Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.
EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.
मात्रात्मक पीसीआर (qPCR; इस पांडुलिपि में प्रयुक्त शब्दों की परिभाषा के लिए पूरक सामग्री देखें) और प्रतिलेखन qPCR (आरटी-qPCR) पानी का पता लगाने और पर्यावरण में मानव आंतों का वायरस बढ़ाता है और पीने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं, और विशेष रूप से करते हैं कि कई वायरस के लिए रिवर्स दोहराने या सेल संस्कृति प्रणालियों में खराब नकल नहीं। दोनों उपकरण कई वायरस प्रकार दुनिया भर में 1-6 पर्यावरण और पीने के पानी में मौजूद हैं जो प्रदर्शन किया है। वे पीने के पानी में पाया वायरस फैलने रोगियों 7-10 से कि शेड के समान है पता चला है कि के रूप में रोग के प्रकोप की जांच के दौरान परिलक्षित जीनोमिक टुकड़ों का अनुक्रमण के साथ युग्मित उनके उपयोग, जलजनित वायरस संचरण के लिए सबूत प्रदान की गई है।
QPCR और RT-qPCR दोनों उपयोगी सार्वजनिक स्वास्थ्य उपकरण हैं। उदाहरण के लिए, अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (ईपीए) द्वारा किए गए अध्ययन से डेटा एक मजबूत रिश्ता होना दिखायाqPCR और मनोरंजन पानी में स्वास्थ्य के प्रभाव से बीच सूचक माप। नतीजतन, ईपीए के अंतिम 2012 मनोरंजनात्मक जल गुणवत्ता मानदंड मनोरंजन समुद्र तटों 11,12 निगरानी के लिए एक qPCR विधि भी शामिल है। RT-qPCR 1 द्वारा मापा Borchardt और सहयोगियों ने भी भूजल में इलाज भूजल और वायरस का उपयोग समुदायों में तीव्र आंत्रशोथ के बीच एक मजबूत संबंध पाया गया।
इस पत्र का उद्देश्य ईपीए विधि 1615 13,14 की आणविक परख घटक वर्णन करने के लिए है। इस परख एक विद्युत धन फिल्टर के माध्यम से Enterovirus और पारित पर्यावरण या पीने के पानी की मूल मात्रा के आधार पर प्रति लीटर नोरोवायरस जीनोमिक प्रतियां (जीसी) का एक मात्रात्मक अनुमान प्रदान करने के लिए RT-qPCR का उपयोग करता है। आणविक प्रक्रिया का एक सिंहावलोकन मानक वक्र की तैयारी के लिए 1। प्रोटोकॉल अनुभाग चित्रा में 1 विवरण प्रक्रियाओं दिखाया गया है। इन मानकों को एक आर.एन. होता है कि एक अभिकर्मक से तैयार कर रहे हैंसभी प्राइमर / जांच सेट के लिए लक्ष्य अनुक्रम की एक प्रति। धारा 2 तृतीयक एकाग्रता प्रक्रिया का वर्णन है। धारा 3 केंद्रित पानी और नियंत्रण के नमूने से शाही सेना को निकालने के लिए प्रक्रिया देता है। प्रत्येक परीक्षा नमूना से शाही सेना रिवर्स तीन प्रतियों assays और प्रधानमंत्री प्रतिलेखन (धारा 4) के लिए यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग लिखित है। (चित्रा 2 धारा 5) प्रत्येक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया से सीडीएनए qPCR द्वारा तीन प्रतियों में विश्लेषण कर रहे हैं कि पांच अलग-अलग वायरस विशेष assays में विभाजित है। परख कई enteroviruses और noroviruses और RT-qPCR से 15 निरोधात्मक हैं कि परीक्षण के नमूने की पहचान करने के लिए हेपेटाइटिस जी आरएनए युक्त एक अभिकर्मक पता लगाने के लिए तैयार कर रहे हैं कि वैज्ञानिक साहित्य (तालिका 1) से प्राइमरों और जांच उपयोग करता है।
स्रोत और पीने के पानी के वायरल संदूषण का बड़े पैमाने पर राष्ट्रीय पढ़ाई के कई विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं के उपयोग की आवश्यकता है। इन शर्तों के तहत एक मानक पद्धति कई प्रयोगशालाओं द्वारा उत्पन्न डेटा तुलनीय है कि यह सुनिश्चित करने की जरूरत है। वायरस का पता लगाने के लिए कई प्रकाशित आणविक विधियों, लेकिन बहुत कुछ मानकीकृत आणविक तरीके हैं। ईपीए विधि 1615 विशेष रूप से आर टी-qPCR द्वारा पानी matrices में Enterovirus और नोरोवायरस का पता लगाने के लिए बनाया गया एक मानकीकृत विधि है। मानकीकृत आणविक विधियों खाद्य पदार्थों में वायरस का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं, 16,17 (15216-2 केंद्र / आईएसओ टीएस 15,216-1 और केंद्र / आईएसओ टीएस 7 अप्रैल 2013) और हेपेटाइटिस का पता लगाने के एक वायरस और नोरोवायरस वसंत में करने के लिए लागू किया गया है पानी 16। सभी मानक तरीकों गुणवत्ता के प्रदर्शन के नियंत्रण और मापदंड के अंतर को कम करने के लिए और इंट्रा-प्रयोगशाला भिन्नता और कारण प्रयोगशाला संदूषण के लिए झूठी सकारात्मक डेटा को शामिल करना चाहिए। इसके अलावा, ई झूठी डेटा को कम करने के लिएपीए विधि 1615 प्रसंस्करण और एक तरह से काम के प्रवाह के दौरान काम की जुदाई के अनुबंध जो आणविक विधियों पर ईपीए के मार्गदर्शन, 18 इस प्रकार है। यह एक हेपेटाइटिस जी 1,19 आंतरिक नियंत्रण और कारण RT-qPCR 15 के अवरोधकों को झूठी नकारात्मक परिणामों को कम से कम करने के लिए प्रक्रियाओं में शामिल हैं। यह सभी क्षेत्र डेटा क्षेत्र की लीटर या पानी के सैंपल लिए पीने के प्रति जीनोमिक प्रतियों में व्यक्त किया जाता है तो यह है कि विश्लेषण किया दोनों जांचा पानी और पानी के मानकीकृत संस्करणों के साथ-साथ मात्रात्मक assays के उपयोग करता है। कुशल एकल ट्यूब (एक कदम) आरटी पीसीआर assays के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, यद्यपि विधि जानबूझकर अलग assays के उपयोग करता है। यह प्रत्येक प्रतिक्रिया में यत्न किया जा सकता है कि नमूना की राशि को कम करने का नुकसान है, लेकिन कई प्राइमर सेट के उपयोग में अधिक से अधिक लचीलापन देता है। प्राइमरों और जांच के लिए इस्तेमाल किया है और संभावना है कोई प्राइमर सेट एक समूह के भीतर सभी वायरस वेरिएंट की पहचान करेगा के रूप में आर टी-qPCR assays के द्वारा और केवल के रूप में अच्छा सीमित हैं। Enterovirus प्राइमर सेट क्योंकि चुना गया थायह 20,21 Enterovirus सीरमप्रकारों की एक विस्तृत विविधता का पता लगाता है, संरक्षित 5'-गैर कोडिंग क्षेत्र को लक्षित करता है, और यह द्वारा पता लगाया वायरस अनुपचारित groundwaters 1 की खपत से स्वास्थ्य प्रभावों के साथ जुड़े रहे हैं। दो प्राइमर सेट मैं 22,23 noroviruses genogroup का पता लगाने के लिए किया जाता है। पहले छोटे बच्चों में स्वास्थ्य प्रभावों के बीच मजबूत संबंध के कारण चुना गया है और वायरस 1 का पता चला था। वे उपभेदों 24,25 की व्यापक विविधता का पता लगाने, क्योंकि मैं सेट प्राइमर दूसरी genogroup और genogroup द्वितीय noroviruses के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर सेट चुने गए हैं।
पानी में वायरल आरएनए का पता लगाने के लिए qPCR और RT-qPCR प्रक्रियाओं का प्रमुख लाभ के बावजूद, कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, कीटाणुनाशक द्वारा निष्क्रिय सहित उन दोनों संक्रामक और noninfectious वायरस कण, इन प्रक्रियाओं से परिलक्षित किया जा सकता। Borchardt के परिणाम इस अनुपचारित groundwaters च के लिए एक समस्या के कम सुझाव है किसमुदायों में उन लोगों के लिए समान ROM जलवाही स्तर कीटाणुरहित सतह के पानी के लिए 1 से अध्ययन किया। कृषि वायरस के लिए इस समस्या संस्कृति 26,27 के साथ संयोजन में पीसीआर का उपयोग कर दूर किया जा सकता है। समस्या यह भी न्यूक्लिक एसिड पार से जोड़ने एजेंट 28-30 के उपयोग के माध्यम से कुछ वायरस के लिए संबोधित किया गया है। यह बाद दृष्टिकोण वायरस हाइपोक्लोराइट द्वारा निष्क्रिय और यूवी द्वारा निष्क्रिय लोगों के लिए प्रभावी नहीं करने के लिए अधिक प्रभावी है।
इन आणविक प्रक्रियाओं का एक दूसरा सीमा आम तौर पर यत्न किया जा सकता है कि ध्यान केंद्रित नमूने की मात्रा संस्कृति प्रक्रियाओं 6,31 के लिए इस्तेमाल किया है कि तुलना में काफी छोटा है। यह समस्या अक्सर या तो नमूना एक छोटी मात्रा में resuspended, या एक तृतीयक नमूना एकाग्रता कदम 6,32,33 के अलावा द्वारा किया जा करने के लिए अनुमति देता है जो जैविक flocculation द्वारा मानक माध्यमिक एकाग्रता, के लिए एक पॉलीथीन ग्लाइकोल आधारित प्रक्रिया प्रतिस्थापन द्वारा नियंत्रित किया जाता है । विधि 1615 centrif का उपयोग करता हैugal ultrafiltration तृतीयक एकाग्रता प्रदान करते हैं। केन्द्रापसारक ultrafiltration पानी और परीक्षण के नमूने में किसी भी वायरस के दोनों एकाग्रता और आणविक assays के छोटे आणविक वजन अवरोधकों में कमी में जिसके परिणामस्वरूप घटकों कम से कम 30,000 Daltons हटा। पानी में मौजूद था कि किसी भी वायरस के लिए> 10 5 के एक समग्र एकाग्रता कारक के रूप में यह तृतीयक एकाग्रता कदम परिणामों का परीक्षण किया जा रहा है।
एक तीसरा सीमा पर्यावरण के नमूनों में आणविक प्रक्रियाओं के अवरोधकों की उपस्थिति है। अवरोधकों को दूर करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किया गया है, कोई दृष्टिकोण आवश्यक निषेध के स्तर का अनुमान करने के लिए डिज़ाइन आंतरिक नियंत्रण का इस्तेमाल कर रही है, सभी पानी matrices और वायरस प्रकार 6,34,35 के लिए प्रभावी है। इस विधि में इस्तेमाल हेपेटाइटिस जी अभिकर्मक सभी प्रतिक्रियाओं और निषेध के आकलन के लिए एक आर टी-qPCR परख में वायरल शाही सेना के एक निरंतर स्तर प्रदान करके इस आवश्यकता को संतुष्ट करता है। जब टी का सबसे अच्छावह नमूना केंद्रित के रूप में लंबे समय तक वायरस सांद्रता सांद्रता 14,15 अवरोध करनेवाला तुलना में अधिक हैं के रूप में पतला किया जा सकता, हटाने दृष्टिकोण निषेध हटाने में विफल अवरोध करनेवाला।
यहाँ बताया मानक वक्र प्रक्रिया फायदे और एक प्रमुख सीमा दोनों है। एक लाभ यह अभिकर्मक एक ही नियंत्रण की सभी assays के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है, एक भी अभिकर्मक में आपूर्ति सभी आवश्यक घटक है कि प्रयोग किया है। यह अभिकर्मक विशेष रूप से नोरोवायरस assays के लिए एक फायदा है। नोरोवायरस कणों केवल यह बहुत मुश्किल मानकों के रूप में उपयोग के लिए वायरल कणों को प्राप्त करने के लिए बना संक्रमित व्यक्तियों से प्राप्त किया जा सकता है। एक और अधिक महत्वपूर्ण लाभ यह एक शाही सेना मानक आरएनए 36 की सही मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक है होने के रूप में यह एक अभिकर्मक में सभी लक्षित आरएनए वायरस के लिए एक शाही सेना मानक प्रदान करता है। हालांकि, सही वायरस यों के लिए अपनी क्षमता मैट्रिक्स प्रभाव को ध्यान में रखा नहीं कर रहे हैं कि इस तथ्य से सीमित है। मतलब यह है कि जीनोमिक प्रतिलिपि इसका मतलबनंबर मूल्यों पूर्ण नहीं माना जा सकता और केवल सापेक्ष दृष्टि से विचार किया जाना चाहिए। यह मानक वक्र काम कर शेयर aliquots के लिए पर्याप्त संख्या (1.2 कदम) पूरा अध्ययनों से कवर करने के लिए तैयार किया जा सिफारिश की है। उदाहरण के लिए, प्रत्येक 250 μl विभाज्य 6 आर टी प्लेटों के लिए पर्याप्त अभिकर्मक प्रदान करता है। यह एक अध्ययन में 500 नमूनों के विश्लेषण की आवश्यकता होगी कि जाना जाता है, तो 12 aliquots की एक न्यूनतम (500 नमूने आरटी प्रति प्लेट / 7 नमूने / विभाज्य प्रति 6 आर टी प्लेट) की जरूरत होगी।
ईपीए विधि 1615 में एक प्रदर्शन के आधार पर विधि है। कई निर्माताओं यहाँ निर्दिष्ट उन के बराबर अभिकर्मकों बनाने के लिए और इन अभिकर्मकों के रूप में लंबे समय प्रदर्शन मानदंड से मुलाकात कर रहे हैं के रूप में प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यह भी एक सकारात्मक RT-qPCR नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जो मानक वक्र, समस्या निवारण प्रदर्शन के मुद्दों में मूल्य का है। प्रदर्शन की वजह से शाही सेना की गिरावट, अभिकर्मक शेल्फ जीवन, फ्रीजर की विफलता, साधन अंशांकन, और तकनीकी त्रुटि करने से मना कर सकते हैं। प्रदर्शन के मुद्दों शक किया जाना चाहिएवे मानक घटता के लिए प्रदर्शन विनिर्देश को पूरा नहीं करते हैं तो एड मानक घटता 4 चित्र में दिखाया गया है कि से अलग या यदि। आर टी-qPCR परख काफी मजबूत है; पूर्ण विफलता की वजह से शाही सेना या तकनीकी त्रुटि (जैसे, एक लापता अभिकर्मक) के अनुचित हैंडलिंग की संभावना है। महान देखभाल निकासी और ribonucleases से आरएनए गिरावट को कम करने के लिए आर टी कदम के बीच शाही सेना के नमूने से निपटने में लिया जाना चाहिए।
जमीन और अभिकर्मक ग्रेड जल और भूजल से murine नोरोवायरस वसूलियां से पोलियो वायरस वसूलियां ईपीए विधि 1615 प्रदर्शन स्वीकृति मानदंडों (तालिका 11) से मुलाकात की और दूसरों 33,37,38 द्वारा रिपोर्ट उन लोगों के लिए समान हैं। LFB नमूनों से murine नोरोवायरस वसूलियां पोलियो वायरस के उन लोगों की तुलना में काफी कम थे और पोलियो वायरस विशेष स्वीकृति मानदंडों को पूरा नहीं होगा। अभिकर्मक ग्रेड पानी से कम murine नोरोवायरस वसूली के लिए कारणों से अनजान हैं। इस के साथ साथ परिणामों के लिए इसी प्रकार, करीम और colleaGues नल का पानी 39 से 4% की नोरोवायरस GI.1 के लिए एक वसूली की सूचना दी। ली एट अल। 37 murine नोरोवायरस और 18% की मानव नोरोवायरस GII.4 और क्रमशः, डिस्क फिल्टर का उपयोग आसुत जल से 26% के लिए मतलब वसूलियां की सूचना दी। ली और उनके सहयोगियों के लिए इसी तरह की स्थिति का उपयोग करना, किम और को क्रमश: 38, इन वायरस के लिए 46% और 43% की वसूली मनाया। गिबन्स एट अल। 40 समुद्र के पानी से मानव नोरोवायरस GII.4 की 100% वसूली के आसपास प्राप्त है, लेकिन किम और को 38 सांद्रता समान या murine वायरस की काफी कम वसूलियां समुद्री जल की तुलना में अधिक है और कम से आसुत जल के लिए नमक के अलावा परिणामस्वरूप GII.4 वसूली में के बारे में एक दो गुना कमी में।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
1.5 mL tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-3000 | |
1°C cool brick | Diversified Biotech | BRIK-2501 | |
10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2 | Life Technologies | N8080130 | |
-20 °C freezer | VWR | 97043-346 | Must be a manual defrost freezer |
-70 °C or colder freezer | Thermo Scientific | MBF700LSAO-E | |
96-well chamber | Diversified Biotech | CHAM-1000 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Armored RNA EPA-1615 | Asuragen | Custom order | Used for quantifying the RT-qPCR assay |
Armored RNA Hepatitis G virus | Asuragen | 42024 | |
Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
Biosafety cabinet | NuAir Laboratory Equipment Supply | Labgard 437 ES | |
Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10856 | Crystalline grade or better |
Buffer AVE | Qiagen | 1026956 | Carrier RNA dilution buffer |
Buffer AVL | Qiagen | 19073 | Extraction buffer |
Carrier RNA | Qiagen | Not applicable | Use carrier RNA supplied with Buffer AVL |
Centrifuge bottles | Fisher Scientific | 05-562-23 or 05-562-26 | |
Centrifuge rotors | Beckman Coulter | 339080, 336380 | |
Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
Dithiothreitol (DTT) | Promega | P1171 | |
LightCycler® 480 Probes Master kit | Roche Diagnostics | 4707494001 | |
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps |
Microcide III | Fitzgerald | 99R-103 | |
Microseal 'A' film | Bio-Rad Laboratories | HSA5001 | Heat resistant |
Microseal 'F' film | Bio-Rad Laboratories | MSA1001 | Freezer resistant |
Mini-plate spinner | Labnet International | MPS1000 | |
Multichannel pipette | Rainin | L8-20 | |
Multi-tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-5000 | |
Optical reaction plate | Life Technologies | 4314320 | |
PCR nucleotide mix | Promega | U1515 | |
PCR plate | Bio-Rad Laboratories | HSS9601 | |
PCR-grade water | Roche | 3315932001 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | U.S. Biological | D9820 | |
Plate mixer | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
Prionex gelatin | Sigma Aldrich | G0411 | |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit |
Quantitative PCR thermal cycler | Life Technologies | 4351405 | |
Random primer | Promega | C1181 | |
Reagent Reservoir | Fisher Scientific | 21-381-27E | |
Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | 367501 | |
RNase Inhibitor | Promega | N2515 or N2615 | |
ROX reference dye | Life Technologies | 12223 | |
SuperScript II or III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-022 or 18080044 | |
Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
Thermal cycler | Life Technologies | 4314879 | |
Trisma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Vivaspin 20 centrifugal concentrator units | Sartorius-Stedim | VS2022 |