沈める。
- 鉗子の他のペアで、腹部の腹側後部に外骨格を把握し、を貫通。後部端の卵巣をつかみ、その後腹部からそれらを引き出し、うつ病のスライドの反対側に新鮮な培地に入れる。 （ 図1Aの挿入図）。腸を引き離すことは避けてください。死体を捨てる。
- すべての卵巣を解剖されるまで、他の女性のハエで繰り返します。男性を捨てる。
- 鉗子の1対の、（最大の卵室の近く）の後方端で卵巣を保持し、もう一方の手で最も前方の卵室（germarium）の1を挟ま鉗子のペアを使用。 （ 図1A）。
- ゆっくりと着実に、卵巣シースの外に卵巣小管チェーンを引っ張る。すべての目的の卵室がRになるまで個別にovariolesを解剖していきemoved。
- 繰り返しますが、すべての解剖卵巣のための1.7から1.8を繰り返します。
- 完了したら、プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、0.6ミリリットルチューブにovariolesを移す。
- ovariolesは、チューブの底に沈殿、定着し、染色のステップに進みましょう。
2.免疫蛍光（IF）Ovariolesの染色
- ピペットで注意深くovariolesから解剖メディアを削除する。すべてのovariolesまたは卵室を削除しないように注意してください。 ovariolesと解剖メディアの約50μlのままにしておきます。
- チューブ中の0.1M KPO 4緩衝液150μlの16％パラホルムアルデヒドの50μlのを追加し、それらを修正するために卵室にソリューションを追加します。 10分間ロッキングしながらインキュベートする。注意：ホルムアルデヒドは有毒である。
- 固定液を除去し、0.5ミリリットルNP40の洗浄緩衝液で2回すすぐ。
- RTで15分間ずつ2回洗浄する。
- その後の工程のために、標準的なIFプロトコル15を参照してください。
- 簡単に言えば、固定後に、追加適切な希釈で一次抗体と4℃でO / Nインキュベートする。 （：200希釈液1）二次抗体を追加し、NP40で数回洗浄する。
- NP40中で数回洗浄し、その後DAPI（1：1,000）を追加し、10分間、その後の洗浄を繰り返します。プロトコルが完了したIF回、卵室にPBS中50％グリセロールの200μlを添加し、室温で2時間放置。
- 、溶液を除去し、PBS中70％のグリセロールと交換し、そしてホイルでカバーしています。取り付けの準備が整うまで4ᵒCでサンプルを置きます。一方、ステップ3に進みます。
グリセリンゼリースライド3.事前準備
- スパチュラを使用してゼリーグリセリンの少なくとも4 mlで測定し、ハーフウェイマークにガラス細胞培養管を埋める。 30分間55℃の水浴中でグリセリンゼリーを溶かす。
- 2顕微鏡スライド上に原液からのグリセロールの小滴、約300μLを、注ぐ。組織を使用して、薄い1aにグリセロールを広めるスライドの各々にわたるヤー。これは、ベースを提供し、ステップ5.6で、グリセリンゼリーを容易に除去することができます。
- フィルタリング千μlのピペットチップのオフ先端をカット。各顕微鏡スライドにゼリーゆっくり暖かいグリセリンの1,000〜1,500μLを転送するために使用するカットピペットチップ。バブルを防ぐために注意してください。
- グリセリンゼリースライドを設定するために、室温で5分間座ってみましょう。
- 60ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿内の各グリセリンゼリースライドを配置し、ラップでカバーしています。 4℃CO / Nにおける場所。必要に応じて、ストアは4℃で最長5日間ゼリースライドグリセリン。
4.取付エッグチェンバース
- ステップ2.5、1グリセリンゼリースライド全体で70％のグリセロールで卵室のピペットいくつかの3μlの滴からのサンプルを使用して。すべての卵室は、このスライド上になるまでピペッティング3μlの滴を続行。各ドロップは、少なくとも10卵室が含まれていることを確認してください。一方、55℃の水浴中でグリセリンゼリーの培養管を加熱する。
- 解剖顕微鏡下で卵室とグリセリンゼリースライドを置きます。卵室のみ一滴の視野（ 図1B）になるように倍率を調整する。
- スプーンのように30ゲージの針を用いて、所望の段階の卵室を拾う。必要な場合には、ナイフなどの針を用いて卵巣小管チェーンから目的の卵室を分離する。
- イメージングに干渉する可能性デブリを回避するために、前方（ 図1E -1）左に向けて、第グリセリンゼリースライドに卵室を転送する。少なくとも7つの卵室があるまで繰り返し列（ 図1C）に並んだ。
- すべての目的の卵室は第二グリセリンゼリースライドに転送されるまで、7の新しい列を形成する。
- 組織とねじれの小片を切り取り。軽くそれぞれ1に触れて、卵室から過剰のPBS-グリセロールを吸収するために使用します。卵室を削除しないように注意してください。
- 断つフィルタリング200μlのピペットチップの先端。卵室のすべての列をカバーするために、グリセリンゼリー150μlのを転送するために使用します。
注：列をカバーするのに必要なグリセリンゼリーの量は卵室段と列の数に基づいている。量を調整することができる。 - グリセリンゼリーのトップ層が完全に（ 図1D）固化するまで取り付けられた卵室は室温で5分間座ってみましょう。
- 置き60ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿に搭載された卵室のスライドとは、ラップでカバーしています。 4℃CO / Nでストア（光退色が懸念される場合には、暗所で行わ）グリセリンゼリー層が一緒に固化することを可能にする。
イメージング用エッグチェンバースの5準備
- 解剖顕微鏡下に取り付けられた卵室のスライドを置きます。卵室の1列のみが視野に入るように倍率を調整する。
- 45°の角度ミニチュアメスを用いて、straigをカット（卵室の後側に近い）卵室の最初の列の右側に沿ってhtのライン。 （ 図1D-E）
- 次に、列の最後の卵室上部の最初の卵室の上下にカット。この時点で、卵室の列には、三方をカットする必要があります。
- 卵室（ 図1E -3）の前方側にできる限り近いマイクロナイフ、列の左側に沿ってスライスし、使用。
- カットカラムに冷たい1X PBT100μlのピペット。
- スライド上の残りの部分を残して、卵室のカット列の三辺の周りに余分なグリセリンゼリーを削除し、破棄するように丸い刃へらを使用してください。
- 卵室の前方側で行われたカットでへらを挿入し、主要グリセリンゼリーブロックから列を分離する。
- 反転した（5.8.1）または直立のどちらかのためのサンプル（5.8.2）顕微鏡を準備します。
- 倒立顕微鏡用：転送トン卵室の前方側を下に向けてカバースリップに卵室の彼が列。グリセリンゼリーのすべての列を削除し、マウントされるまで繰り返します5.2から5.8を繰り返します。乾燥からそれらを防ぐために卵室の各ブロックの上に50％のPBS-グリセロールの滴のカップルを追加します。直接カバースリップ上の画像卵室。
- 正立顕微鏡の場合：前方側を上にして顕微鏡スライドに卵室の列を転送します。グリセリンゼリーのすべての列が削除され、顕微鏡スライドにマウントされるまで繰り返します5.2から5.9を繰り返します。 ＃1 1/2カバーガラスで卵室とカバーブロックの各ブロックの上に50％のPBS-グリセロールの滴のカップルを追加します。
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Representative Results
直立イメージング法は、私たちはステージ8の前方濾胞上皮に直接卵胞細胞の運命のための一般的なマーカーを細胞の組織を見ることができ、目の不在（EYA）タンパク質だけでなく、核DNAマーカーDAPIは、さえ発現を示した細胞のこの分野全体で、すべてのセルが同様の染色強度（ 図2B」）で見ることができることを実証した。サイトカインUPDに応答して調節されるタンパク質は、しかし、可変パターンおよび発現レベルを示した。ポーラー細胞が卵の発達16,17のこの段階に頂端の前にUPDをリリースするので、STATが時々そうであった極性細胞、約放射状に活性化されることが予想される。しばしば、しかし、我々はSLBO含むSTATの下流の標的は、より複雑な発現パターンを有していたことを観察した。例えば、SLBO発現のためのGFPレポーターは、ほとんどに登場し、すべてではないが、極性細胞（ 図2Bを囲まれたセルを、そしてマンを参照してください） 当期らる。我々は、接着性の変化を反映している可能性がある、E-カドヘリン発現/局在化（ 図2B '）のわずかな差に気づいたが、より多くの仕事は、この結果を定量化し、解釈するために必要とされる。これらの微妙な段階の卵室の横三次元再構成（ 図2C-D）を介して検出されなかった。毛包細胞の頂端 - 基底軸にも違いが直立の方法を用いて識別することができる。私たちは、形質膜18（ 図3A）の頂端領域に存在するリング運河タンパク質Visgun（VSG）、のためのレポーターラインを使用していました。直立イメージングはVSG発現が極性細胞（ 図3B）の最も狭い部分の近くに、毛包細胞の頂部で検出されたことを確認した。
また、直立撮像方法は、ステージ9卵室内の前部上皮を表示するために良好に機能することを見出した。このdevelの時opmentalステージは、境界セルは、極性細胞（ 図4A）の周りに一緒に融合する。私たちは、エンド·オン·イメージング（ 図4B-C）を使用して、これらの圧縮されたクラスターを観察することができた。 slboの -GFPだけでなく、アクティブ化、核STATは、運動性のボーダー細胞（ 図4Bおよび4C）をマークしながら、ステージ8のように、我々は、すべての上皮細胞（図示せず）でEYA式の同じようなレベルのを発見した。 FAS3タンパク質の局在は、極性細胞極性細胞インタフェース（ 図4B）を示した。 DAPIまたは皮質アクチンのファロイジン染色により示されるように、また、両ステージ8および9に、我々は、この方法は、生殖系列細胞または生殖細胞の研究に有用であることを示唆している（図示せず）、大ナース細胞を見ることができる-follicle細胞の相互作用。
ショウジョウバエの卵室の図1.アップライトの取り付けS。 （A）ショウジョウバエ卵巣卵室、シース、および卵巣小管を示す。描写は卵巣シースからゆっくり卵巣小管を引くための鉗子の位置を示している。挿入図は、解剖用のフライの位置を示しています。女性のハエの腹側は上向き。 ·前方、P-後部。卵室を搭載する（BD）手順。（B）70％のグリセロール-PBSで卵室の小滴、解剖実体顕微鏡下で観察。黄色の矢印は、卵巣小管鎖を示す。黄色の矢印は、個々の卵室を示している。赤い矢印は、グリセロールPBS降下のエッジを示す。固化グリセリンゼリーの薄層上に配置された卵室（C）列。黄色の矢印は、個々の卵室を示している。（D）溶融グリセリンゼリーの第二の薄膜層は、それらを埋め込 む卵室の列をカバーしています。カットが4ᵒCでO / Nインキュベートした後になされるべきであるどこに黄色の点線を示します。赤矢印が示すグリセリンゼリーの二層の端。赤い数字は卵室列（水平頂部及び底部のカットが示されていない）の切断の順序を示す。前方は左にある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
早期8卵室の前上皮の図2.イメージング。ステージの（A）側面図8 遅い境界セル（slbo）遺伝子レポーターの卵室（遺伝子型：slbo -Gal4、UAS-mCD8-GFP）19,20、示されるように、DAPI、一次抗体で染色またはslboための> GFP。アルマジロ（ARM）は、βカテニンのフライホモログである。前方（A）は左に、右に後部（P）。（BB "）エンド上の卵の茶の景色ですmber。ステージのZスタック画像の三次元再8 slbo-遺伝子レポーター卵室が示されているように、一次抗体で染色し、立設。マゼンタアスタリスクは、極性細胞を示す。 DAPIは核をマークします。（B '）slbo> GFPのみ推定ボーダー細胞（SLBO）で表されます。 E-カドヘリン（E-CAD）が境界セル内膜に局在し、濃縮された接着分子である。（B ''）目不在（EYA）均等極性細胞以外のすべての毛包細胞の核で発現したと判定された。（C） （緑SLBO、）GFP、ARM（赤）、およびFAS3（白）に対するDAPI（青）と抗体で染色ステージ8卵室-reporter slboの標準側面図。挿入図は軸を示しています。X軸は（緑の矢印）ダウンして、Y軸は、左（赤矢印）に向かっている、とZ軸はビューア（青）に向かっている（D）新しい技術との比較のために。 、このパネルは、エンドオンビュークレアを示しているC.挿入図に示されている卵室の横方向の画像のZスタックを使用して、Volocityソフトウェアで処理3次元再構成、バイテッドが回さ軸を示しています。X軸がダウンしている（緑の矢印）、Z軸がある今左（青矢印）、Y軸に向けて、視聴者（赤）に向かっている。個々の細胞に起因Z軸方向の低解像度にぼやけている。このように、Bに示す新たなアプローチが重要なイメージング改善を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3ステージ8卵室の濾胞上皮の側方および前方ドメインにおけるタンパク質発現の比較。 visgunのステージ8卵室（VSG）-GFPレポーターの側面図の（A）再構築<SUP> 21-23、GFPまたはARM（白）に対する抗体について染色。 DAPIは、青で核をマークし、大ナース細胞核が明らかである。 VSGは、包細胞（緑）のリング運河に局在する。（BB '）エンド·オン·ステージ8 VSG-GFPレポーターの卵室の像のZスタックの卵chamber.Three次元再構成の景色、で染色一次抗体を、示した。 SLBOタンパク質（赤）は、極性及び境界細胞核の両方で検出される。 ARMは、卵胞細胞膜をマークし、境界セルに富んでいる。 DAPIは核をラベル付けします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
初期段階の図4.イメージング9卵室。 （A）初期段階9のslの側面図BO -reporter卵室。ボーダー細胞（緑）は、前方上皮（白矢印）内のクラスタ化している。 BC）エンド上の卵室の景色。示されるように、タンパク質又はGFPに対する一次抗体を用いて染色した初期段階9 slbo-遺伝子レポーター卵室からの画像のZスタックを三次元再構成、（B）slbo> GFPは境界細胞（緑色）で表される、ファスシクリン3（FAS3、白）は非常に2つの極性細胞間の膜に局在しながら。 DAPIは核（青）をマークします。マゼンタアスタリスクは、極性細胞を示す。（C）E-カドヘリン（E-CAD）を包細胞の膜をマークし、DAPIは核を示している。（活性化）核STATとslbo> GFP発現の両方が、唯一のボーダー細胞に見出されているマゼンタアスタリスクは、極性細胞を示す。染色結果を個別slboのために示されている> GFP（C '）及びSTAT（C'と'） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、エンド·オン視点から卵室を開発し、マウントする方法を説明し、画像小。イメージング卵室のための一般的な技術は、横方向の景色のために最適化し、蛍光抗体で染色したときに主に内外方向包細胞の正確な可視化を可能にしている。複数の焦点面を見るのZ-スタックまたは3次元再構成助剤の使用が、それでも楕円形の卵室（ 図2D）の極の細胞内解像度には不十分である。このような超解像として最新顕微鏡技術を部分的に克服することができるが、これらの方法は高価であり、常に利用可能ではない。我々は、はるかに小さい卵室に使用するショウジョウバエ胚24,25直立イメージングプロトコルを適応している。胚に比べて卵室のはるかに小さいサイズを考慮するための方法でいくつかの重要な変更があります。記載された技術の重要な要素は、物理的なSEPARです胚が要求されていない個々のチャンバ、のATION。もう1つの変更点は、（4.4）を搭載中に第2のグリセリンゼリースライドを使用することである。卵チャンバのサイズおよび他の卵室の茎細胞を介してそれらの結合は、針で操作を必要とし、グリセリンゼリーの破壊につながる。したがって、卵室は、（4.5）を搭載するための新しいグリセリンゼリースライドに針で転送する必要があります。直立イメージングは、卵の開発中に組織編成に関する新しい情報を明らかにし、横方向または水平ビューによってぼやけた領域の可視化を可能にする。これは、パターニングイベントに関する新たな洞察につながった、と私たちは、この方法では卵形成の追加の側面を探求するために使用することができることを提案する。
我々は成功した直立マウントのいくつかの重要なステップを決定した。我々は、それが必要な切開の際にシースから完全に卵巣小管鎖を除去することで、所望の卵チャンバはovariolから切断しなければならないが見出さEチェーン。卵巣小管のない卵室に失敗すると、それは難しい正しい段階の卵室（ステップ4.3）をピックアップすることができます。私たちは、チューブにそれを小分けすることにより、一度にグリセリンゼリー少量の作業をお勧めします。繰り返し加熱は、その一貫性を変更し、適切に（3.1）固化のを防ぐので、倍以上のゼリーよりグリセリン加熱しないでください。ピペッターにゼリーを吸引しないようにするフィルターチップを使用してください。グリセリンゼリーは4℃で少なくとも8時間、顕微鏡スライド上で固化することを可能にする。このステップを短縮することは困難な卵室（3.6）を搭載します。これは、取り付けられた卵室（4.6）からすべてのPBS-グリセロールを吸収することを確認することが重要です。あまりにも多くの液体が存在する場合、それが底に付着グリセリンゼリーの最上層を防ぐ。この場合、卵チャンバはフロート位置を変更することができる。のためにゼリーブロックグリセリン最高の撮像結果は、（5.4）物理的に可能な限り卵室の前方側に近い切断しなければならない。この上にあまりにも多くのグリセリンゼリー側面は、試料とカバーガラスとの間の距離の増加に起因する画像品質を低下させる。
グリセリンゼリーでサンプルを取り付けるいくつかの注意点があります。一つは、試料と対物との間の距離を増加させる。特にオイル対物レンズを用いながら、高倍率でのこの距離は、画質不良が発生することが、困難試料に焦点を作成することができる。これを考えると、卵室に非常に近いグリセリンゼリーブロックを切り開くことが非常に重要である。グリセリンゼリーが光学的に透明であるが、いくつかの光を回折するん。別の制限は、抗体シグナルにより目的とグリセリンゼリーの厚さの作動距離の組み合わせにすることができることである。一次および/または二次抗体の濃度の増加は、時々、この問題を低減するのを助けることができる。それは抗体によって異なりますが、我々は一般的に二重の二次蟻の濃度を使用することによって、より良い画像を取得直立イメージングibodyは、標準的な横方向のイメージングで使用される量と比較した。私たちは直立卵室を取り付けるためのグリセリンゼリーに無い選択肢を知っている。例えば、アガロースおよびポリアクリルアミドのような他の材料を試みたが、すべては、撮像しながら明瞭さの損失を引き起こす、より深刻な光をdefracted。このように、この実装技術は、標準的な顕微鏡で使用するために現在利用可能であることが最適です。
我々は、境界セルの仕様および運動の開始段階に焦点を当てているが、異なる段階の卵室は、いくつかのマイナーな調整と、このプロトコルで使用することができる。最も重要なことは、針のゲージは、異なるサイズおよび発生段階の卵チャンバを操作するために変更することができる。卵室がベベルに簡単にフィットするので、ステージ7-10の場合は、30 G針がうまく機能。初期段階の卵室のために、より大きなゲージの針（小さいベベル）が使用されるべきであり、同様に小さなゲージの（より大きなかさ）が後で目のために使用されるべきである高齢者の卵室。古い発達段階でのものは、このゲージ（4.3）には大きすぎるだろう。また卵室のいずれかの側、目的に向かって、関心領域で卵室のグリセリンゼリーブロックを配置することにより、この技術を使用して画像化することができる。
グリセリンゼリーでサポートされている小さなサンプルをマウントすると、複数のコンテキストで有用である可能性を秘めています。この戦略は、それは単に1つの観点からのサンプルを検査するために不十分である場合は特に、他の生物からの小さな、固定組織の異なるタイプを視覚化するために使用することができる。この技術を習得されると、卵室がゼリーに配置されている方法に応じて、任意の所望の角度で卵室を表示するために使用することができる。この方法は、細胞の組織のより良い三次元の理解を作成するユニーク視聴が可能になります。免疫蛍光抗体染色と組み合わせた卵室の直立画像化は、タンパク質の正確な検出を可能にするsおよび標準取付け条件下では不可能な、細胞 - 細胞接触。私たちは、上皮から境界セルクラスタの合体と分離を可能にする細胞間相互作用のマッピングにこの方法を使用する予定。この時点では、直立イメージング技術は、ライブのサンプルで使用することはできませんが、我々はまた、この障害を克服するために取り組んでいます。我々は、この方法は、ショウジョウバエの卵形成の他の側面の研究に適用されると予想し、または新たな角度で画像他の小さな組織に適合させることができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
