Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.
EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.
Kvantitativ PCR (qPCR, se supplerende materialer for definisjoner av begrepene som brukes i dette manuskriptet) og revers transkripsjon-qPCR (RT-qPCR) er verdifulle verktøy for å oppdage og kvantifisere menneske enteriske virus i miljø- og drikker vann, og spesielt for mange virus som gjør ikke replikere eller replikere dårlig i cellekultursystemer. Begge verktøyene har vist at mange virustyper er til stede i miljøet og drikke vannet over hele verden 1-6. Deres bruk sammen med sekvensering av amplifiserte genomiske fragmenter i løpet av sykdomsutbrudd undersøkelser har gitt bevis for vannbårne virusoverføring, ettersom de har vist at viruset funnet i drikkevann er identisk med den som kaster av utbrudds pasienter 7-10.
Både qPCR og RT-qPCR er nyttige folkehelse verktøy. For eksempel er data fra studier utført av US Environmental Protection Agency (EPA) viste en sterk sammenheng værelom indikatormålinger av qPCR og helseeffekter i fritids farvann. Som et resultat av EPA endelige 2012 Rekreasjons Vann kvalitetskriteriene omfatter en qPCR fremgangsmåte for å overvåke badeplasser 11,12. Borchardt og kolleger fant også en sterk sammenheng mellom akutt gastroenteritt i lokalsamfunn som bruker ubehandlet grunnvann og virus i grunnvann som målt ved RT-qPCR en.
Hensikten med denne artikkelen er å beskrive den molekylære analysedelen av EPA Method 1615 13,14. Denne analysen anvender RT-qPCR for å gi et kvantitativt estimat av enterovirus og norovirus genomiske kopier (GC) per liter, basert på det opprinnelige volumet av miljømessige eller drikkevann ført gjennom en elektropositiv filter. En oversikt over den molekylære prosedyren er vist i figur 1. Protocol seksjon 1 detaljer av prosedyrer for fremstilling av standardkurven. Disse standardene er fremstilt av et reagens som inneholder en RNEn kopi av target-sekvensen for alle primer / probesett. Avsnitt 2 beskriver tertiære konsentrasjonen prosedyren. Seksjon 3 gir fremgangsmåten for å ekstrahere RNA fra den konsentrerte vann og kontrollprøver. RNA fra hver testprøve revers transkribert ved hjelp tredoble analyser og tilfeldige primere til prime transkripsjon (§ 4). CDNA fra hver revers transkripsjonsreaksjon er delt i fem separate virus-spesifikke analyser som er analysert i triplikat ved qPCR (avsnitt 5, figur 2). Analysen bruker primere og prober fra vitenskapelig litteratur (tabell 1) som er utviklet for å oppdage mange enterovirus og noroviruses og et reagens som inneholder hepatitt G RNA til å identifisere testprøver som er hemmende for RT-qPCR 15.
Store nasjonale studier av viral forurensning av kilde- og drikke farvann krever bruk av flere analytiske laboratorier. Under disse betingelser er en standard metode for å sikre at data genereres av flere laboratorier er sammenlignbare. Det finnes mange publiserte molekylære metoder for viruskontroll, men svært få standardiserte molekylære metoder. EPA Method 1615 er en standardisert metode spesielt utviklet for påvisning av enterovirus og norovirus i vann matriser av RT-qPCR. Standardiserte molekylære metoder er tilgjengelige for virus blir oppdaget i matvarer (CEN / ISO TS 15216-1 og CEN / ISO TS 15216-2, 7 april 2013) 16,17 og har blitt brukt til påvisning av hepatitt A virus og norovirus våren vann 16. Alle standard metoder må inneholde kvalitet Ytelse og kriterier for å minimere inter- og intra-laboratoriet variasjon og falske positive data på grunn av laboratorie forurensning. For ytterligere å redusere falske data, EPA Method 1615 følger EPAs veiledning på molekylære metoder, 18 som fastsetter separasjon av arbeid under bearbeiding og én måte arbeidsflyt. Det inkluderer en hepatitt G 1,19 internkontroll og rutiner for å minimere falske negative resultater på grunn av hemmere av RT-qPCR 15. Den bruker kvantitative analyser sammen med standardiserte mengder av både vann samplet og vann analyseres, slik at alle feltdata er uttrykt i genomiske kopier pr liter av feltet eller drikkevann samplet. Selv om effektiv enkelt rør (ett trinn) RT-PCR-analyser er tilgjengelige i handelen, med hensikt bruker metoden separate analyser. Dette har den ulempe av å minimere mengden av prøve som kan analyseres i hver reaksjon, men gir større fleksibilitet i bruken av flere primersettene. RT-qPCR analysene er begrenset av og bare så god som primere og prober som brukes og sannsynligvis ingen primer sett vil oppdage alle virusvarianter innenfor en gruppe. Den enterovirus primersett ble valgt fordiDet er rettet mot konserverte 5'-ikke-kodende region, 20,21 påviser et bredt utvalg av enterovirus-serotyper, og virus påvist av den er forbundet med helseeffekter av forbruk av ubehandlede grunnvann 1. To primersettene brukes til deteksjon av genogroup jeg noroviruses 22,23. Den første ble valgt på grunn av den sterke korrelasjonen mellom helseeffekter hos små barn og detektert virus 1. Den andre genogroup jeg primer satt og primer settet som brukes for genogroup II noroviruses ble valgt fordi de oppdager det bredeste utvalg av stammer 24,25.
På tross av de store fordelene med qPCR og RT-qPCR fremgangsmåter for påvisning av virus-RNA i vann, er det flere begrensninger. Først, både infeksiøse og ikke-infeksiøs viruspartikler, inkludert de som inaktiveres av desinfeksjonsmidler, kan forsterkes ved disse fremgangsmåter. Resultatene av Borchardt tyder på at dette er et mindre problem for ubehandlet grunnvann fROM akviferer ligner på dem i de samfunnene studert enn for desinfiserte overflatevann 1. For dyrkbare virus dette problemet kan overvinnes ved hjelp av PCR i kombinasjon med kultur 26,27. Problemet har også vært adressert for noen virus ved anvendelse av nukleinsyre-tverrbindingsmidler 28-30. Denne siste metoden er mer effektiv for virus inaktivert av hypokloritt og ikke effektive for de inaktivert av UV.
En annen begrensning av disse molekylære fremgangsmåtene er at volumet av konsentrert prøve som kan analyseres typisk er mye mindre enn den som anvendes for kultur prosedyrer 6,31. Dette problem er ofte håndteres enten ved å anvende en polyetylenglykol-basert fremgangsmåte for standard sekundær konsentrasjonen av organisk flokkulering, som tillater prøven å bli resuspendert i et mindre volum, eller ved tilsetning av et tertiært prøvekonsentrasjon trinn 6,32,33 . Metode 1615 bruker sentrifugeugal ultrafiltrering for å gi høyere konsentrasjon. Sentrifugal ultrafiltrering fjerner vann og komponentene mindre enn 30.000 dalton som resulterer i både konsentrasjonen av alle virus i testprøver og en reduksjon i små molekylvekt inhibitorer av molekylære assays. Dette tertiære konsentrasjonstrinn resulterer i en total konsentrasjon faktor på> 10 5 for en hvilken som helst virus som var til stede i vannet som blir testet.
En tredje begrensning er tilstedeværelsen av inhibitorer av molekylære prosedyrer i miljøprøver. Selv om tallrike fremgangsmåter for å fjerne inhibitorer har blitt utviklet, er ingen metode effektiv for alle vann matriser og virustyper 6,34,35, som gjør bruk av interne kontroller utformet for å anslå graden av inhibering avgjørende. Hepatitt-G-reagenset anvendt i denne fremgangsmåten tilfredsstiller dette krav ved å tilveiebringe et konstant nivå av viralt RNA i alle reaksjoner og en RT-qPCR-analyse for å beregne inhibering. Når de beste av than inhibitor fjerning tilnærminger ikke klarer å fjerne hemming, eksempel konsentrater kan fortynnes så lenge viruskonsentrasjonen er høyere enn inhibitorkonsentrasjoner 14,15.
Standardkurven fremgangsmåte som er beskrevet heri, har både fordeler og en stor begrensning. En fordel er at det anvendte reagens leverer alle de nødvendige komponenter i et enkelt reagens, slik at en enkelt kontroll for å brukes for alle analyser. Denne reagensen er spesielt en fordel for norovirus analyser. Norovirus partikler kan bare fås fra infiserte individer som gjør det svært vanskelig å oppnå viruspartikler for anvendelse som standarder. En mer viktig fordel er at det gir et RNA-standard for alle målrettet RNA-virus i en reagens, som har et RNA-standard er avgjørende for nøyaktig kvantifisering av RNA 36. Imidlertid er dens evne til å kvantifisere virus nøyaktig begrenset av det faktum at matrise virkninger ikke blir tatt hensyn til. Dette betyr at genomisk kopitallverdier kan ikke anses som absolutte og bør bare vurderes i relative termer. Det anbefales at et tilstrekkelig antall av standard kurvearbeidslager alikvoter (trinn 1.2) fremstilles for å dekke fullstendig studier. For eksempel gir hver 250 mL delmengde tilstrekkelig reagent for 6 RT plater. Dersom det er kjent at en studie vil kreve analyse av 500 prøver, ville minst 12 alikvoter være nødvendig (500 prøver / syv samplinger pr plate RT RT / 6 plater pr delmengde).
EPA Method 1615 er en forestilling basert metode. Mange produsenter gjør tilsvar reagenser til de som er nevnt her, og disse reagenser kan erstattes så lenge ytelseskriteriene er oppfylt. Standardkurven, som også fungerer som en positiv RT-qPCR kontroll, er av verdi i feilsøking ytelsesproblemer. Ytelse kan avta på grunn av degradering av RNA, reagent holdbarhet, svikt i frysere, instrument kalibrering og teknisk feil. Ytelsesproblemer bør være mistankeed hvis standardkurver avvike fra det som er vist i figur 4, eller hvis de ikke oppfyller de spesifiserte funksjonene for standardkurver. RT-qPCR-analyse er ganske robust; fullstendig fiasko skyldes sannsynligvis feil håndtering av RNA eller teknisk feil (for eksempel en manglende reagens). Stor forsiktighet bør utvises ved håndtering av RNA prøver mellom utvinning og RT skritt for å redusere RNA degradering fra ribonucleases.
Poliovirus inngang fra bakke og reagenskvalitet farvann og muse norovirus inngang fra grunnvann møtte EPA Method 1615 ytelse akseptkriterier (tabell 11), og er lik de som er rapportert av andre 33,37,38. Murine Norovirus inngang fra LFB prøvene var mye lavere enn de av poliovirus, og ville ikke ha oppfylt poliovirus spesifikke akseptkriterier. Årsakene til lavere muse norovirus utvinning fra reagenskvalitet vannet er ukjent. I likhet med resultatene heri, Karim og colleagues rapporterte en bedring for norovirus GI.1 på 4% fra springvann 39. Lee et al. 37 rapporterte gjennomsnitts inngang for murine norovirus og menneskelig norovirus GII.4 på 18% og 26% fra destillert vann ved hjelp av skivefiltre, henholdsvis. Med lignende forhold til Lee og kolleger, Kim og Ko observert inngang på 46% og 43% for disse virusene, henholdsvis 38. Gibbons et al., 40 oppnås omkring 100% utbytte av human norovirus GII.4 fra sjøvann, men Kim og Ko 38 funnet at tilsetning av salt til destillert vann ved konsentrasjoner tilsvarende eller høyere enn sjøvann betydelig redusert inngang på den murine virus og resulterte i omtrent et to-gangers reduksjon i GII.4 utvinning.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
1.5 mL tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-3000 | |
1°C cool brick | Diversified Biotech | BRIK-2501 | |
10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2 | Life Technologies | N8080130 | |
-20 °C freezer | VWR | 97043-346 | Must be a manual defrost freezer |
-70 °C or colder freezer | Thermo Scientific | MBF700LSAO-E | |
96-well chamber | Diversified Biotech | CHAM-1000 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Armored RNA EPA-1615 | Asuragen | Custom order | Used for quantifying the RT-qPCR assay |
Armored RNA Hepatitis G virus | Asuragen | 42024 | |
Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
Biosafety cabinet | NuAir Laboratory Equipment Supply | Labgard 437 ES | |
Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10856 | Crystalline grade or better |
Buffer AVE | Qiagen | 1026956 | Carrier RNA dilution buffer |
Buffer AVL | Qiagen | 19073 | Extraction buffer |
Carrier RNA | Qiagen | Not applicable | Use carrier RNA supplied with Buffer AVL |
Centrifuge bottles | Fisher Scientific | 05-562-23 or 05-562-26 | |
Centrifuge rotors | Beckman Coulter | 339080, 336380 | |
Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
Dithiothreitol (DTT) | Promega | P1171 | |
LightCycler® 480 Probes Master kit | Roche Diagnostics | 4707494001 | |
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps |
Microcide III | Fitzgerald | 99R-103 | |
Microseal 'A' film | Bio-Rad Laboratories | HSA5001 | Heat resistant |
Microseal 'F' film | Bio-Rad Laboratories | MSA1001 | Freezer resistant |
Mini-plate spinner | Labnet International | MPS1000 | |
Multichannel pipette | Rainin | L8-20 | |
Multi-tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-5000 | |
Optical reaction plate | Life Technologies | 4314320 | |
PCR nucleotide mix | Promega | U1515 | |
PCR plate | Bio-Rad Laboratories | HSS9601 | |
PCR-grade water | Roche | 3315932001 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | U.S. Biological | D9820 | |
Plate mixer | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
Prionex gelatin | Sigma Aldrich | G0411 | |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit |
Quantitative PCR thermal cycler | Life Technologies | 4351405 | |
Random primer | Promega | C1181 | |
Reagent Reservoir | Fisher Scientific | 21-381-27E | |
Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | 367501 | |
RNase Inhibitor | Promega | N2515 or N2615 | |
ROX reference dye | Life Technologies | 12223 | |
SuperScript II or III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-022 or 18080044 | |
Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
Thermal cycler | Life Technologies | 4314879 | |
Trisma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Vivaspin 20 centrifugal concentrator units | Sartorius-Stedim | VS2022 |