Summary
そのサイズ、可用性、むしろ従順行動によるラットは、長年の研究モデルとして利用されている。このプロトコルの目的は、慢性創傷の病態生理学に貴重な洞察を提供するために、虚血皮膚創傷治癒モデルとしてラットを利用することである。
Abstract
ヒトでの慢性創傷の傾向は、そのような原因不動に糖尿病や障害のある心血管機能、および単調な圧力などの老化、疾患状態に伴って増加する。動物モデルは、慢性創傷の複雑さの理解を促進する目的で、これらの条件を模倣しようと試みて開発されてきた。本明細書に記載されたモデルは、虚血になる傷が生じる血流量の長期の減少を可能にするラット虚血皮膚弁モデルであり、慢性創傷の表現型に似ている（縮小血管新生、炎症および遅延創傷閉鎖の増加）。それは、対照としてフラップに横方向中央に2虚血性創傷及び2非虚血性の傷付きbipedicled背側フラップで構成されています。この虚血皮膚弁モデルに対する新規追加は、障壁として機能するフラップの下のシリコンシートと血管再生を防止し、創傷が治癒するように収縮を低減するスプリントの配置である。にもかかわらず人間に比べて、それらは全く異なる解剖学的および生理学的な違いのための研究を、創傷治癒のためにラットを用いての議論（ すなわち、皮筋層の筋肉、短い寿命、毛包の数が増加し、感染した傷を癒すする能力の有無）このモデルで採用の変更は、それ以前に開発された虚血性皮膚弁モデルへの貴重な代替手段にする。
Introduction
効果的な薬剤開発やその他の創傷治癒治療薬は人間の治療を1に動物モデルでの調査結果を翻訳における既知の問題にもかかわらず、in vivoモデルで適切な必要とする。以下は、病理学的なメカニズムは、創傷治癒のさらなる理解を調査するために、虚血皮膚創傷治癒のラットモデルを使用するための詳細なプロトコールを説明する。ラット種は、しばしば、その広い利用可能性、大きさに起因して採用し、切開し、切除創傷、イメージング及び組織採取2適した皮膚領域を提供するのに十分な大きさであるように従順な性質は、創傷治癒研究に使用される。しかしそれはラットのように緩い皮の動物と呼ばれていると、ラットおよびヒトの皮膚は解剖学的に異なっている慎重に考慮に入れるべきである。この明確な特徴は、ラットの皮膚の閉鎖ワットに大きく貢献するというよりも、上皮形成、創傷収縮が可能にounds 2。さらに、ラットにおける皮下皮筋層の筋の存在は、収縮およびコラーゲン形成3,4の両方によって治癒に寄与する。これらの非常に重要な解剖学的な違いは、ラット虚血皮膚創傷モデルの開発において考慮され、特定の改変は、創傷収縮を減少させ、皮筋層の筋5の影響を低減するために実施された。
糖尿病性足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、および褥瘡では、治癒が遅延され、これらの創傷は、慢性と見なされる。創傷は、創傷修復6の次の段階に進むの傷を防止する過剰な炎症によって特徴付けられる。慢性創傷の開発における主な要因の1つは、炎症をクリアすることができないことに寄与して局所的な組織虚血（血流低下）5である。このモデルは2003-4で開発され、（検証された時間で、）、創傷床、正常な創傷治癒中にキーステージと、このモデル5を開発するための動機で血管新生の誘導を試験するために十分な組織を提供することができる標準化された動物モデルは存在しなかった。つまり、ここで紹介するモデルは、チェンらによって修正された形で使用する元々シュワルツら 7、その後で記述虚血性創傷モデルの変形である、と述べた。8
修正された虚血性創傷モデルでは、変更はなく、上皮化よりも収縮によって治癒につながるラットの上記の解剖学的特性を回避するために行われています（1）2つの全層切除創傷はbipedicled背面皮膚フラップと内に作成されている皮筋層カルノーサス筋肉は単に筋肉の筋膜の上に解剖することにより、創傷床から削除されます。 （2）フラップ自体は、血液供給がランダムであり、傷をtの中間点に位置することを確実にする、より狭い寸法を有している彼はフラップ虚血である。 （3）Aシリコーンシートは、下にある組織からのフラップの再付着および再灌流を防止フラップの下に挿入されている。創傷収縮は、アンカーやシリコーンシート5にフラップを縫合することによって（排除しない）制限されています。
モデルは、最近、老齢ラット11対若年における虚血性創傷治癒に9,10治癒 、虚血性創傷における高圧酸素効果に至るまでの研究で使用されており、長時間の組織虚血の信頼できるモデルであることが証明された。 bipedicledフラップの寸法も豚12とマウスを含むと他の種、（3.0〜3.5センチメートルワイド10.5センチ）とF344ラット（2センチ幅11によってセンチ）のSprague Dawley含む異なるラット系統に適応されている13,14。このビデオでは、虚血性皮膚創傷モデルのデモンストレーションでF344近交系ラット系統を利用しています。
以下に、すべての動物の手順のための承認を得るのだった南フロリダの動物管理委員会（IACUC）の大学編と動物福祉法および実験動物の管理と使用に関する指針のすべての要件を順守する。
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Protocol
注：以下に示すすべての動物の手順のための承認は南フロリダの動物管理委員会（IACUC）の大学から入手し、動物福祉法および実験動物の管理と使用に関する指針のすべての要件を遵守した。
シリコーンシートと手術器具の作製
- 非強化0.01厚さ、医療グレードのシリコーンシートとオートクレーブを用いて滅菌のプレカットストリップ（X 3.0センチメートル10.5センチメートル）。
- 清潔（手術中に無菌のフィールドを作成するハサミ、ピンセットやカーテンやタオル）、適切な手術器具を滅菌する。
2.実験動物
- 商業ブリーダーから入手した250〜350グラムの範囲で体重成人男性または雌ラットを使用してください。老齢ラットが利用される場合、それらは良好な生存、術後性を確保するために≥350gであるべきである。すべての実験の開始前には、少なくともためにすべての動物を順化食物および水を自由に摂取 12時間の明暗サイクルの標準的な条件下で7日間。
3.麻酔、術前鎮痛と手術の準備
- 皮膚の準備と手術中にO 2と1％-2％に（ノーズコーンの使用を介して）誘導室を介して3％-4％のイソフルランを使用して全身麻酔を誘導し、維持する。呼吸の速度と深さの観察、インターデジタルピンチまたは眼瞼瞬目反射によって麻酔の深さを監視します。
注：この時点では、獣医軟膏は、動物が麻酔下にある間に乾燥を防ぐために、目に配置することができる。 - リモート無菌の手術領域からの位置では、腹臥位にラットを置き、上下約11センチメートル首の付け根からバリカンで背を剃る。恒久的なマーカーでステンシル、X 10.5センチフラップ3.0センチメートルのアウトライン（ 図1Aを参照）。
- きれいな、指定されたsurgicaにラットを移動承認された加熱パッド及び滅菌外科用ドレープまたはタオルを搭載したL·エリア。疼痛管理のための最初の外科的切開に5mg / kgのケトプロフェンを皮下注射する前に。必要に応じて、追加の流体（生理食塩水）は、皮下（5 CCまで）が挙げられる。
- 無菌のフィールドを作成する無菌ドレープを適用した後、0.2％クロルヘキシジンと70％イソプロピルアルコール及び第二と第一拭き取りによってさらに肌を準備します。 10％ポビドンヨード（ベタジン）を使用することもできる。
NOTE：抗生物質（15 mg / kgをアンピシリン）を皮下投与することができるが、良好な無菌技術が使用される場合、それは要求されない。
4.切除創傷とBipedicledフラップの作成
- 無菌の、使い捨ての6ミリメートル生検パンチツールを使用して、指定されたフラップ面積（ 図1B）の中央に2円形「虚血性"傷を作る。傷の深さはダウン（しないを介して）に皮筋層のCarnoのの基本的な筋膜であるべきSUS筋肉（ 図1B挿入図）。
- 使用して鉗子は、パンチ生検によって作成された創傷の輪郭の途中で皮膚を持ち上げた後、（皮筋層の筋肉を含む）は、組織の円形部分を切除する（湾曲した先端を有する）アイリスハサミを使用しています。その結果、傷のベースとして筋膜で巻か全層になります。
注：切除した組織（創傷プラグ）スナップ液体窒素中で凍結させるか、または制御、正常な皮膚のような後の処理のために10％緩衝ホルマリンO / Nに固定することができる。 - 長さ10.5センチ、離れて3.0センチメートルである前描線（ 図1C）に沿って、虚血性傷の両側に滅菌メスで切開を行うことによってbipedicledフラップを作成します。切開の深さは、ダウン傍脊椎筋にすべきである。アイリスハサミを使用して、傍脊椎筋から皮筋層の筋膜を分離、6mmのパンチ（Fの「ベース」としてそのまま筋膜を維持するように注意してigure 1D）。
- 1無菌プレカットシリコーンシートを取り、皮筋層の筋膜とシートが座屈しかフォールドしないことを確実にする傍脊椎筋（ 図1E）の間にそれを配置します。ブラック、非吸収性縫合糸（サイズ4.0）を使用して、少なくとも8で皮膚へのシリコーンシートを固定することによって、両方の切開を閉じるフラップ（ 図1Fおよび1G）の長さに沿って、それぞれの側にステッチを中断。
- 無菌の、使い捨ての生検パンチツールを使用して、（皮筋層の筋肉の前筋膜まで）2、内部統制の「非虚血性」の傷フラップ（ 図1G）のいずれかの側の虚血性創傷に横1cmに作成します。
- 傷下記の定規を置き、（ 図3Aを参照）に巻か測定目的のために、デジタル写真を撮る。このとき、血流（灌流）は、レーザードップラーを使用してモニターすることができ、または他の操作（局所薬の配置）を行う。
- 頭蓋と尾の両方に承認液体接着剤は、創傷及び（無菌）しっとりとした清潔な創傷環境を維持するためにドレッシング透明フィルムに適用されます。追加のドレッシングは、最も尾側の縫合糸を除去した動物を防ぐために、フラップの尾側端部に配置することができる。
5.術後の手順
- フィーダー擦れから手術部位を防止するように浅いフィーダーを装備した（単独で収容）のケージに動物を配置します。彼らは胸骨横臥を維持し、意図的な動きを示すのに十分な意識を取り戻すまで、動物は、放置または他の動物の会社に返却すべきではありません。暖房マットは回復中に最大2日間、ケージの半分の下に配置する必要があります。
- 手術後の痛みを管理するには、最大48時間後に手術のために次の朝、一日あたり1倍の動物に皮下にケトプロフェン（5mg / kgの）を管理。動物はまたのために毎日監視する必要があります痛み、体重減少または手術部位感染の長期化の兆候。
6.その後の創傷測定と包帯交換
- ステップ3.1のように、O 2と誘導室を介して3％-4％のイソフルランを使用して、頻繁に全身麻酔下で虚血性および非虚血性の傷を測定し、維持（ノーズコーンを介した）1％-2％である。
- 皮膚から接着剤を引っ張らないよう優しくドレッシングを削除します。追加のデジタル写真は、創傷の測定のために採取され、この時点で、局所治療は再適用、レーザードップラー画像化（LDI）または研究者のニーズに合わせて行う他の操作。
- 接着剤ときれいなドレッシングを適用し、動物がステップ5.1のように回復することができます。
7.傷収集と安楽死
- 収穫虚血性および非虚血性の傷（日に調査員が適当と認める）動物はINDを経由して3％-4％のイソフルランを使用して全身麻酔下にありながら、はじめ室とステップ3.1のようにO 2と1％-2％に（ノーズコーンを介して）維持した。
- メスを用いて、傷の周りのいくつかの健康な組織が含まれるように傷の周りに正方形の切除を行う。キャップチューブをスナップし、将来分子解析のために液体窒素中で凍結（-80℃で保存）をスナップインまたは組織学的処理のために、室温で10％緩衝ホルマリンO / Nでインキュベート1.5ミリリットルに切除を置きます。
NOTE：創傷切除はまた、分析のためのサンプルを提供するために半分に切断することができる。 - 創傷組織を除去した後、CO 2吸入の承認された方法を用いて動物を安楽死させる。
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Representative Results
効率的に行う場合は、ラットの虚血性創傷治癒モデルプロトコルは、動物当たり約20分を取る必要があります。 図1Gに示すようにモデルをドレッシングの適用に先立ちが表示されます。それはbipedicledフラップと傷がその中の虚血性であることを確認することが重要になります。傷のレベルで皮下酸素張力（PscO 2）は 2虚血性傷の間に皮下組織にポーラログラフ電極を配置することにより、このモデル5の検証中に測定されている。 PscO 2の値は、批判的に虚血性範囲（20〜40 mmHgの）であった。このモデルの開発以来LDIの使用がますます血液灌流を測定するために使用されており、この技術はbipedicledフラップの虚血状態に関する十分な情報を与える。
簡単に言えば、LDI技術は光ファイバープローブによって運ばれたレーザ光の光の出射に基づくものである。 measuringの深さは、組織特性とレーザ光の波長に依存する。正常な皮膚では、標準的な繊維分離（0.25 mm）とし、波長780nmのレーザプローブと測定器は、深さの測定は、0.5〜1ミリメートルのオーダーである。 （縫合線の左側）灌流領域と非灌流領域（縫合線の右）の両方を示す背bipedicledフラップのための代表的なドップラー画像（左）は、図2に示されている。
皮下酸素分圧を測定することに加えて、人はまた、フラップにおける創傷は、虚血性であることを確立するためのプローブまたは共通の生化学的マーカーを使用することができる。通常は血管内皮細胞に見出さPECAM-1またはCD31は、創傷における新血管形成のマーカーである。虚血性創傷において上昇していることが判明し、活性酸素種のための様々なマーカーは、商業的に頻繁にそのようなジヒドロ（DHE）などの蛍光タグ付き抗体又はスーパーオキシド指標として利用可能です。
Woun創傷閉鎖を追跡するdの面積の測定は、様々な方法で表すことができる。一般的に、創傷面積は、次のような式を用いて治癒11の時間経過にわたって創傷のデジタル画像から定量化されたデータと（6ミリメートルパンチ生検面積=（π）rは 0日目に2 = 3.14×9 = 28.26ミリメートル2）特定の日の最初の創傷面積のパーセンテージ又は創傷表面積として提示グールドらのように定量化することができる。5このデモンストレーションの目的のために、創傷閉鎖の進行は、28日間の時間経過にわたって初期の創傷面積の割合として表され。フリーソフトウェアImageJのを使用して、デジタル画像が開かれ、スケール画像（ 図3A）に定規を10mmで設定している。長さ10 mmの描かれた線は、この場合（mm）の中に、任意の単位に変換することができる（ 図3A内のイラスト ）の画素数に等しい。次に、傷の周囲は（画像上でトレースされる図3B）と測定指令が与えられた後、領域は、図3Bにはめ込まミリメートル（）に示されている。データは、その後、x軸（ 図3C）のy軸との日に、最初の創傷面積の割合として提示することができる。
虚血性創傷、bipedicledフラップ、及び非虚血性創傷を作成するために、手術中にステップを示す図1の写真。 （A）術前脱毛と疼痛管理のための鎮痛剤の術前投与量（ケトプロフェン）皮下を受け、麻酔したラットの皮膚の準備。（Bおよび挿入図）虚血性創傷は、無菌のパンチを利用して2切開マーカー内に作成されている生検ツール。（C）切開は、傍脊椎筋及び（D）にマークダウンラインに沿って作られていbipedicledフラップが発生した下の筋肉層からの（無傷皮筋層の筋膜との）フラップの分離を示すために、（E）滅菌シリコーン（黒矢印）のシートを、皮筋層の筋膜および傍脊椎筋の間に配置されている。（F）ブラック、非吸収性縫合糸（サイズ4.0）は、複数のフラップ（G）の長さに沿ってステッチを中断して皮膚にシリコンシートを固定することで、両方の切開を閉じます。二つの非虚血性の傷（黒矢印）は、両側のbipedicledフラップに横方向の無菌のパンチ生検ツールを使用して作成されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
血液灌流手術後の図2の代表的なレーザードップラー画像右パンelはbipedicledフラップとフラップに横1非虚血性傷（シングル黒矢印）の途中で2虚血性の傷（黒矢印）の黒と白の画像を示している。縫合線は白で強調表示されている。左側のパネルには、右のパネルに描か同じ領域のドップラー画像を示している。明るい色付きの領域は、ダークブルーのある地域より灌流する。非虚血領域（左）と虚血領域（右側）との間の灌流の差は明らかであり、縫合線の全長に沿って続くことができる。血液細胞は依然としてある程度存在しているように、両側の傷は、明るく見えることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3.創傷測定およびデータ表現図。 >（A）（ImageJの）のソフトウェアを使用して創傷面積の測定を示すデジタル写真は、（mm）と（黒矢印）とメソッドへの画素の変換は、創傷（B）の正確な円周（単一の黒矢印）を捕捉する。統計データ（特定の日に創傷面積の平均値±SEM）を、x軸（C）上に、y軸および日に初期の創傷領域（0日目）のパーセンテージとして提示することができる。線グラフが提示データ群当たり8傷= N、同じ時点（10日目）で、非虚血より（P = 0.0004）有意に高いを表す***、シダックの多重比較検定を2ウェイANOVAを用いて分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ラットでの創傷治癒は、しばしば感染した傷や動物間の変動5率の高さを癒すする能力に議論の対象となっている。その開発中のモデルの元の目標の一つは、この変動を減少しております。特定の配置に傷の数を減少させるフラップの幅に変更が、シリコンシートのと導入（一貫した頭尾場所にフラップを中心）が、この目標を達成した。収縮により創傷治癒が、ヒトにおけるように、上皮化により還元され、治癒された、測定された結果である。ラットの異なる株に対するモデルの適合は、 すなわち 、F344はまた、Sprague Dawleyラットを用いて観察された成功した実績のある虚血の程度を再現している。全体的にこのモデルに必要な外科的技術（生検、縫合および創傷切除）を容易に制限された外科的経験を持つほとんどの学生や技術者が取得している。
_content ">は、複数の手術を行っている間、それはそれは、シリコーンシートの配置5のフラップの上昇に先立って、虚血性創傷を作成することが重要であることが見出されたこのモデルと一貫性を達成する。また、非常に重要です皮筋層の筋膜を介してパンチしないシリコンの上にとどまるために実行可能な創傷床を提供する。シリコーンは、血管の再成長だけでなく、傷の再上皮化を促し、「スプリント」としないようにするだけでなく機能します。感染を防ぐとするための湿潤環境を維持するために、接着剤やドレッシングのアプリケーション動物のいくつかは関係なく、接着剤の種類を彼らのドレッシングを削除しないことができるようにするための創傷治癒も重要である。製品の選択は何を優先または研究者の動物施設で使用されていることができます。しかし、それは珍しいことではない/ドレッシングの組み合わせである使用。bipedicledフラップは概算で癒しの時間経過を通じて生存し続ける必要があります LY 28日、ラット系統と存在する他の併存疾患に応じて。まれに、膿瘍は、フラップの下に形成することができるフラップ（特に近い縫合糸）とseromas中に形成することはできません。流体を排出することができ、必要に応じて抗生物質が投与される。フラップは生存能力を失い、壊死性になった場合は、その動物がもはや使用することをお勧めします。生化学分析のための創傷切除は（1）いくつかの正常組織を支援するために保持されなければならないのために可変性を導入しない（2）RNA、DNAまたはタンパク質と、（3）固有の動物間変動5,10の分離のための組織の均質化と準備の選択、 11。一つは、この最後の点をモデルに制限を検討することもでき、それは、フラップ（<2.0センチメートル）またはフラップ外傷の大きさを減少させると、温度または応力レベルなどの要因の小さな変化が、また可能性があることを示し、壊死を引き起こすことがわかった別の5の1のラットからの創傷サンプル間の生化学的に検出可能な変化に。
ve_contentは ">要約すると、2.0-3.0幅センチ、戦略的に配置されたシリコーンシートに至るまで縦、bipedicledフラップ付きこのモデルは、長期の組織虚血の信頼性の高いモデルです。ユーザーが作成する技術を使用してに熟達したら一貫した虚血性創傷は、それらは、追加の年齢および種、齧歯類の（マウスを含む）。切除創傷を、局所的に処置され得るか、またはさらなる慢性創傷の形成に関与するメカニズム（複数可）を探索するために利用さ全身治療に適応することができるはず炎症反応、異常な血管新生および遅延創傷閉鎖を悪化させた。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sil-Tec medical grade sheeting | Technical Products Inc. | 500-3 | nonreinforced, 0.01 inches in thickness |
| Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS | World Precision Instruments | #503671 | |
| Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | 1964G | black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle) |
| Laser Doppler Imager | Moor Instruments | moorLDI2-IR | Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8 |
| ImageJ | NIH | free download | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
| Mastisol | Henry Schein | Cat # 7289210 | Fisher Scientific NC9774929 |
| Tegaderm | Medical Specialties | 3M1624W | Fisher Scientific NC9922128 |
References
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