Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.
EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.
PCR cuantitativa (qPCR, ver materiales suplementarios para las definiciones de los términos utilizados en este manuscrito) y transcriptasa reversa-qPCR (RT-qPCR) son herramientas valiosas para la detección y cuantificación de virus entéricos humanos en el medio ambiente y bebiendo aguas, y en especial para muchos virus que hacen no replicar o replicar mal en sistemas de cultivo celular. Ambas herramientas han demostrado que muchos tipos de virus están presentes en aguas ambientales y de agua potable en todo el mundo 6.1. Su uso junto con la secuenciación de los fragmentos genómicos amplificados durante las investigaciones brote de la enfermedad ha proporcionado evidencia de la transmisión del virus a base de agua, ya que han demostrado que el virus encontrado en el agua potable es idéntico al cobertizo por los pacientes de brotes 7-10.
Tanto qPCR y RT-qPCR son herramientas de salud pública útiles. Por ejemplo, los datos de los estudios realizados por la Agencia de Protección Ambiental (EPA) mostraron una relación fuerte seamediciones de los indicadores de interpolación por qPCR y efectos sobre la salud en las aguas de recreo. Como resultado, finales de 2012 Criterios de Calidad del Agua Recreativa de la EPA incluye un método qPCR para vigilar las playas recreativas 11,12. Borchardt y sus colegas también encontraron una fuerte relación entre la gastroenteritis aguda en las comunidades que utilizan las aguas subterráneas sin tratar y virus en las aguas subterráneas, medida por RT-qPCR 1.
El propósito de este trabajo es describir el componente de ensayo molecular del Método EPA 1615 13,14. Este ensayo usa RT-qPCR para proporcionar una estimación cuantitativa de enterovirus y norovirus copias genómicas (CG) por litro basado en el volumen original de agua del medio ambiente o beber pasado a través de un filtro de electropositivo. Una visión general del procedimiento molecular se muestra en la Figura sección 1. Protocolo 1 detalla los procedimientos para la preparación de la curva estándar. Estos estándares se preparan a partir de un reactivo que contiene un RNUna copia de la secuencia diana para todos los conjuntos de cebador / sonda. Sección 2 describe el procedimiento de concentración terciario. Sección 3 da el procedimiento para la extracción de ARN de las muestras de agua y control concentrado. El ARN de cada muestra de prueba se transcribe invertir utilizando ensayos por triplicado y cebadores aleatorios para cebar la transcripción (Sección 4). El ADNc de cada reacción de transcripción inversa se divide en cinco ensayos específicos del virus separadas que se analizan por triplicado mediante qPCR (Sección 5; Figura 2). El ensayo usa cebadores y sondas de la literatura científica (Tabla 1) que están diseñados para detectar muchos enterovirus y norovirus y un reactivo que contiene hepatitis G ARN para identificar muestras de ensayo que son inhibidores de la RT-qPCR 15.
Estudios nacionales a gran escala de la contaminación viral de las fuentes de agua y beber requieren el uso de múltiples laboratorios analíticos. Bajo estas condiciones, se necesita un método estándar para asegurar que los datos generados por los múltiples laboratorios es comparable. Hay muchos métodos moleculares publicados para la detección de virus, pero muy pocos métodos moleculares normalizados. Método EPA 1615 es un método estandarizado diseñado específicamente para la detección de enterovirus y norovirus en matrices de agua por RT-qPCR. Métodos moleculares estandarizados están disponibles para la detección de virus en los alimentos (CEN / ISO TS 15.216-1 y CEN / ISO TS 15216-2; 07 de abril 2013) 16,17 y se han aplicado a la detección de virus de hepatitis A y el norovirus en primavera agua 16. Todos los métodos estándar deben incluir controles de calidad, los criterios para minimizar internacional y la variación intra-laboratorio y datos falsos positivos debido a la contaminación de laboratorio. Para reducir aún más datos falsos, EMétodo PA 1615 sigue la orientación de la EPA sobre los métodos moleculares, 18 que estipula la separación de trabajo durante el proceso y una forma de flujo de trabajo. Incluye una hepatitis G 1,19 de control y procedimientos para minimizar los resultados negativos falsos debido a inhibidores de la RT-qPCR 15 interna. Utiliza ensayos cuantitativos junto con volúmenes estandarizados, tanto de agua muestreado y analizado el agua de modo que todos los datos de campo se expresa en copias genómicas por litro del campo o beber agua muestreada. Aunque solo tubo eficiente (una etapa) ensayos de RT-PCR están disponibles comercialmente, el método utiliza intencionadamente ensayos separados. Esto tiene la desventaja de reducir al mínimo la cantidad de muestra que puede ensayarse en cada reacción, pero da una mayor flexibilidad en el uso de múltiples conjuntos de cebadores. Ensayos de RT-qPCR están limitados por y sólo tan bueno como los cebadores y sondas utilizados y probablemente ningún conjunto de cebadores detectarán todas las variantes del virus dentro de un grupo. El conjunto de cebadores enterovirus fue elegido porquese dirige a la región 5 'no codificante conservada, 20,21 detecta una amplia variedad de serotipos de enterovirus y virus detectados por ella están asociados con efectos en la salud por el consumo de aguas subterráneas sin tratar 1. Dos conjuntos de cebadores se utilizan para la detección de genogrupo I norovirus 22,23. El primero fue elegido debido a la fuerte correlación entre los efectos de salud en los niños pequeños y detecta virus 1. El segundo genogrupo I conjunto de cebadores y el conjunto de cebadores utilizado para genogrupo II norovirus fueron escogidos porque detectan la más amplia variedad de cepas 24,25.
A pesar de las ventajas principales de los procedimientos de RT-qPCR y qPCR para la detección de ARN viral en el agua, hay varias limitaciones. En primer lugar, ambas partículas de virus infecciosos y no infecciosos, incluidos los inactivado por los desinfectantes, se pueden amplificar por estos procedimientos. Los resultados de Borchardt sugieren que esto es un problema menor para las aguas subterráneas sin tratar facuíferos rom similares a los de las comunidades estudiadas que para las aguas superficiales desinfectados 1. Para los virus cultivables este problema se puede superar usando PCR en combinación con la cultura 26,27. El problema también ha sido abordado por algunos virus mediante el uso de agentes de reticulación de ácido nucleico 28-30. Este último enfoque es más eficaz para los virus inactivados por hipoclorito y no eficaces para aquellos inactivado por UV.
Una segunda limitación de estos procedimientos moleculares es que el volumen de la muestra concentrada que se puede ensayar típicamente es mucho menor que la utilizada para procedimientos de cultivo de 6,31. Este problema es a menudo manejado por cualquiera de sustitución de un procedimiento basado en el polietilenglicol para la concentración secundaria estándar por floculación orgánica, lo que permite que la muestra se resuspendió en un volumen más pequeño, o mediante la adición de una etapa de concentración de la muestra terciaria 6,32,33 . Método 1615 utiliza Centrifultrafiltración ugal para proporcionar concentración terciario. Ultrafiltración centrífuga elimina el agua y los componentes de menos de 30.000 Daltons resultantes tanto en concentración de cualquier virus en muestras de ensayo y una reducción en pequeñas inhibidores de peso molecular de ensayos moleculares. Este terciarios resultados etapa de concentración en un factor de concentración total de> 10 5 para cualquier virus que estaba presente en el agua están probando.
Una tercera limitación es la presencia de inhibidores de procedimientos moleculares en muestras ambientales. Aunque se han desarrollado numerosos enfoques para eliminar los inhibidores, ningún enfoque es eficaz para todas las matrices de agua y tipos de virus 6,34,35, haciendo que el uso de controles internos diseñados para estimar el nivel de inhibición esencial. El reactivo de la hepatitis G utilizado en este método satisface este requisito al proporcionar un nivel constante de ARN viral en todas las reacciones y un ensayo de RT-qPCR para la estimación de la inhibición. Cuando el mejor de tél inhibidor enfoques de eliminación no logran eliminar la inhibición, concentrados de muestra se pueden diluir, siempre y cuando las concentraciones de virus son más altas que las concentraciones de inhibidor 14,15.
El procedimiento descrito en este documento curva estándar tiene tanto ventajas como una limitación importante. Una ventaja es que el reactivo utilizado materiales de todos los componentes necesarios en un solo reactivo, lo que permite un único control que se utilizará para todos los ensayos. Este reactivo es especialmente una ventaja para los ensayos de norovirus. Partículas norovirus sólo se pueden obtener a partir de individuos infectados por lo que es muy difícil obtener partículas virales para su uso como estándares. Una ventaja más importante es que proporciona un estándar para todos los virus de ARN de ARN específicas en un reactivo, como teniendo un nivel de ARN es esencial para la cuantificación exacta de ARN 36. Sin embargo, su capacidad de cuantificar virus precisión está limitada por el hecho de que los efectos de matriz no se tienen en cuenta. Esto significa que copia genómicavalores de números no pueden considerarse absoluta y sólo deben considerarse en términos relativos. Se recomienda que un número suficiente de curva estándar alícuotas de valores de trabajo (paso 1.2) estar preparado para cubrir los estudios completos. Por ejemplo, cada 250 l alícuota proporciona suficiente reactivo para 6 placas de RT. Si se sabe que un estudio requerirá análisis de 500 muestras, se necesitaría un mínimo de 12 alícuotas (500 muestras / 7 muestras por placa RT / 6 placas RT por alícuota).
Método EPA 1615 es un método basado en el rendimiento. Muchos fabricantes hacen reactivos equivalentes a los especificados en este documento y estos reactivos pueden ser sustituidos, siempre y cuando se cumplan los criterios de rendimiento. La curva patrón, que también sirve como un control de RT-qPCR positivo, es de valor en solucionar problemas de rendimiento. El rendimiento puede disminuir debido a la degradación del ARN, la vida útil de reactivo, el fracaso de los congeladores, la calibración del instrumento, y el error técnico. Problemas de rendimiento deben ser sospechosoed si las curvas de calibración diferentes de la mostrada en la Figura 4 o si no cumplen con la especificación de rendimiento para las curvas estándar. El ensayo de RT-qPCR es bastante robusto; completo fracaso es probablemente debido al manejo inadecuado de ARN o error técnico (por ejemplo, un reactivo faltante). Gran se debe tener cuidado en el manejo de muestras de ARN entre la extracción y la etapa de RT para reducir la degradación del ARN de las ribonucleasas.
Recuperaciones poliovirus de las aguas subterráneas y de grado reactivo y recuperaciones de norovirus murino de las aguas subterráneas se reunieron el Método EPA 1615 los criterios de aceptación de rendimiento (Cuadro 11) y son similares a los reportados por otros 33,37,38. Recuperaciones norovirus murino de muestras LFB eran mucho más bajos que los de los virus de la polio y no habrían cumplido con los criterios de aceptación-poliovirus específico. Las razones de la recuperación norovirus murino menor de agua grado reactivo son desconocidos. Similar a los resultados del presente documento, Karim y colleagues reportaron una recuperación para el norovirus GI.1 del 4% del agua del grifo 39. Lee et al. 37 informó recuperaciones medias para norovirus murino y GII.4 norovirus humana de 18% y 26% de agua destilada utilizando filtros de disco, respectivamente. Usando condiciones similares a Lee y colegas, Kim y Ko observaron recuperaciones de 46% y 43% para estos virus, respectivamente 38. Gibbons et al. 40 obtuvieron alrededor de 100% de recuperación de GII.4 norovirus humano a partir de agua de mar, pero Kim y Ko 38 encontraron que la adición de sal al agua destilada a concentraciones similares o superiores a agua de mar reduce significativamente la recuperación del virus murino y resultó en una reducción de dos veces en la recuperación GII.4.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
1.5 mL tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-3000 | |
1°C cool brick | Diversified Biotech | BRIK-2501 | |
10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2 | Life Technologies | N8080130 | |
-20 °C freezer | VWR | 97043-346 | Must be a manual defrost freezer |
-70 °C or colder freezer | Thermo Scientific | MBF700LSAO-E | |
96-well chamber | Diversified Biotech | CHAM-1000 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Armored RNA EPA-1615 | Asuragen | Custom order | Used for quantifying the RT-qPCR assay |
Armored RNA Hepatitis G virus | Asuragen | 42024 | |
Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
Biosafety cabinet | NuAir Laboratory Equipment Supply | Labgard 437 ES | |
Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10856 | Crystalline grade or better |
Buffer AVE | Qiagen | 1026956 | Carrier RNA dilution buffer |
Buffer AVL | Qiagen | 19073 | Extraction buffer |
Carrier RNA | Qiagen | Not applicable | Use carrier RNA supplied with Buffer AVL |
Centrifuge bottles | Fisher Scientific | 05-562-23 or 05-562-26 | |
Centrifuge rotors | Beckman Coulter | 339080, 336380 | |
Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
Dithiothreitol (DTT) | Promega | P1171 | |
LightCycler® 480 Probes Master kit | Roche Diagnostics | 4707494001 | |
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps |
Microcide III | Fitzgerald | 99R-103 | |
Microseal 'A' film | Bio-Rad Laboratories | HSA5001 | Heat resistant |
Microseal 'F' film | Bio-Rad Laboratories | MSA1001 | Freezer resistant |
Mini-plate spinner | Labnet International | MPS1000 | |
Multichannel pipette | Rainin | L8-20 | |
Multi-tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-5000 | |
Optical reaction plate | Life Technologies | 4314320 | |
PCR nucleotide mix | Promega | U1515 | |
PCR plate | Bio-Rad Laboratories | HSS9601 | |
PCR-grade water | Roche | 3315932001 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | U.S. Biological | D9820 | |
Plate mixer | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
Prionex gelatin | Sigma Aldrich | G0411 | |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit |
Quantitative PCR thermal cycler | Life Technologies | 4351405 | |
Random primer | Promega | C1181 | |
Reagent Reservoir | Fisher Scientific | 21-381-27E | |
Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | 367501 | |
RNase Inhibitor | Promega | N2515 or N2615 | |
ROX reference dye | Life Technologies | 12223 | |
SuperScript II or III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-022 or 18080044 | |
Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
Thermal cycler | Life Technologies | 4314879 | |
Trisma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Vivaspin 20 centrifugal concentrator units | Sartorius-Stedim | VS2022 |