Introduction
Drosophila melanogaster Çalışma olayların geniş bir genetik yönetmelik seyircilerden büyük anlayışlar sağladı. Oogenez doku desen, hücre polarite değişiklikleri, hücre döngüsü anahtarlama ve translasyonel yönetmelik 1,2,3,4 dahil olmak üzere birçok farklı gelişim süreçleri, araştırmak için bir uysal bir yol sağlar, çünkü özellikle, yumurta gelişimi üzerine kapsamlı bir araştırma olmuştur. Oogenez sırasında önemli bir morfojenik olay (5 gözden) sınır hücreleri denilen hücreler bir dizi özellikleri, motilite edinimi ve göç. Hücre göçü beri hayvan morfojenezinin önemli bir özelliğidir ve bu sürecin genetik düzenleme iyi korunduğu için, sinekler belirlenen mekanizmaları diğer bağlamlarda önemli olması muhtemeldir. Böylece, biz sınır hücre migrasyonu moleküler kontrolü araştırıyor. Bizim çalışmalar için, biz yumurta geliştirme ön direkleri gözlemlemek için yeni bir yöntem geliştirdik,Sınır hücreleri ortaya yerlerde, detaylı olarak nasıl geliştiğini incelemek için.
Yumurtalık içinde, çeşitli gelişim aşamalarında yumurta odaları ince kılıf (Şekil 1A) 'de muhafaza edilir ovarioles adı zincirleri boyunca mevcuttur. Her yumurta bir yumurta odası oluşturmak için devam edecektir. Oogenesiz sırasında, çok sayıda, farklı hücre tipleri, bir koordine bir şekilde geliştirilmesi gerekmektedir. D. melanogaster yumurta bölmesi tek katmanlı foliküler epitel 6 ile çevrili bir oosit, aşağıdakileri içeren 16 germ hat hücrelerine oluşur. Kutup hücreleri denilen özelleşmiş hücrelerin az sayıda, epitel anterior ve posterior kutuplarda ortaya çıkar. 6-8 sınır hücreleri kutup hücreleri 5,7 ile uyarılan yumurta odasının ön epiteli, köken. Orta-oogenez (evre 9), sınır hücreleri komşularından ayırmak ve yumurta odasının 5,7 olan posterior oosit ulaşmak için hemşire hücreleri arasındaki göç. Bu hareket yerine getirmesi gerekirSınır hücreleri bu kolektif hücre göçü bir tür yapma, olmayan iki hareketli kutup hücreleri çevreleyen bir kümede kalırken. Sınır hücre kümesinin Başarılı göç döllenme için gerekli olan yumurta kabuğu micropyle, düzgün gelişimini sağlar.
ön kutup hücreleri sinyal iletim dizinini aktive ederek hücre sınır kaderi talimat. Polar hücreler oosit gelişimi 8,9 aşamasında 8 sırasında folikül hücreleri komşu, bir transmembran reseptörü, Kubbesiz (DOME) bağlanan bir sitokin, eşleşmemiş (UPD), salgılarlar. UPD bağlanması Janus tirozin kinaz (JAK) transkripsiyon (STAT) 8,10,11 arasında sinyal ileticisi ve Activator fosforile olur. STAT sonra transkripsiyonu aktive etmek çekirdeğine geçer. Yavaş Sınır Hücreler (SLBO) STAT doğrudan bir transkripsiyonel hedef ve sınır hücre göçü 12 için gerekli olan bir transkripsiyon faktörüdür. Yumurta odaları Yanal manzarası t gösterirşapka STAT etkinliği ön epiteli 8,11,13 boyunca bir degrade düzenlenmiştir. Kutup hücrelere yakın folikül hücreler bu nedenle sınır hücreleri haline ve komşu germ-line doku istila, aktif STAT en yüksek seviyeleri var.
Sınır hücreleri içinde belirtilen ve epitel ayırmak nasıl anlamak için, biz doku nasıl düzenlendiğini gözlemlemek gerekir. Biz bir ön-perspektif yumurta odaları görmek, biz kutup hücreleri çevreleyen folikül hücreleri STAT aktivitesinin radyal simetri beklenebilir. Bir son bakış da daha doğru önce ve farklı odak düzlemlerinde hücreleri karşılaştırma daha Ayırma sırasında zar proteinleri ve hücre-hücre arayüzleri farklılıklar gösterir. Yumurta odaları dikdörtgen ve sap hücreleri birbirine bağlı olduğundan, onlar zor ön mimarisi gözlemlemek için yapım, yanal slaytlar üzerine yerleşmek. Böylece, yumurta odasının kutuplarda hücreler hakkında çok bilgi vardırLateral manzaralı olayla edilmiştir. Bazı bilgiler Photobleaching optik bölümlerde, ışık saçılması, algoritmik 3-D rekonstrüksiyon ve Z-ekseninde çözünürlük yoksul limitler aracılığıyla elde edilebilmesine rağmen süper çözünürlüklü mikroskopi 14 gibi pahalı tekniklerin yokluğunda bu bilgilerin daha az detaylı ve güvenilir hale . Bölüm-tabanlı görüntüleme diğer şekillerde (örneğin, elektron mikroskobu veya mikrotom kesit) eserler için olasılığını artırarak, dehidrasyon dahil dokuların, geniş manipülasyon gerektirir. Böylece, biz görüntü D. yeni bir yöntem geliştirdi dik iken melanogaster yumurta odaları. Bu yöntem zaten (inceleme altında Temsilcisi sonuçları ve Manning ve arkadaşları, bakınız) hareketli hücreler kaderde nasıl durulaştırmada yararlı kanıtlanmış ve daha geniş değerli oogenezisin diğer yönleri çalışmalarda olması muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ovarioles 1. Diseksiyon
- Ilave aktif kuru maya ile taze sinek gıda flakon yaklaşık onbeş 2-4 gün eski erkek sineklerin ve birkaç erkek aktarın. Şişelerde için fiş olarak pamuk kullanın, ve yüksek nem tutmak için pamuk su birkaç damla ekleyin.
- 14-16 saat için 25 ° C inkübatör yerleştirin flakon aşaması 8-10 yumurta odaları sayısını en üst düzeye çıkarmak için.
Not: Kuluçka süresi sıcaklığa ve istenilen aşamasına bağlı olarak değişmektedir. - Bir sonraki gün için gerektiği gibi diseksiyon medya hazırlayın, 0.1M KPO 4 ve NP40 çözümleri (Malzeme).
- CO 2 kullanarak sinek anestezisi ve bir diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Pipetleyin cam depresyon slayt her boşluğuna diseksiyon medya birkaç damla.
- Bir kadın sinek aşağı kanatları ile masa üstü ve yönlendirmek için yaklaşık 30 ° açıyla her el forseps tutun. Senin baskın olmayan el ile, a onu kavrayarak, forseps kullanarak kadın pick upToraks yakın karın, bir nterior ve depresyon slayt (Şekil 1A içerlek) diseksiyon ortama onu daldırın.
- Forseps diğer çift, karın ventral posterior Exoskeleton kavramak ve delip. Posterior sonunda yumurtalıkları tut, sonra karın çekip çıkarın ve depresyon slayt diğer tarafında taze ortama yerleştirin. (Şekil 1A ek). Gut ayrı çekerek kaçının. Karkas atın.
- Tüm yumurtalıkların disseke kadar diğer kadın sinekler tekrarlayın. Erkek atın.
- Forseps bir çift, (büyük yumurta odaları yakınında) arka ucunda bir yumurtalık tutun ve diğer elinizle en ön yumurta odaları (germarium) birini çimdik forseps bir çift kullanın. (Şekil 1A).
- Yavaş ve istikrarlı, yumurtalık kılıfın dışında bir ovaryol zinciri çekin. İstenen tüm yumurta odaları r kadar tek tek ovarioles teşrih devamemoved.
- Tekrar tüm disseke yumurtalıklar için 1,7-1,8 adımları.
- Tamamlandığında, plastik transfer pipet kullanarak 0.6ml tüp ovarioles aktarın.
- Ovarioles, tüpün dibine çöker sonra sabitleme ve boyama adımlara devam edelim.
Ovarioles 2. Immunofluorescent (IF) Boyama
- Dikkatle bir pipet ile ovarioles gelen diseksiyon ortamı çıkarın. Herhangi bir ovarioles veya yumurta odaları kaldırmak için emin olun. Ovarioles ve diseksiyon medya yaklaşık 50 ul bırakın.
- Bir tüp içinde 0.1 M KPO 4 Tampon 150 ul% 16 paraformaldehit 50 ul ekle ve bunları çözmek için yumurta odalarına solüsyonunu ilave edin. 10 dakika süre ile sallanan kuluçkalayın. DİKKAT: paraformaldehit toksiktir.
- Fiksatif çıkarın ve 0.5 ml NP40 yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
- 15 dakika oda sıcaklığında her biri için iki kez yıkanır.
- Sonraki adımlar için standart IF protokol 15 bakın.
- Kısaca, tespit sonrasında, eklemekUygun seyreltmede primer antikorlar ile 4 ° C'de O / N inkübe edin. (: 200 seyreltmeler 1) sonra ikincil antikorlar ekleyin, NP-40 birkaç kez yıkayın.
- NP40 birkaç kez yıkayın, sonra DAPI (1: 1000) ekleyin, 10 dakika boyunca, daha sonra yıkama tekrarlayın. Protokol tamsa sonra, yumurta odalarına PBS içinde% 50 gliserol, 200 ul ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- , Çözüm çıkarın PBS içinde% 70 gliserol ile değiştirin, ve folyo ile kaplayın. Montaj için hazır olana kadar 4 ᵒC de örnek yerleştirin. Bu arada, adım 3 ile devam edin.
Gliserin Jelly Slaytlar 3. Ön Hazırlıklar
- Jöle gliserin, bir spatula ile en az 4 ml ölçün ve yarım işareti cam hücre kültürü tüp doldurun. 30 dakika boyunca 55 ° C'de bir su banyosu içinde gliserin jöle eritin.
- İki mikroskop slaytlar üzerine stok çözeltisinden gliserol küçük bir damla, yaklaşık 300 ul, dökün. Bir dokuyu kullanarak, ince la gliserol yayıldıyer'de slaytlar her karşısında. Bu temel sağlar ve adım 5.6 de gliserin jöle kolay çıkarılması için izin verir.
- Filtrelenmiş 1.000 ul pipet kapalı ucu kesin. Kullanım kesme pipet yavaş yavaş her mikroskop lamı sıcak gliserin jöle 1000-1500 ul aktarmak için. Kabarcıklarını önlemek için özen gösterin.
- Gliserin jöle slaytlar ayarlamak için oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
- 60 mm x 15 mm petri her gliserin jöle slayt yerleştirin ve plastik wrap ile kaplayın. 4 ° CO / N Place. İsteğe bağlı olarak, mağaza 4 ° C'de en fazla 5 gün jöle slaytlar gliserin.
4. Yumurta Chambers Montaj
- Adım 2.5, bir gliserin jöle slayt genelinde% 70 gliserol yumurta odaları pipet birkaç 3 ul damla örnekler kullanma. Tüm yumurta odaları bu slaytta kadar pipetlenmesi 3 ul damla devam edin. Her damla, en az on yumurta odaları içerdiğinden emin olun. Bu arada, 55 ° C su banyosu içinde gliserin jöle kültür tüpü ısı.
- Bir diseksiyon mikroskop altında yumurta odaları ile gliserin jöle slayt yerleştirin. Yumurta bölmelerin tek bir damla görüş alanı (Şekil 1B) olacak şekilde büyütme ayarlayın.
- İstenilen sahne yumurta odasını pick up, bir kaşık gibi 30 iğne kullanma. Ne zaman bir bıçak gibi iğne kullanılarak bir ovaryol zinciri gerekli, ayrı istenen yumurta odaları.
- Görüntüleme engel olabilir enkaz önlemek için, sol (Şekil 1E -1) bakan anterior, ikinci gliserin jöle slayt yumurta odasına aktarın. En az yedi yumurta oda, bir sütun (Şekil 1C) dizilmiş kalmayana kadar yineleyin.
- İstenen tüm yumurta odaları ikinci gliserin jöle slayt transfer kadar yedi yeni sütunlar oluşturur.
- Doku ve büküm küçük bir parça koparın. Hafifçe her birine dokunarak yumurta odalarından fazla PBS-Gliserol emmek için bunu kullanın. Yumurta odalarına kaldırmak değil dikkat edin.
- Ayırmakfiltrelenmiş 200 ul pipet ucu. Yumurta odalarının tüm sütunları kapsayacak şekilde jöle gliserin 150 ul aktarmak için bunu kullanın.
NOT: sütunları karşılamak için gerekli gliserin jöle miktarı yumurta odası aşamaları ve sütun sayısına bağlıdır. Miktarı ayarlanabilir. - Gliserin jöle üst tabakası tamamen (Şekil 1D) katılaşmış kadar monte yumurta odaları oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
- Place 60 mm x 15 mm petri monte yumurta odaları slayt ve plastik wrap ile kaplayın. 4 ° CO / N Mağaza (photobleaching hakkında endişe varsa karanlıkta yer) gliserin jöle katmanları bir araya katılaşmaya izin.
Görüntüleme Yumurta Odaları 5. hazırlanması
- Bir diseksiyon mikroskobu altında monte yumurta odaları slayt yerleştirin. Yumurta bölmelerin sadece bir sütun görüş alanında olacak şekilde büyütme ayarlayın.
- 45 ° açı minyatür neşter kullanarak, bir straig kesti(yumurta odaları arka tarafına yakın) yumurta odaları ilk sütunun sağ tarafı boyunca ht hattı. (Şekil 1D-e)
- Sonraki, sütundaki son yumurta odasının üstündeki ilk yumurta odasının üstünde ve altında kesti. Bu noktada, yumurta bölmelerin kolon üç tarafı kesilmelidir.
- Yumurta odalarına (Şekil 1E -3) ön tarafına mümkün olduğunca yakın bir microknife, sütunun sol tarafındaki dilim, kullanma.
- Kesim sütun üzerinde soğuk 1X PBT 100 ul pipet.
- Slaytta kalanı bırakarak, yumurta odaları ve atın kesme sütunu üç tarafı etrafında aşırı gliserin jöle kaldırmak için bir yuvarlak kenarlı spatula kullanın.
- Yumurta odalarının ön tarafında yapılan kesim spatula yerleştirin ve birincil gliserin jöle bloğundan sütun ayrı.
- Örnekleri için ya ters (5.8.1) veya dik (5.8.2) mikroskopi hazırlayın.
- Ters Mikroskop için: Devir tYumurta odalarının ön tarafı aşağı bakacak şekilde bir lamel yumurta odalarından o sütun. Gliserin jöle tüm sütunlar kaldırıldı ve monte edilene kadar tekrarlayın 5,2-5,8 adımları. Kurumasını önlemek için yumurta odaların her blok üzerine,% 50 PBS-Gliserin birkaç damla ekleyin. Doğrudan lamel Görüntü yumurta odaları.
- Dik Mikroskop için: ön tarafı yukarı bakacak şekilde bir mikroskop lamı yumurta odalarının sütun aktarın. Gliserin jöle tüm sütunlar kaldırıldı ve mikroskop slaytlar üzerine monte edilene kadar tekrarlayın 5,2-5,9 adımları. # 1 ½ lamel ile yumurta odaları ve kapak blok, her blok üzerine% 50 PBS-Gliserin birkaç damla ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
dik görüntüleme yöntemi bize aşamada 8. anterior foliküler epitel hücrelerinin doğrudan organizasyonu görmek için izin bir folikül hücre kaderi için genel işaretleyici, Gözler Yok (EYA) proteini, yanı sıra nükleer DNA işaretleyici DAPI, hatta ifade gösterdi hücrelerin bu alan boyunca ve tüm hücreler içindeki boyama yoğunlukları (Şekil 2B ") ile görülebilir gösterdi. Sitokin UPD yanıt olarak ayarlanır proteinler Bununla birlikte, değişken şekilleri ve sentezleme seviyeleri göstermiştir. Polar hücreler yumurta gelişiminin 16,17 Bu aşamada apikal önce UPD'yi serbest, bu yüzden STAT bazen böyleydi kutup hücreleri, hakkında radyal aktive edilmesi bekleniyor. Çoğu zaman, ama biz SLBO dahil STAT aşağı akış hedefleri, olduğu görülmektedir, daha karmaşık ekspresyonu vardı. Örneğin, SLBO ifade GFP muhabiri, ama hepsi değil, çoğu polar hücreleri çevrili hücreleri (Şekil 2B ortaya çıktı, ve Mann görmeking ve inceleme altında ark). Biz yapışma değişiklikleri yansıtıyor olabilir E-kaderin ifadesi / yerelleştirme (Şekil 2B ') hafif farklılıklar, fark, ancak daha fazla çalışma ölçmek ve bu sonucu yorumlamak için gerekli olacaktır. Bu inceliklerini sahnelenen yumurta odaları yanal üç boyutlu rekonstrüksiyon (Şekil 2C-D) ile saptanabilir değildi. folikül hücrelerinin apikal-bazal ekseninde farklılıklar dik yöntemi kullanılarak ayırt edilebilir. Biz plazma zarlarının 18 (Şekil 3A) apikal bölgede mevcut olan halka kanal proteini Visgun (VSG), bir muhabir hattı kullanılır. Dikey görüntüleme teyit VSG sentezleme polar hücreleri (Şekil 3B) en dar kısmına yakın, folikül hücreleri ve tepe kısmı tespit edilmiştir.
Biz de dik görüntüleme yöntemi aşaması 9 yumurta odaları ön epitel görüntülemek için iyi çalıştığını bulduk. Bu devel atgelişimsel aşama, sınır hücreleri kutup hücreleri (Şekil 4A) etrafında bir araya birleşerek. Biz sonuna üzerine görüntüleme (Şekil 4B-C) kullanarak bu sıkıştırılmış kümeleri gözlemlemek. Slbo GFP hem de aktif, nükleer STAT hareketli sınır hücreleri (Şekil 4B ve 4C) işaretli ise aşama 8'de olarak, bütün epitelyal hücreleri (şekilde gösterilmemiştir) içinde EYA ifade benzer seviyelerde bulundu. Fas3 protein lokalizasyonu polar hücre polar hücre arabirimi (Şekil 4B) göstermektedir. DAPI veya bu yöntem aynı zamanda germline hücreler ya da üreme hücresinin çalışma yararlı olacaktır göstermektedir kortikal aktin (gösterilmemiş olan) bir falloidin lekelenmeye ile gösterildiği gibi, ek olarak, her iki aşamada 8 ve 9 biz, büyük hemşire hücreleri görmek olabilir -follicle hücre etkileşimleri.
Drosophila yumurta odasının Şekil 1. Dikey montajs. (A) Drosophila yumurtalık yumurta odası, kılıf ve ovaryol belirten. Tasviri yumurtalık kılıftan yavaşça ovaryol çekmek için forseps konumunu göstermektedir. Ankastre diseksiyon için sinek yerlerini gösterir. Kadın sinek ventral tarafı yukarı dönük. A-anterior, P-arka. Yumurta odaları montaj (BD) Prosedür. (B)% 70 gliserol-PBS yumurta odaları küçük bir damla, bir diseksiyon stereomicroscope altında inceledi. Sarı ok bir ovaryol zinciri gösterir; san bir ok bağımsız bir yumurta bölmesini gösterir. Kırmızı ok Gliserol-PBS damla kenarını gösterir. Katılaşmış gliserin jöle ince bir tabaka üzerinde düzenlenmiş yumurta odaları (C) Sütunlar. Sarı ok bireysel yumurta odasını gösterir. (D) erimiş gliserin jöle ikinci ince tabaka onları gömmek için yumurta odası sütunları kapsar. Keser 4ᵒC O / N kuluçkadan sonra yapılmalıdır nerede sarı noktalı çizgi gösterir. Kırmızı ok gösterirgliserin jöle ikinci tabakanın kenarı. Kırmızı sayılar yumurta odası sütunları (yatay üst ve alt kesim gösterilmemiştir) kesme sırasını gösterir. Ön solunda. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Erken evre 8 yumurta odasının ön epiteli 2. Görüntüleme Şekil. (A), bir sahne 8 yavaş sınır hücreleri (slbo) raportör gen yumurta hücresinin yan görünüşüdür: DAPI ve GFP> belirtildiği gibi ya da slbo için primer antikorlar ile lekelendi (genotip slbo -Gal4, UAS bunun ardından mCD8-GFP) 19,20. Armadillo (ARM) β-katenin uçucu homologudur. Anterior (A) sağa sola, arka (P) olduğunu. (BB ") bir yumurta cha manzaralı sonu-onmber. Belirtildiği gibi bir sahne 8 slbo- gen muhabiri yumurta odasının Z-yığın görüntüleri üç boyutlu rekonstrüksiyon dik, primer antikorlar ile boyandı monte. Eflatun yıldız kutup hücreleri göstermektedir. DAPI çekirdekleri işaretler. (B ') slbo> GFP sadece olası sınır hücreleri (SLBO) olarak ifade edilir. E-kadherin (E-TRY) sınır hücrelerinde zarında lokalize olmuş ve zenginleştirilmiş bir adezyon molekülüdür. (B ') Göz Yok (EYA) eşit kutuplu hücreleri hariç, tüm folikül hücrelerin çekirdeklerinde ifade bulunur. (C), Standart yanal GFP karşı DAPI (mavi) ve antikorlar (SLBO, yeşil), ARM (kırmızı) ile boyandı bir slbo -reporter sahne 8 yumurta odasının görünümü ve Fas3 (beyaz). Ankastre eksenlerini gösterir: X-ekseni (yeşil ok) aşağı, Y ekseni sola (kırmızı ok) doğru ve Z-ekseni görüntüleyici (mavi) doğru olan (D) yeni tekniği Karşılaştırma için. Bu paneli uç üzerinde görünüm yaratmasını gösterirC. Ankastre gösterilen yumurta hücresinin yan görüntüleri Z-yığını kullanarak, Volocity yazılımı ile işlenmiş üç boyutlu rekonstrüksiyon ile ted döndü eksenlerini gösterir: X-ekseni aşağı (yeşil ok), Z-ekseni Şimdi sola (mavi ok) ve Y-eksenine doğru görüntüleyici (kırmızı) doğru olduğunu. Bireysel hücreleri Z-ekseninde düşük çözünürlükte nedeniyle bulanık; Böylece, B gösterilen yeni bir yaklaşım önemli bir görüntüleme iyileşmeyi temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. bir sahne 8 yumurta odasının foliküler epiteli lateral ve anterior etki protein ifadesini karşılaştırılması. (A) visgun (VSG) bir sahne 8 yumurta odasının GFP muhabiri bir yan bakış İmar <sup> 21-23, GFP veya ARM (beyaz) karşı antikorlar için boyandı. DAPI mavi çekirdekleri işaretleri ve büyük hemşire hücre çekirdekleri belirgindir. VSG folikül hücreleri halka kanallar (yeşil) lokalize. (BB ') Son bir sahnede 8 VSG-GFP muhabiri yumurta odası görüntülerinin Z-yığını bir yumurta chamber.Three boyutlu rekonstrüksiyon manzaralı, lekeli Birincil antikorlar olarak gösterilir. SLBO proteini (kırmızı), polar ve sınır hücre çekirdeğinde hem de tespit edilir. ARM folikül hücre zarlarını işaretler ve sınır hücrelerinde zenginleştirilmiştir; DAPI çekirdekleri etiketler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Erken evre 9 yumurta odaları 4. Görüntüleme Şekil. (A) erken evre 9 sl Yanal görünümübo -reporter yumurta odası. Sınır hücreleri (yeşil) ön epiteli (beyaz ok) içinde kümelenmiş var. BC) End-yumurta odaları manzaralı. Bir erken evre 9 slbo- raportör gen yumurta odası görüntüleri bir Z yığının üç boyutlu yeniden yapılandırma, gösterilen veya GFP gibi proteinlere karşı yönelmiş primer antikorlar ile boyandı. (B) slbo> GFP (yeşil) sınır hücrelerinde ifade edilir , fasciclin 3 (Fas3, beyaz), iki kutuplu hücreler arasında zara yüksek lokalize etmektedir; DAPI çekirdekleri (mavi) işaretler. Eflatun yıldız kutup hücreleri gösterir. (C) E-kaderin (E-CAD) folikül hücreleri zarlarını işaretler ve DAPI çekirdekleri gösterir Her iki nükleer (aktif) STAT ve slbo> GFP, sadece sınır hücrelerinde bulunurlar. Eflatun yıldız kutup hücreleri göstermektedir. Boyama sonuçları ayrı ayrı slbo için gösterilmiştir> GFP (C ') ve STAT (C') Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir son perspektif yumurta odaları gelişmekte, montaj için bir yöntem tarif ve görüntü küçük. Görüntüleme yumurta odaları için ortak teknikler yanal görünümler için optimize edilmiş ve floresan antikorlar ile boyanmış zaman öncelikle iç-dış folikül hücreleri hassas görselleştirme izin vardır. Birden fazla odak düzlemleri görüntüleme Z-yığınlarının veya 3-D rekonstrüksiyonlar yardımcıları kullanımı, ama yine de eliptik yumurta odaları (Şekil 2B) kutuplarının alt hücresel çözünürlük için yetersiz. Bu tür süper-çözünürlük görüntüleme gibi yeni mikroskopi teknikleri ile kısmen aşılabilir iken, bu yöntemler pahalı ve her zaman kullanılabilir değildir. Drosophila 24,25 çok daha küçük bir yumurta odaları için kullanılacak embriyolar için biz dik görüntüleme protokolleri adapte edilmiştir. Embriyoların göre yumurta bölmelerin çok daha küçük bir boyutu için hesap yöntemde birkaç önemli değişiklikler vardır. Anlatılan tekniğin önemli bir bileşeni, fiziksel separ olanembriyoların gerekli değildir her bir kabin, bir tirme. Başka bir değişiklik (4.4) montaj sırasında ikinci bir gliserin jöle slayt kullanılmasıdır. Yumurta odalarının büyüklüğü ve diğer yumurta odalarına sap hücreleri aracılığıyla bağlantı iğne ile manipülasyon gerektirir ve gliserin jöle imha yol açar. Bu nedenle, yumurta odalar (4.5) monte etmek için bir yeni gliserin jöle slayt, bir iğne ile, aktarılmalıdır. Dik görüntüleme yumurta gelişimi sırasında doku kuruluş hakkında yeni bilgiler açığa yanal veya yatay izleme bulanık alanlar görselleştirme sağlar. Bu desenlendirme olaylar yeni anlayışlar neden, ve biz bu yöntem oogenezisin ek yönlerini keşfetmek için kullanılan olabileceğini öneriyoruz.
Biz başarılı dik montaj birkaç kritik adımlar tespit ettik. Biz gerekli diseksiyonu sırasında kılıf tamamen ovaryol zincirleri kaldırmak için, ve istenen yumurta odaları ovariol kesilmiş olmalıdır bulunduE zinciri. Ovaryol ücretsiz yumurta odalarına Başarısızlık zor, doğru aşama yumurta odasını (adım 4.3) almak için yapar. Biz tüpler içine aliquoting bir defada gliserin jöle küçük miktarlarda çalışma öneriyoruz. Tekrarlanan ısıtma kıvamını değiştirir ve düzgün (3.1) katılaşmasını önler, çünkü iki katından fazla jöle fazla gliserin ısı etmeyin. Pipet içine jöle aspire önlemek için filtre ipuçlarını kullanın. Gliserin jeli, 4 ° C'de en az 8 saat için bir mikroskop lamı üzerine katılaşmaya izin verin. Bu adımı kısaltılması zor yumurta odaları (3.6) montaj yapar. Bu monte yumurta odaları (4.6) tüm PBS-gliserol absorbe emin olmak için önemlidir. Çok fazla sıvı varsa, bu alt yapışmasını gliserin jeli üst tabakası önler. Bu durumda, yumurta odaları yüzer ve konumunu değiştirebilirsiniz. En iyi görüntüleme sonuçları için jöle blokları gliserin gibi fiziksel olarak mümkün yumurta odalarının ön tarafına (5.4) yakın olarak kesilmelidir. Bu çok fazla gliserin jöleYan nedeniyle numune ve lamel arasındaki mesafenin artması görüntü kalitesini düşürür.
Gliserin jöle örnekleri montaj bazı uyarılar vardır. Biri için, bu örnek ve objektif arasındaki mesafeyi arttırır. Yüksek büyütmede Bu mesafe, bir yağ objektif kullanırken özellikle ederken, kötü görüntü kalitesine neden olabilir numune, odaklanan zorluk yaratabilir. Bu göz önüne alındığında, yumurta odalarına çok yakın gliserin jöle blokları bölmek için çok önemlidir. Gliserin jeli, optik bakımdan saydam olmakla birlikte, bazı ışık defract yapar. Başka bir sınırlama antikor sinyali nedeniyle çalışma hedefi mesafe ve gliserin jöle kalınlığının bir arada azalabilir olmasıdır. Antikorlar, birincil ve / veya ikincil hem de konsantrasyona kadar bir artış, bazen bu sorunu azaltılmasında yardımcı olabilir. Bu antikor göre değişir rağmen, biz genellikle ikincil karıncanın çift konsantrasyonu kullanılarak daha iyi görüntüleri eldedik görüntülemede ibody standart yanal görüntülemede kullanılan miktara göre. Biz dik yumurta odaları montaj için jöle gliserin hiçbir alternatifi biliyorum. Örneğin agaroz ve poliakrilamid gibi başka malzemeler denendi ancak tüm görüntüleme sırasında açıklık kaybına neden olacak daha ciddi ışık defracted. Böylece, bu montaj tekniği, standart mikroskobu ile kullanılmak üzere şu anda en iyisidir.
Biz sınır hücre şartname ve motilite başlama aşamalarında odaklanırken, farklı aşamalarında yumurta odaları sadece birkaç küçük ayarlamalar ile bu protokolde kullanılan olabilir. En önemlisi, iğne göstergesi farklı boyut ve gelişim aşamalarının yumurta odaları işlemek için değiştirilebilir. Aşamaları 7-10 için, 30 G iğne yumurta odaları eğimin kolayca uyum iyi çünkü çalışır. Önceki aşama yumurta odaları için daha büyük bir iğne (küçük konik) kullanılmalı ve benzer küçük bir göstergesi (büyük eğim), daha sonra st için kullanılmalıdıryaşlı yumurta odaları. Eski gelişimsel aşamada bir şey bu gösterge (4.3) için çok büyük olacaktır. Ayrıca yumurta odasının herhangi bir yan amaca yönelik ilgi alanı ile yumurta odaları gliserin jöle bloğu düzenleyerek bu tekniği kullanarak görüntülü olabilir.
Gliserin jöle desteklenen küçük numune montaj birden fazla bağlamda yararlı olma potansiyeline sahiptir. Bu strateji sadece tek bir bakış açısı ile ilgili örnekleri incelemek için yeterli olacaktır, özellikle, diğer organizmalardan, küçük, sabit dokuların farklı görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Bu teknik, hakim sonra, yumurta odaları jöle konumlandırılmış şekline bağlı olarak, istenen herhangi bir açıda yumurta odaları görüntülemek için kullanılabilir. Bu yöntem hücresel organizasyonun çok daha iyi üç boyutlu bir anlayış oluşturmak eşsiz manzarası için izin verir. Immünofloresan antikor boyama ile birlikte yumurta odalarının Dik görüntüleme proteinin hassas tespiti için izin verirStandart montaj koşullar altında mümkün olmazdı s ve hücre-hücre rehber. Biz epitel hücre sınır küme kaynaşmasını ve dekolmanı izin hücre-hücre etkileşimleri haritalama bu yöntemi kullanmayı planlıyorsanız. Şu anda, dik görüntüleme tekniği canlı örnekleri ile kullanılamaz, ama biz de bu engeli aşmak için çalışıyoruz. Bu yöntem aynı zamanda, Drosophila oogenezisin diğer yönlerini incelemek için de geçerli olacaktır tahmin veya yeni açılarda görüntü diğer küçük dokulara uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
