Introduction
げっ歯類で冷たい反応性を測定することは、正常および病的両方の条件下で、ヒトにおける低温感受性の潜在的なメカニズムの理解を改善するのに重要である。コールド足底アッセイ（CPA）、もともと数年前に1を開発し、RTで配信寒冷刺激に再現可能な、明確なネズミ行動反応を生成するように設計されています。このアッセイのより最近の強化は、温度が2の広い範囲での低温感受性の再現性のある測定を可能にしてきた。どちらのバージョンも、比較的高いスループット、および使用する安価であるように設計されている。
大きな進歩は、他の行動の方法を使用して低温感受性のメカニズムを理解する上でなされた。一つの方法は、軽くたたくまたは噴霧アセトンをマウスの足に、マウスが足3,4フリック費やす時間の量を測定することを含むアセトンの蒸発試験である。残念ながら、アセトンの蒸発に対する応答は、湿式感覚とアセトンの匂いによって混乱している。また、アセトンの蒸発試験に適用される冷熱刺激を印加アセトンの量に基づいて変化し、定量化が困難であることができる。最後に、無傷のマウスは、ベースライン時にアセトンに最小限の応答を持っていることは不可能この方法で過敏症が存在しない場合に鎮痛を測定すること。
冷応答のための別の古典的なアッセイは、テール冷水5,6に浸漬された後に撤退する待ち時間が測定されるテイルフリックアッセイである。このアッセイにおける行動応答があいまいであり、アッセイは、特定の温度に対する応答を測定している間、動物は、十分に記載ストレス誘発鎮痛メカニズム7を通じて冷たい応答性を変えることができ、試験中に拘束されなければならない。
もう一つの一般的に使用されるツールは、行動を測定コールドプレート試験であり、彼らはペルチェ冷却板8-10上に置かれた後のマウスの応答。このツールは、特定の温度での動物の応答に関する情報を提供していますが、それはまた、一貫性なく使用されてきた。別のグループは、ジャンプ8,11数、最初の応答8,11- 13に待ち時間を含む応答の異なるタイプを測定して、足の数は非常に異なる結果を11,13,14を持ち上げる。コールドプレートアッセイはまた、一度に試験することができる唯一の動物のような比較的低いスループットであり、それは高価で脆弱なペルチェ素子を必要とする。
2プレート温度嗜好試験は、動物が、異なる温度9,15- 17の2接続プレートに費やす時間の相対量を測定するコールドプレート試験の一般的に使用される誘導体である。別の類似の一般的に使用されるアッセイは、熱勾配アッセイ、マウスは、異なる温度帯で過ごす時間の量である長い金属板上に5°Cと45°Cの範囲では16を測定する。これらのアッセイは、温度の比較を可能にしながら、それは行動が温度嫌悪や温度の好みにを表すかどうかは不明である。
最後に、動的コールドプレートアッセイは、マウスは、周囲温度18の変化に対応するかを測定するために使用されてきた。この方法は、RTペルチェ素子にマウスを置き、マウスがジャンプしたり、異なるプレート温度で彼らの足をなめるどの程度測定しながら、1℃にそれをランプダウンが含まれます。これはマウスが冷却環境に適応する方法をテストが、それはマウスがクーラー周囲温度の設定で冷たい刺激に反応するかテストするための方法を提供していません。さらに、それは実行するために高価な設備を必要とし、その低温感受性を測定する前に検査機器にマウスを順応する方法を提供していません。
これらのアッセイを補完するために、CPAはacclimaをテストテッド温度範囲において、種々の明確に定義された冷刺激に対する応答、または冷たい周囲温度に適応する過程。これは、安価に高スループットテストのためにスケールアップされる可能性を、私たちの現在の装置との時間で14匹のマウスまでテストすることができます。
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Protocol
すべてのマウスプロトコルは、健康のガイドラインの国立研究所に従ったとワシントン大学医学部の動物実験委員会（ミズーリ州セントルイス）によって承認された。
1.テストプレートとエンクロージャの準備
- ガラス表面をきれい。
- 実験用テープでガラス板の中央に表面にT型フィラメント熱電対プローブを固定する。
- プレートの中央に沿って一列にガラス板上の動物のエンクロージャを置きます。
- 中央動物囲いを通して熱電対プローブを通し、データロガーに接続します。自動シャットダウン機能を無効化しながら、上のデータロガーの電源を入れ、付属のケーブルでコンピュータにデータロガーを添付。
- 実験中のプレート温度を記録する場合は、プレート温度の記録を開始するために、データロガーソフトウェアを開きます。
- 必要であれば、再ソフトウェアを調整コードプレート温度を一度毎秒。
- 熱データロガーでパッケージソフトを使用して温度の記録を開始。
- マウスとの間の視覚的相互作用を防止するために、黒挿入物を有する筐体を区切ります。
- 位置は、エンクロージャの下面が快適着座位置から見えるようにガラスの下に反映しています。
2.温暖化/ガラス板を冷却
- 温め、水、湿潤氷またはドライアイスアルミニウムボックスを充填し、ガラス板上に適切に配置する（ドライアイスを充填したアルミ箔のパケットは、ガラスを冷却するために使用することができ、 図1）2。
- 30℃でのテストでは、離れて、動物のエンクロージャ（ 図2B）2から「約0.25」アルミボックスを配置します。
- ガラス板の両側に加熱された水循環器を設定する。 45にサーキュレータを設定 - 60°C、と私たちお湯（ 図1C）2の安定した流れでアルミボックスを埋めるために、それをメール。
- サーキュレータを配置し、アルミニウムボックスからお湯を直接戻ってそれぞれの側（ 図1C）上のサーキュレータの貯水池に排出すること2。
- RTでのテストのために、（ 図2）2空のボックスを残す。
- 17℃でのテストでは、いずれかの側に離れて、動物のエンクロージャから'' 0.25約の箱を置き、湿った氷（ 図2）2で満たす。
- 12℃でのテストでは、離れて両側の筐体から'' 1.25約の箱を置き、ドライアイス（ 図2）2で満たす。
- （ 図2）5℃でのテストでは、約0.25 ''離れていずれかの側の筐体からのボックスを配置し、ドライアイスで埋める2。
- ドライアイスを用いてガラスを冷却すると、部屋中のCO 2の蓄積を防止するのに十分な換気があることを確認してください。
- 30℃でのテストでは、離れて、動物のエンクロージャ（ 図2B）2から「約0.25」アルミボックスを配置します。
- 所望の温度範囲に到達するためにガラスのを待ちます。
- プレート上のエンクロージャにマウスを追加します。
注記：白色雑音発生器は、ノイズ障害を減少させるために使用することができる。 - マウスが順応するのを待ちます。
注：私たちの施設では、これはおよそ2.5時間かかりますが、これは、動物の収容及び取扱い条件に基づいて大幅に異なる場合があります。 - ボックスは温め水、湿った氷、またはドライアイスの完全に保たれていることを確実にすることにより、所望の温度範囲でガラスを維持します。
注：私たちの装置では箱が氷おおよそすべての90分を再充填する必要がある。
注：17℃の条件では、それは氷でそれを再充填する前に排水孔を通じてアルミボックスからほとんどの水を空にしておくと便利です。これは、より良い温度を安定し、PRしますイベントのオーバーフロー
注：ドライアイスの正確な量は季節変化するが、一般に温度を一定に維持するボックスの全長に沿って完全以上のボックスを¼保ちます。
3.固定温度でのマウスのテスト
- 行動の部屋の外では、ドライアイスの完全な約半分のアイスバケツを埋める。
- ハンマーやマレットを使用して、微粉末にドライアイスを粉砕。
注：バケツを過剰充填することは、困難な完全に粉末にドライアイスを粉砕するようになります。 - ストレートカミソリの刃やはさみを使って、3ミリリットル注射器をトップを遮断。
- 21 G針を使用して、シリンジ（6穴の合計）の両側に3つの穴を突く。
注：これらの穴は、ドライアイスを圧縮しながら昇華により発生する圧力が減少します。カットオフ注射器は、複数の実験のために再利用することができる。 - 注射器、ドライアイス粉末、および行動部屋に手持ち式ストップウォッチを取る。
- ドライアイス粉末の半分シリンジ室を埋める。フラットオブジェクトに対して注射器の切断端を持ち、しっかりとプランジャーを用いた粉末を圧縮する。注意してください;プラスチック製のプランジャーは、曲げや圧力から破損する可能性があります。このような場合は、新しい注射器からプランジャーを交換してください。
- 注射器の端を超えて圧縮されたドライアイスペレットの先端を拡張します。
- 安静時に完全にある試験マウス。
- 30℃、23℃、17℃では、すべての4ガラス上の足としないを持って試験マウスは動くが、19完全に眠っていない。
- 12℃、5℃で、移動やジャンプ2足または4足としない上に試験マウス。
- マウスの後肢（ 図1A）2の下にガラス面に対して平らペレットフラッシュを押して慎重にしっかり、ターゲティングのためにミラーを使用。手タイマーを起動します。
- タイマーを停止し、マウスが離れて冷却されたガラスから移動したときのペレットを削除します。
NOTE：撤退運動が垂直または水平であることができる。- マウスは非常に簡単に足を移動し、冷却面にそれを返す場合、マウスが離れて完全移籍するまで、タイミングと刺激を続ける。
注：私たちの研究室では、ほとんどの場合において、マウスのための20秒の最大刺激時間を使用しています。
- マウスは非常に簡単に足を移動し、冷却面にそれを返す場合、マウスが離れて完全移籍するまで、タイミングと刺激を続ける。
- 各動物の各足に少なくとも3つの値が収集されるまで、このテスト手順を繰り返します。少なくとも15分までに、任意の単一の足に少なくとも7分であり、個別の連続した試験により、同じマウスの反対の足をテストする個別の試験。
- 必要に応じて、（ 図3）1の冷却速度の違いを生成するために、ガラスの異なる厚さを使用する。
注：冷却速度が反比例ガラスの厚さと相関している。
4.低温適応中にマウスのテスト
注：これはガラスPLATとしてテストを可能にする別のプロトコルですeはむしろプレートが安定したとマウスが完全に寒冷環境に適応した後も、冷却される。
- 装置をセットアップするための第1節に記載されている指示に従ってください。
- RT（ 図7A）2でベースライン測定を行うためにセクション3に記載されている指示に従ってください。
- ドライアイス入りのアルミボックスを事前に冷却する。
- ベースライン引っ込め潜伏時間が測定された後、離れてエンクロージャから両側にプレート約1.25 ''に予め冷却ボックスを配置する（ 図7（a）は、矢印がラベル「ドライアイスを追加」）2。
- できるだけ頻繁に測定を行う、ガラス板を冷却するように測定を行う第3節に記載されている指示に従ってください。
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Representative Results
30°C、23°C、17°C、12°Cで開始されたマウスから誘発される行動反応は、再現性の高い（ 図4A）20である。後足の下に生成された冷熱刺激を測定するために、マウスをケタミン/キシラジン/アセプロマジンのカクテルで麻酔し、それらの足をT型フィラメントの熱電対（ 図4B）20の上にガラス上に固定した。ガラスは、所望の検査範囲に冷却または加温した。プレートは、プレート（ 図5A）2の長さに沿って均一に冷却されるが、それはコールド勾配が動作エンクロージャ（ 図5B）2の両端に発生していることに留意すべきである。中央部分（ 図5B）2少し暖かいいる間エンクロージャの両側にドライアイスに近い筐体の部分は、冷却器である。寒い気温のUSED、マウスは、筐体の中央部分に自分の時間の大半を費やしています。ガラス板の温度が安定したところで、焦点ドライアイス刺激が足/サーモード下ガラス上に置いた。このセットアップから記録された温度のトレースに基づいて、CPAを使用して生成された冷刺激が各温度範囲（ 図4C）20で高度に再現可能であることは明らかである。
CPAで生成冷熱刺激も冷却（ 図3）の強度を変化させるために、ガラスの三つの異なる厚さを使用して測定した。冷却速度は、逆ガラスの厚さに関連し、これらの厚さのいずれかが（ 図3）必要に応じて低温感受性を測定するために使用することができる。
以前の研究は、CPAは、マウスにおける鎮痛及び過敏症を検出できることが示されている。モルヒネの1.5〜10mg / kgの皮下注射の30分後、マウスはかなりリットル有する生理食塩水の皮下注射したマウスよりも撤退に炎神の待ち時間（ 図6A：ボンフェローニ事後検定でANOVA主効果*のP <0.05 2ウェイ、30分** P <0.01;群あたりn = 12）1。モルヒネ/生理食塩水後60分までに、マウスにおけるモルヒネ代謝の速度と一致する生理食塩水およびモルヒネを注射した群との間に違いはない。
完全フロイントアジュバント（CFA）は、以前に後肢注射後21炎症および過敏症を引き起こすことが示されている。 ** P <0.01を2時間*のP <0.05、3時間、ボンフェローニ事後検定と2ウェイANOVA主効果のP <0.001：CFA注射した後、CPA逃避潜時は（ 図6B 2と3時間後に注射を減少はn = 12群）。 CFA注射後4時間後に、マウスに1.5mg / kgのモルヒネを皮下注射した。モルヒネ注射、CFA-と生理食塩水を注射したマウスの両方が増加していたwithdr後30分ダネットの事後検定1ウェイANOVA、生理食塩水対 $$$ P <0.001、生理食塩水で3時間4.5時間CFA 4.5時間対 CFA 3時間$$$：3時間で彼らの待ち時間に対する相対awalの待ち時間（ 図6Bてp <0.001）。モルヒネが代謝されたら時間後、CFAを注射したマウスは、再び生理食塩水を注射した対照マウスよりも低い引っ込め潜伏時間持っていた（ 図6B：2ウェイ·ボンフェローニ事後検定とANOVA、** P <0.01） 1。
大部分の哺乳動物種が環境に適合するように、その温度感受性を適応させる能力を有する。 インビトロ 、研究は、この適応過程がPIP 2の加水分解22〜24に依存することを示唆しているが、以前の行動のツールは、インビボでこの仮説を検証することができなかった。 CPAは、2つの異なる方法で、この適応を定量化することが可能である。ガラスが冷却する（マウスの撤退の待ち時間をテストすることによって
CPAはまた、ABを測定することができます長期間にわたって寒冷周囲温度に適応するility。野生型マウスは、30°C、23°C、17°Cまたは12°Cで3時間順応させた後にCPAを使用して試験したとき離脱待ち時間が示唆同じで全ての出発温度で野生型WT 30°C = 13.23±0.5秒、23℃= 12.8±0.7秒、17°C = 12.3±0.9秒、12°C = 12.8±0.5秒、1〜：寒い周囲温度（ 図2Aに適応したマウスボンフェローニポストホック検定、p> 0.05のn = 6〜30°Cのためにはn = 15と双方向ANOVA 23°C、17°C、12°C）20。開始温度がTRPM8-KOマウスの撤退の待ち時間を減少すると野生型マウスとは異なり、（ 図彼らは自分の環境に合わせて自分の応答閾値を適応することができないことを示唆し、減少8：1ウェイの反復測定ANOVAボンフェローニポストにアドホックテストは、主効果のP = 1.5×10の雄-5、12°C 対 。 23°CのP = 6×10 -5、17°C 対 23°C、P = 0.004。 C 対 23℃、P = 0.0005、女性の主な効果はp = 3.6×10 -5、12℃ 対 23℃、P = 9.25×10 -5を 、17°、 DF = 1、N = 11人の男性と11人の女性）20。
コールド足アッセイ（CPA）装置2（A）、CPAを実行するための回路図。図 。彼らは安静時になるまでマウスをプラスチック行動エンクロージャにガラス板上に順応させる。ドライアイスペレットを、後足の下にガラスの裏面に塗布され、冷却ガラスからの撤退の待ち時間を測定する。 （B）5℃にプレートを冷却する構成でCPA装置のピクチャー。熱データロガーは、エンクロージャの中心にある、アルミボックスは両側にエンクロージャに隣接する。 （C）30℃でプレートを暖める構成におけるCPA装置のピクチャー。水循環はその後戻ってサーキュレータのリザーバ内に側にドレインを流出し、アルミボックス、にお湯を流す。ブレナーらは 2014年2から許諾を得て再掲した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
CPA 2中のガラス板の図2の温度（A）は、CPAで行動実験中にガラス板の温度追跡を平均化。 30℃、n = 1の場合、23°Cのn = 5、17°Cのn = 7、12°Cのn = 7、4°Cのn = 5（B）の概略図デムCPAの異なる温度条件を生成する方法onstrating。ブレナーらは 2014年2から許諾を得て再掲した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.ガラスの厚さは逆に1の冷却速度と相関している。（A）は回路図、実験計画（BD）を作図。足の下に冷たい足底刺激中の温度は、通常の状態ではすべての3つのガラスの厚さで測定し、発泡スチロールのスペーサが離れてガラス表面から足を支え。全ての場合において、離れたガラスから足を支えは足で測定寒冷刺激の劇的な減少を引き起こした（n =ガラス厚み当たり6）。 （
図4. CPA逃避潜時は 23℃、17℃、または12℃から開始したマウスについて20。（A）平均逃避潜一致している 。 （B）CPA冷たい刺激を測定するための設定。麻酔したマウスの足は、上に実験用テープでガラス板上に固定されているT型熱電対のフィラメント。 CPA刺激が足と熱電対の両方の下にガラスの下側に配置されている。 （C）の温度は30°C、23°C、17°Cまたは12°Cから出発CPAで生成。黒い矢印は、各条件で目を覚ましたマウスの平均の引っ込めるまでの潜伏時間を表す。ブレナーらから許諾を得て再掲した。 2014年2。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5のガラス板の温度は、プレートの中心に配置されたCPA 2（A）熱電対t1の（黒） で一致している 。熱電対t2は（赤）は、プレートの右縁に最も近い行動の囲いの中に入れた。温度TRAcingsと右端（T1-T2）のグラフは、実験の過程を通して、t1とt2でほぼ同じ温度を示している。 （B）熱電対t1の（黒色）をプレートの中央に置いた。熱電対t2は（赤）は、ドライアイスを充填したアルミボックスに近い壁に、中央行動の囲いの中に入れた。温度の追跡と右端（時刻t1-t2の）のグラフは、プレートが安定した温度に達すると、t1とt2の間で約3℃の差があることを示している。ブレナーらから許諾を得て再掲した。 2014年2。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6. CPAは鎮痛や過敏症1を測定することができます。（A）Sを（; 30分後に注射** P <0.01ボンフェローニ事後検定で2ウェイANOVA）1.5 mg / kgをモルヒネ注射後のマウスの30分の撤退待ち時間が増加のubcutaneous注入。 60分間の注入後、モルヒネを注射し、生理食塩水を注射したマウスの間に有意差はない。 （; *はp <0.05、**はp <0.01、ボンフェローニ事後検定による2-ウェイANOVA）（B）10μlの完全フロイントアジュバント（CFA）の足底内注射は、マウス2と3時間のポスト噴射の離脱待ち時間を減少させる。全てのマウスは4時間でモルヒネの皮下注射した、および4.5時間ですべて引っ込め潜伏時間は3時間と比較して有意に高かった（ダネット事後検定1ウェイANOVA; $$$ P <0.001）。 （ボンフェローニ事後検定と2ウェイANOVA、** P <0.01）CFAの注射（モルヒネ注射後1.5時間）後の5.5時間は、CFAを注射したマウスは、まだ生理食塩水を注射したマウスよりも低い撤退の待ち時間を持っていた。からの許諾を得て再掲したものブレナーら 2012 1。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ガラス板を動的20を冷却するように、図7は、低温適応を測定する。ガラス板としてCPAを実行するための模式図（A）は冷却される。ベースライン温度は、ドライアイス容器をプレートに添加し、室温で測定され、ガラス板を冷却するように引っ込め潜時を測定する。ガラス板を冷却するように（B）野生型マウスは、それらがCPA（ベースラインで測定することができるよりも速く冷却温度に適合させることを示唆し、同一の離脱待ち時間を持つ= 12.8±0.3秒、30分= 13.67±0.9秒、60分= 11.03±1.0秒、90分= 11.31±0.6秒、N = 3匹のマウス。ボンフェローニ事後検定、すべての群間に有意差）との1方向ANOVA。ガラス板としてCPAを実行するための回路図（C）は、PLC阻害剤U73122または対照化合物U73343の足底内注射した後、冷却される。プレートはU73122は、周囲温度に冷却に適応する能力を妨害することを示唆し、U73122注入後の冷却されている間（D）マウスは、有意に低い撤退の待ち時間を持っている。ブレナーらから許諾を得て再掲した。2014年20。この図は、痛み（IASP）の研究のための国際協会の許可を得て再現されています。図は、許可なしに、他の目的に再現することはできません 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8. TRPM8-KOマウスは20の冷却環境に適応していない TRPM8-KOマウスは、ボンフェローニ事後検定で（2方向ANOVA測定された全ての出発温度での野生型同腹仔よりも高い引っ込め潜伏時間を持っている; *** P < 0.001）。 TRPM8-KOマウスの離脱待ち時間はまた、開始温度が低下するにつれて減少する（ボンフェローニの事後検定による一方向ANOVA; ##はp <0.01、###はp <0.001）、離脱中に有意な変化がない一方開始温度が低下するなどの野生型同腹子の待ち時間。ブレナーらから許諾を得て再掲した。2014年20。この図は、痛み（IASP）の研究のための国際協会の許可を得て再現されています。図は、許可なしに他の目的のために再現することはできません。 してくださいCLICこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをKである。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T-type thermocouple probe | Physitemp | IT-24p | Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/) |
| Glass plate | Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) | We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful | |
| Thermal Data logger | Extech | EA15 | Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408) |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe |
| Computer | If using Extech logger, any Pcwill work | ||
| Aluminum boxes | Washington University in St. Louis machine shop | boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid. There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water. | |
| Heated water circulator | VWR | Any water circulator model with a pump will work | |
| 21 G needle | BD | 305165 | The exact needle size is not important |
| Hand timer | Any hand timer will work | ||
| Mirror | Any flat mirror will work |
References
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