Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.
EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.
Kantitatif PCR (qPCR; Bu yazıda kullanılan terimlerin tanımları için tamamlayıcı malzemeler) ve transkripsiyon-qPCR (RT-qPCR) sular tespit ve çevre insan enterik virüsler miktarının ve içme değerli araçlardır ve özellikle bunu birçok virüs için ters çoğaltmak ya da hücre kültür sistemlerinde kötü çoğaltma değil. Her iki araç birçok virüs türleri dünyada 1-6 genelinde çevresel ve içme sularında mevcut olduğunu göstermiştir. Onlar içme suyunda bulunan virüs salgını hastaların 7-10 tarafından bu kulübe aynı olduğunu göstermiştir hastalık mihrak araştırmaları sırasında güçlendirilmiş genomik fragmanların sıralama ile birleştiğinde Bunların kullanımı, su bazlı virüs iletimi için kanıt sunmuştur.
QPCR ve RT-qPCR Hem kullanışlı halk sağlığı araçlarıdır. Örneğin, ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından yürütülen çalışmalardan elde edilen veriler güçlü bir ilişki olması gösterdiqPCR ve eğlence sularında sağlık etkileri ile ara gösterge ölçümleri. Bunun bir sonucu olarak, EPA nihai 2012 Dinlenme Su Kalitesi Kriterleri dinlenme plajları 11,12 izlenmesi için bir qPCR yöntemi içerir. RT-qPCR 1 ile ölçülen Borchardt ve arkadaşları da yeraltı suları tedavi edilmemiş yeraltı ve virüs kullanılarak toplumlarda akut gastroenterit arasında güçlü bir ilişki bulunmuştur.
Bu yazının amacı, EPA Method 1615 13,14 moleküler tahlil bileşenini tanımlamaktır. Bu deney, bir elektropozitif bir filtreden enterovirüs ve başarılı çevresel veya içme suyu orijinal hacmine dayalı olarak litre başına norovirus genomik kopyalarının (GC) nicel bir tahminde bulunmak için RT-qPCR kullanır. Moleküler prosedürün bir bakış standart eğri hazırlamak için 1. Protokol bölüm Şekil 1 ayrıntıları prosedürler gösterilir. Bu standartlar, RN içeren bir reaktif hazırlanırTüm primer / prob setleri için hedef dizinin bir kopyası. Bölüm 2 üçüncül konsantrasyon prosedürü anlatılmaktadır. Bölüm 3 konsantre su ve kontrol numunelerinin RNA çıkarmak için prosedürü vermektedir. Her bir test numunesi ile ilgili RNA ters üç kopyalı tahliller ve birinci transkripsiyon (Bölüm 4) rasgele primerler kullanılarak transkribe edilmektedir. (Şekil 2, Bölüm 5), her ters transkripsiyon reaksiyonu cDNA qPCR üç kopya halinde analiz edilir Beş ayrı virüse spesifik tahlilleri ayrılmıştır. Deney birçok enterovirüsleri ve Noroviruses RT-qPCR 15 inhibe eden test örneklerini tespit etmek hepatit G RNA ihtiva eden bir reaktif tespit etmek için tasarlanmıştır, bilimsel literatürde (Tablo 1) primerler ve problar kullanılır.
Kaynak ve içme sularının viral bulaşma Büyük ölçekli ulusal çalışmalar birden analitik laboratuarlar kullanılmasını gerektirir. Bu koşullar altında standart bir yöntemdir birden laboratuvarlar tarafından üretilen veriler karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için gereklidir. Virüs tespiti için yayınlanmış birçok moleküler yöntemler, ama çok az standardize moleküler yöntemler vardır. EPA Method 1615, özellikle RT-qPCR su matrislerde Enterovirüs ve norovirusa tespiti için tasarlanmış standart bir yöntemdir. Standardize moleküler yöntemler gıdalarda virüs tespiti için mevcuttur; 16,17 (15216-2 CEN / ISO TS 15216-1 ve CEN / ISO TS 7 Nisan 2013) ve hepatit A virüsü tespit ve norovirus ilkbaharda uygulandı su 16. Tüm standart yöntemler kalite performans kontrolleri ve kriterleri arası en aza indirmek ve içi laboratuvar varyasyonu nedeniyle laboratuvar kontaminasyonu yanlış pozitif verileri içermelidir. Ayrıca, E yanlış veri azaltmak içinPensilvanya Yöntem 1615 işlemci ve tek yönlü iş akışı sırasında iş ayrılmasını öngören moleküler yöntemler üzerinde EPA'nın rehberlik, 18 izler. Bir hepatit G 1,19 iç kontrol nedeniyle RT-qPCR 15 inhibitörleri yanlış negatif sonuç en aza indirmek için prosedürleri içermektedir. Tüm alan veri alanının litre veya su örneklenmiş içme başına genomik kopya ifade edilir, böylece analiz örneklenmiş su ve suyla standardize hacimleri ile birlikte niceliksel tahlilleri kullanır. Etkin tek bir tüp (tek-aşama) RT-PCR deneyleri, ticari olarak mevcut olmakla birlikte, bu yöntem kasıtlı ayrı analizler kullanılır. Bu, her bir reaksiyonda analiz edilebilir numune miktarını minimize etme dezavantajına sahiptir, ancak birden fazla primer kümelerinin kullanımı daha fazla esneklik sağlar. Primerleri ve sondaları kullanılan ve büyük olasılıkla hiçbir astar seti bir grup dahilindeki tüm virüs türevlerini algılamak gibi RT-qPCR deneyleri ile ve sadece iyi sınırlıdır. Enterovirüs primer seti nedeniyle seçildiBu 20,21 enterovirüs serotiplerinin çeşitli algılar korunmuş 5 'kodlamayan bölgeye hedef ve bunun ile tespit virüs, işlemden geçirilmemiş yer altı 1 tüketiminden sağlık etkileri ile ilişkilidir. Iki astar set I 22,23 Noroviruses genogroup saptanması için kullanılır. İlk küçük çocuklarda sağlık etkileri arasındaki güçlü korelasyon nedeniyle seçilmiş ve virüs 1. tespit edildi. Onlar suşları 24,25 geniş çeşitliliği tespit çünkü set edilen primer ikinci genogroup ve genogroup II Noroviruses için kullanılan primer seti seçildi.
Su içinde viral RNA saptanması için qPCR RT-qPCR prosedürlerinin en önemli avantajlara rağmen, bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, dezenfektanlar tarafından inaktive de dahil olmak üzere, her iki bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virüs parçacıkları, bu işlemler ile amplifiye edilebilir. Borchardt sonuçları bu tedavi edilmemiş yeraltı f bir sorun daha az olduğunu göstermektedirtopluluklarda benzer rom akiferler dezenfekte yüzey suları 1 den okudu. Kültürlenebilir virüs için bu sorun, kültür 26,27 ile birlikte PCR kullanılarak aşılabilir. Sorun, nükleik asit çapraz bağlama maddeleri 28-30 kullanımı ile, bazı virüs ele alınmıştır. Bu yaklaşım virüs hipokloritin inaktive edilmiş ve UV ile inaktive olanlar için etkili değildir için daha etkilidir.
Bu moleküler prosedürlerin İkinci bir kısıtlama tipik olarak analiz edilebilir konsantre edildi numune hacmi kültürü prosedürler 6,31 için kullanılan daha küçük olmasıdır. Bu sorun, genellikle her iki örnek daha küçük bir hacimde yeniden asıldı ve bir üçüncül Örnek konsantrasyonu aşama 6,32,33 eklenerek sağlar Organik flokülasyon standart sekonder konsantrasyonu temin etmek üzere bir polietilen glikol tabanlı bir prosedür ile ikame tarafından işlenir . Yöntem 1615 Santrifüj kullanırugal ultrafiltrasyon tertier konsantrasyonu elde edildi. Santrifüj ultrafiltrasyon su ve test numunelerinde herhangi bir virüsün hem de konsantrasyon ve moleküler deneylerinin küçük molekül ağırlıklı inhibitörlerinin bir azalma ile elde edilen bileşenler daha az 30.000 Dalton kaldırır. Su içinde mevcut olan herhangi bir virüs için> 10 5 genel bir yoğunlaşma katsayısına bu tertier konsantrasyon adımı sonuçları, test edilen.
Üçüncü bir kısıtlama çevre numuneleri içinde molekül prosedürlerin önleyicileri varlığıdır. Inhibitörleri kaldırmak için çok sayıda yaklaşımlar geliştirilmiş olmasına rağmen, hiçbir yaklaşım temel inhibisyon seviyesini tahmin etmek için tasarlanmıştır iç kontrollerin yararlanarak, tüm su matrisler ve virüs türleri 6,34,35 için etkilidir. Bu yöntemde kullanılan hepatit G reaktifi bütün reaksiyonlar ve inhibisyon tahmin edilmesi için bir RT-qPCR deneyinde viral RNA sabit bir seviyede sağlayarak bu gereksinimi karşılamaktadır. Ne zaman t iyiO örnek konsantreleri sürece virüs konsantrasyonları konsantrasyonları 14,15 inhibitörü daha yüksek olarak seyreltilmiş olabilir, kaldırma yaklaşımları inhibisyonu kaldırmak için başarısız inhibitör.
Burada açıklanan standart eğri prosedürü avantaj ve büyük bir sınırlama hem de sahiptir. Bir avantajı, reaktif madde, tek bir kontrol Tüm deneyler için kullanılacak sağlayan tek bir reaktif içinde Sarf gerekli tüm bileşenlerin kullanılmasıdır. Bu reaktif, özellikle norovirus deneyleri için bir avantajdır. Norovirus partiküllerinin, sadece çok zor standartlar olarak kullanım için, viral parçacıklar elde etmek hale enfekte bireylerden elde edilebilir. En önemli avantaj, bir RNA, standart RNA 36 doğru ölçümü için gerekli olan gibi, tek bir reaktif içinde hedeflenen tüm RNA virüsleri için bir RNA standart sağlamasıdır. Ancak bunun yanında, virüs ölçmek için kabiliyeti matriks etkileri dikkate alınmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Bu, genomik kopyasını demektirsayısı değerler, mutlak değerler olarak kabul edilemez ve sadece göreli olarak dikkate alınmalıdır. Bu standart eğri çalışma stok alikotları yeterli sayıda (1.2 adım) tam çalışmaları kapsayacak şekilde hazırlanmış olması tavsiye edilir. Örneğin, her 250 ul alikot 6 RT plakaları için yeterli bir reaktif sağlar. Bir çalışmada, 500 numune analiz gerektirir olacağı biliniyorsa, 12 alikotları en az (500 numune RT plaka başına / 7 numune / alikotundan başına 6 RT plakaları) ihtiyaç olacaktır.
EPA Method 1615 performansa dayalı bir yöntemdir. Birçok üretici, burada belirtilen eşdeğer reaktifler yapmak ve bu reaktifler sürece performans kriterleri karşılandığı gibi ikame edilebilir. Ayrıca pozitif bir RT-qPCR kontrol olarak hizmet vermektedir standart eğri, sorun performans sorunları değer taşımaktadır. Performans nedeniyle RNA bozulması, reaktif raf ömrü, dondurucular başarısızlığı, alet kalibrasyon ve teknik hata reddedebilirsiniz. Performans sorunları şüpheli olmalıonlar standart eğrileri için performans özelliklerini karşılamak değilse ed standart eğrileri Şekil 4'te gösterilen bu farklı ya da eğer. RT-qPCR tahlil oldukça sağlamdır; tam bir başarısızlık nedeniyle RNA veya teknik bir hata (örneğin, bir eksik reaktif) yanlış kullanım muhtemeldir. Büyük bir dikkatle çıkarma ve ribonükleazlar RNA bozulmasını azaltmak için RT adım arasında RNA örnekleri ele alınmalıdır.
Zemin ve reaktif dereceli suları ve yeraltı fare norovirus rücu Poliovirüs kazanımları EPA Method 1615 performans kabul kriterleri (Tablo 11) tanıştı ve diğerleri 33,37,38 tarafından bildirilen benzemektedir. LFB örneklerinden Murin norovirus kazanımları poliovirus oranla çok daha düşük olduğunu ve polio virüsünün özel kabul kriterleri yerine olmazdı. Reaktif dereceli sudan daha düşük fare norovirus kurtarma nedenleri bilinmemektedir. Bu tarifnamede sonuçlara benzer şekilde, Karim ve colleagues musluk suyu 39% 4 norovirus GI.1 bir iyileşme bildirmiştir. Lee et al. 37 sıçangil norovirusa ve% 18 insan norovirus GII.4 ve sırasıyla disk filtreleri kullanılarak damıtılmış su% 26 için ortalama geri kazanımını bildirilmiştir. Lee ve meslektaşları benzer şartları kullanarak, Kim ve Ko sırasıyla 38, bu virüsler için% 46 ve% 43 geri kazanımını gözlendi. Gibbons ve ark., 40, deniz suyundan, insan norovirus GII.4% 100 geri etrafında çevresel olarak elde ama Kim ve Ko 38 konsantrasyonları, benzer ya da murin virüs önemli ölçüde azaltılmış geri kazanımları deniz suyundan daha yüksek ve damıtılmış su tuz ilavesi sonuçlandığı bulunmuştur GII.4 kurtarma ile ilgili olarak iki kat azalma.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
1.5 mL tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-3000 | |
1°C cool brick | Diversified Biotech | BRIK-2501 | |
10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2 | Life Technologies | N8080130 | |
-20 °C freezer | VWR | 97043-346 | Must be a manual defrost freezer |
-70 °C or colder freezer | Thermo Scientific | MBF700LSAO-E | |
96-well chamber | Diversified Biotech | CHAM-1000 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Armored RNA EPA-1615 | Asuragen | Custom order | Used for quantifying the RT-qPCR assay |
Armored RNA Hepatitis G virus | Asuragen | 42024 | |
Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
Biosafety cabinet | NuAir Laboratory Equipment Supply | Labgard 437 ES | |
Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10856 | Crystalline grade or better |
Buffer AVE | Qiagen | 1026956 | Carrier RNA dilution buffer |
Buffer AVL | Qiagen | 19073 | Extraction buffer |
Carrier RNA | Qiagen | Not applicable | Use carrier RNA supplied with Buffer AVL |
Centrifuge bottles | Fisher Scientific | 05-562-23 or 05-562-26 | |
Centrifuge rotors | Beckman Coulter | 339080, 336380 | |
Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
Dithiothreitol (DTT) | Promega | P1171 | |
LightCycler® 480 Probes Master kit | Roche Diagnostics | 4707494001 | |
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps |
Microcide III | Fitzgerald | 99R-103 | |
Microseal 'A' film | Bio-Rad Laboratories | HSA5001 | Heat resistant |
Microseal 'F' film | Bio-Rad Laboratories | MSA1001 | Freezer resistant |
Mini-plate spinner | Labnet International | MPS1000 | |
Multichannel pipette | Rainin | L8-20 | |
Multi-tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-5000 | |
Optical reaction plate | Life Technologies | 4314320 | |
PCR nucleotide mix | Promega | U1515 | |
PCR plate | Bio-Rad Laboratories | HSS9601 | |
PCR-grade water | Roche | 3315932001 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | U.S. Biological | D9820 | |
Plate mixer | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
Prionex gelatin | Sigma Aldrich | G0411 | |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit |
Quantitative PCR thermal cycler | Life Technologies | 4351405 | |
Random primer | Promega | C1181 | |
Reagent Reservoir | Fisher Scientific | 21-381-27E | |
Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | 367501 | |
RNase Inhibitor | Promega | N2515 or N2615 | |
ROX reference dye | Life Technologies | 12223 | |
SuperScript II or III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-022 or 18080044 | |
Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
Thermal cycler | Life Technologies | 4314879 | |
Trisma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Vivaspin 20 centrifugal concentrator units | Sartorius-Stedim | VS2022 |