Abstract
Luminescente identification des éléments fonctionnels dans 3'UTRs (3'LIFE) permet l'identification rapide des objectifs de miARN spécifiques dans un réseau de centaines de 3'UTRs interrogés. identification de la cible est basée sur le dosage à double luciférase, qui détecte la liaison au niveau de l'ARNm par la mesure de sortie en translation, ce qui donne une lecture fonctionnelle de miARN cible. 3'LIFE utilise des tampons non-propriétaires et des réactifs, et des bibliothèques rapporteurs publiquement disponibles, ce qui rend les écrans de l'ensemble du génome faisable et rentable. 3'LIFE peut être effectuée soit dans un laboratoire standard ou mise à l'échelle à l'aide de robots de manipulation de liquides et d'autres instruments à haut débit. Nous illustrons l'approche utilisant un ensemble de données de 3'UTRs humains clonés dans des plaques à 96 puits, et deux miARN de test, laissez-7c et miR-10b. Nous démontrons comment effectuer la préparation de l'ADN, la transfection, la culture cellulaire et des dosages de la luciférase en format à 96 puits, et de fournir des outils pour les donnéesanalyse. En conclusion 3'LIFE est hautement reproductible, rapide et systématique, et identifie des cibles de confiance élevés.
Introduction
L'objectif global de cette méthode est de détecter et cartographier précisément microARN (miARN) cibles à haut débit. MiRNAs sont des ARN endogènes non codantes ~ 22 nucleotides de longueur. Après la transcription et de la transformation, miARN matures sont incorporés dans un complexe protéique appelé l'ARN Induced Silencing Complex (RISC). Chaque miARN guide le RISC pour cibler des éléments situés principalement dans les régions 3 'non traduite (de 3'UTRs) des ARN messagers (ARNm), aboutissant soit à la répression de la traduction ou clivage de l'ARNm 1. MiRNA reconnaître les sites cibles basées sur la norme Watson-Crick et G: U Wobble appariement de bases, et sont dans la nature dégénérée, contenant de multiples paires de bases dépareillés et régions bombé. De nombreux miARN sont largement conservées à partir de plantes pour les humains 2,3, où ils jouent un large éventail de rôles biologiques. Chez les métazoaires miARN peuvent influencer plusieurs processus biologiques, y compris les décisions du destin cellulaire 4, le calendrier de développement 5 6,7. MiRNA misexpression peut également entraîner dans la régulation génique aberrante, qui peut avoir une influence considérable sur le comportement cellulaire basé uniquement sur la fonction des gènes cibles. En tant que tel, les miRNAs sont liés à un large éventail de maladies, y compris la neurodégénérescence 8,9, le diabète et le cancer 10 11. Bioinformatique et des approches humide banc suggèrent que chaque miARN peut être capable de cibler des centaines de milliers d'ARNm distincts 12-14, ce qui indique que de larges approches à haut débit ou du génome sont nécessaires pour sonder cette grande piscine des interactions potentielles.
L'identification de gènes cibles est une composante essentielle de définir mécaniquement fonction miRNA, et pour ce faire les chercheurs doit être en mesure de révéler les cibles sur une grande échelle. Plusieurs approches ont été développées pour identifier des cibles miARN, y compris les algorithmes de prédiction bioinformatique, séquençage à haut débitdes ARNm ciblé et journaliste basé dosages. Chacune de ces approches a ses forces et faiblesses inhérentes. Étant donné que le miRNA ciblage est guidé par une spécificité de séquence, et plus particulièrement de 2 à 6 nucleotides du miARN (appelée la région de la graine), plusieurs algorithmes ont été développés pour prédire des cibles des miRNA dans le génome de plusieurs organismes. Ces algorithmes sont formés en utilisant les motifs observés d'appariement de bases de cibles miARN validées, et utilisent souvent des paramètres tels que l'appariement rigoureux des semences, de la conservation du site, et / ou stabilité thermodynamique 15. Bien que ces filtres affiner le grand nombre de cibles potentielles avec complémentarité suffisante pour objectifs de confiance seulement élevés, ils peuvent exclure les espèces sites cibles miARN spécifiques et non-canoniques, qui sont des preuves récentes suggèrent répandue 16-24. En outre, ces prévisions ne tiennent pas compte des mécanismes de traitement de l'ARNm qui excluent sites cibles miARN, comme polyadénylation alternatif25, édition de l'ARN 26 ARN méthylation 27 et liaison coopérative. En tant que tel, de hauts taux négatifs faux positifs et faux ont été signalés pour de nombreux algorithmes 22,24,28. Bien que ces algorithmes sont utiles pour identifier des cibles miARN candidats pour la validation expérimentale ultérieure, ces taux d'erreur élevés limitent l'efficacité des approches bioinformatiques pour la détection systématique cible miARN.
Pour sonder systématiquement les interactions entre un miRNA donnée et 3'UTRs potentiellement ciblés, nous avons développé un dosage à haut débit appelé luminescent identification des éléments fonctionnels dans 3'UTRs (3'LIFE) 24. Ce dosage des mesures de répression interactions directes et de translation de la 3'UTR de test par une requête miARN utilisant un système rapporteur double luciférase. Dans ce système, la 3 'UTR d'un gène d'intérêt est clone en aval de la luciférase (Fluc) reporter le cadre de lecture luciole. Les inconvénients rapporteurstruct est cotransfecté avec une requête miARN dans les cellules HEK293T. MiRNA ciblage est déterminée en mesurant la variation relative entre la fluc de test :: journaliste 3'UTR et un deuxième non-spécifique de Renilla journaliste. Surtout, les dosages luciférase détectent les interactions miARN / ARNm fonctionnels qui influencent la sortie de translation de la journaliste. Ceci est un avantage clé par rapport aux méthodes traditionnelles pour détecter la réglementation miARN, comme la RT-qPCR et transferts de Western, dans cette contourne différences dans la dégradation de l'ARNm et de la répression de la traduction, ainsi que des changements dans l'abondance des protéines indépendante de régulation fondée 3'UTR.
dosages de la luciférase sont largement utilisés pour valider des cibles miARN directs en raison de leur simplicité et de sensibilité relative, mais leur utilisation dans les écrans à haut débit est limité par les coûts élevés associés à réactifs consommables, le manque de bibliothèques 3'UTR provenant de sources publiques, et l'absence normalisée de luciférase protPROTOCOLES, conduisant à des difficultés en comparant la répression fonctionnelle sur plusieurs jeux de données. Pour faciliter l'utilisation de l'essai de 3'LIFE, nous avons mis l'accent sur la simplification de la conception expérimentale, utilisation de transfection 24 et luciférase réactifs non-commerciaux 29, la création d'une bibliothèque 3'UTR qui est régulièrement mis à jour et élargi, et est disponible à travers un plasmide publique référentiel 30.
L'évolutivité de l'essai de 3'LIFE permet le dépistage d'une grande bibliothèque 3'UTR pour le ciblage par un miARN donné sans solliciter l'écran vers gènes identifiés bioinformatique. En plus de tester les interactions canoniques et prédites, cette approche systématique permet l'identification de nouvelles cibles entraînés par des interactions non-canoniques et / ou espèces spécifiques. Fait important, l'effet de miARN cible sur la production de protéine est généralement comprise dans modeste au résultat de la répression traductionnelle 15,31 </ Sup>, ce qui suggère que le rôle primordial de la réglementation miARN est de peaufiner la production de protéines, protéger contre les niveaux aberrants de l'expression des gènes, et de fournir la robustesse à la cellule des programmes spécifiques 32,33. La sensibilité du dosage de la luciférase combiné avec le intrinsèquement grand nombre d'interactions négatives miARN / ARNm dans l'écran de 3'LIFE permet la détection des effets subtils de miARN cible sur un grand nombre de gènes, et l'identification de plusieurs composants de réseaux de gènes que sont réglementés par un miARN donné 24.
Ici, nous décrivons le protocole de 3'LIFE, et de démontrer qu'il est faisabilité par criblage deux miARN bien caractérisés, miR-10b et laissez-7c contre un panel de 275 3'UTRs humaines (Figure 1).
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Protocol
1. Culture cellulaire (24-48 h avant la transfection)
- 24 à 48 h avant la transfection à des semences de une quantité suffisante de cellules HEK293T en fonction du nombre de plaques à 96 puits est transfecté.
NOTE: Pour les transfections compatibles, les cellules de la plaque à une densité suffisante pour favoriser division rapide, mais ne pas être à plus de 70 à 90% de confluence au moment de la transfection. - Chaque plaque de 96 puits nécessite 9 x 10 6 cellules (75 000 cellules par puits et 120 puits par plaque pour tenir compte de l'utilisation du réservoir et une pipette multicanaux). Calculer le temps de doublement des cellules HEK293 (typiquement ~ 20 h), et les semences le nombre approprié de cellules pour obtenir au moins 9 x 10 6 cellules au moment de la transfection. Une plaque de culture circulaire de 145 mm est généralement suffisante pour 3 transfections 96 puits lorsqu'il est cultivé à ~ 90% de confluence, avec environ 10% des cellules restantes de réensemencer une nouvelle plaque.
2. Préparation avant la transfection
_content "> NOTE: La préparation des tampons et l'ADN plasmidique à l'étape 2,0-2,2 doit être effectué dans les jours avant la transfection depuis la préparation de ces réactifs peut prendre beaucoup de temps.- 3'UTR clones humains qui sont compatibles avec le test de 3'LIFE sont disponibles à travers un plasmide publique référentiel 30. Purifier l'ADN plasmidique manuellement ou avec des robots de manipulation de liquides. Utilisez un kit mini-prep 96 puits grade transfection lyse alcaline et suivez les instructions du fabricant. Reprendre les vecteurs purifiés à ~ 100 ng / l par puits.
REMARQUE: Le signal de la luciférase insuffisant entraînera si la concentration de plasmide tombe en dessous de 40 ng / ul. - Obtenir la pLIFE-miARN vecteurs 30 ou clone en utilisant le pipeline dans la figure 1B 24. Remettre en suspension les vecteurs à une concentration de 500 ng / pl pour chaque miARN et des plasmides de contrôle à blanc.
- En raison de la sensibilité des conditions de tampon de nucléofection, en sorte quele volume total des matières (y compris les cellules transfectées et les plasmides) ne dépasse pas 10% du liquide total dans chaque puits de la plaque de transfection à 96 puits. Pour atteindre cet objectif, concentrer le plasmide de stock pLIFE-miARN à une concentration de moins de 500 ng / ul.
- Préparation des réactifs de tampon 10x luciole luciférase (tableau 1), ainsi que les réactifs 1x luciférase de Renilla tampons (tableau 2), qui peuvent être stockées pendant 6 mois.
Remarque: le DTT dans le tampon de la luciférase de luciole à doit être stocké dans la solution à -20 ° C en aliquots à usage unique.
3. Préparez les éléments suivants immédiatement avant la transfection
- Préparer du tampon de transfection contenant du PBS, 1,5% de HEPES, pH 7,0. Préparer cette nouvelle, même si elle peut être conservée jusqu'à un mois à 4 ° C sans diminutions notables dans l'efficacité de transfection. Dans la formulation de volumes tampons et d'ADN plasmidique, assumer 120 réactions pour chaque plaque de 96 puits à sufficiently tenir compte des erreurs de pipetage et volume perdu en utilisant réservoirs de liquide et pipettes multicanaux. Aliquote de 18 ul par tampon de transfection bien (120 puits / 96 puits plaque = 2,16 ml par plaque), et mis de côté.
NOTE: Le dispositif cellulaire électroporation est extrêmement sensible aux conditions de tampons utilisés pour la transfection de cellules. Actualité lors de la préparation des tampons seront assurer une performance constante de l'équipement. Un soin particulier doit être pris lors de l'exécution du test pour éviter l'évaporation de tampons, spécifiquement en minimisant le temps que le tampon est laissé à découvert dans des microtubes, plaques à 96 puits, des réservoirs et des plaques d'électrodes. - Réserve quatre puits pour les contrôles suivants, aucune pLIFE-3'UTR (pour mesurer fond du dosage de la luciférase), pLIFE-SV40 3'UTR (contrôle cible négative), le contrôle positif pour miRNA # 1, le contrôle positif pour miRNA # 2.
NOTE: Ces vecteurs sont disponibles au public 30. Sinon, toute cible préalablement validépeut être utilisé comme témoin positif. - Médias chauds, la trypsine (0,25%) à 37 ° C.
- A chaque puits de la plaque à 96 puits de culture de cellules, ajouter 200 ul de milieu DMEM additionné de 10% de FBS, 1% de Pen / Strep, et placé dans un incubateur à 37 ° C pour une utilisation suivant la transfection.
- Tournez sur tous les appareils d'électroporation des cellules, suivie par le logiciel de soutien. Utilisez le code Pulse FF120 pour les cellules HEK293T et tampon PBS / HEPES.
4. Préparation du plasmide ADN et de cellules Mélange
REMARQUE: Le protocole suivant suppose que la transfection de trois plaques à 96 puits dans une expérience pour un écran avec deux miARN (miRNA- # 1 et # 2 miRNA-). Chaque plaque correspondra à la même plaque de 96 puits de plasmides pLIFE-3'UTR, et être traité trois fois avec pLIFE-miARN-vierge, pLIFE-miRNA- # 1, ou pLIFE-miRNA- # 2.
- Préparez 3 stocks de tampon de transfection pLIFE-miARN + pour chaque miARN. Ce stock devrait représenter 50% (10 pi) du volume total de chaqueainsi, multiplié par 120 puits. Ainsi, chaque action doit contenir 1,08 ml de tampon + 120 ul ADN plasmidique (pLIFE-miARN).
- Éliminer les cellules de 145 mm plaque de culture par élution médias, laver délicatement avec PBS, et en traitant avec ~ 5 ml 0,25% de trypsine pendant 5 min à 37 ° C. Neutraliser la trypsine avec un volume égal de milieu, et un culot de cellules à 300 g pendant 5 min.
- Retirer la trypsine / médias, et remettre le culot en ~ 5-10 ml de milieu (en fonction de la densité cellulaire et la gamme précise de compteur de cellules).
- Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules. Veiller à ce que les cellules sont> 95% viables et à portée exacte de la machine.
NOTE: Un nombre de cellules inexacts peut entraîner des concentrations cellulaires extrêmement élevées (> 6.0x 10 6 / ml). La transfection d'un trop grand nombre de cellules peuvent réduire considérablement l'efficacité de miARN cible en réduisant plasmide ratio cellulaire et / ou la diminution de l'efficacité de transfection. - Aliquotes trois tubes contenant chacun 9 x 10 6 cellules, correspondant à des cellules rbligatoire pour la transfection d'une plaque à 96 puits. Spin cellules à 300 g pendant 3 min.
- Retirez le support. Soyez sûr d'enlever autant de médias que possible avec une perturbation minimale de la pastille que l'excès des médias peuvent avoir un impact efficacité de la transfection.
- Resuspendre les cellules dans 1,2 ml transfection tampon / mélange de plasmides miRNA, et mettre de côté.
- Les étapes suivantes détail remise en suspension des pLIFE-3'UTR plasmide dans le tampon de transfection. Comme cela se produit dans des plaques de 96 puits, prendre soin d'éviter l'évaporation de tampon en couvrant plaques en tout temps.
- En utilisant une pipette multicanaux, déplacer 32,4 pi de tampon de transfection dans chaque puits d'une plaque à 96 puits PCR (9 pl [par transfection] * 3 [plaques] * 1.2 [pour tenir compte des erreurs de pipette]).
- Ajouter 3,6 ul (~ 100 ng / ul) de mini-prepped pLIFE-3'UTR plasmide à chaque puits et mélanger soigneusement.
- Pipette 10 ul de ce mélange dans chaque puits de la plaque de transfection de 96 puits et couvrir.
- Déplacez 1,2 ml de la première / tampon / mélange de plasmides pLIFE-miARN cellule dans le réservoir. Bien mélanger.
- Ajouter 10 pi de ce mélange dans la première plaque de transfection de 96 puits contenant déjà 10 pi transfection tampon / pLIFE-3'UTR. Bien mélanger en pipetant plusieurs fois.
NOTE: égalité suspension de cellules dans le tampon assurera même et le passage complet du courant électrique à travers la cuvette et maximiser l'efficacité de la transfection. - Placez plaque de 96 puits de transfection sur l'appareil d'électroporation de la cellule et d'initier la transfection.
- Une fois que la transfection est terminée, ajouter 100 pi de milieu préchauffées de plaque de 96 puits de culture à chaque puits de la plaque de transfection de 96 puits et bien mélanger. Déplacez 100 pi de chaque puits dans la plaque de culture à 96 puits.
- Mélanger les cellules dans une plaque de culture à la pipette positionné verticalement dans le centre du puits, les cellules ont tendance à se regrouper sur les côtés de la pell moins mélangée correctement.
- Répétez 5,1-5,5 pour les deux plaques restantes.
- Nettoyage plaque de 96 puits de transfection
- Les plaques de transfection de 96 puits peuvent être recyclés par lavage avec EtOH à 70% pour éviter la présence d'acides nucléiques entre expériences. Effectuer deux 70% EtOH lavages en utilisant un flacon pulvérisateur pour remplir complètement chaque puits, suivi par essuyer l'excès EtOH sur les bandes d'électrodes (partie inférieure) et en permettant aux plaques de transfection à complètement sec dans la hotte de culture.
NOTE: Nous avons testé de report contamination d'ADN par puits 12 transfection avec 2 ug de chaque plasmide pmaxGFP dans des cellules HEK293T, suivi par un seul lavage avec EtOH à 70%, et une seconde transfection sans ADN plasmidique. Avec cette concentration extrêmement élevée de plasmide, journaliste extrêmement lumineux, et un seul lavage, il n'y avait pas de fluorescence observable dans l'une des 12 transfections répétées.
- Les plaques de transfection de 96 puits peuvent être recyclés par lavage avec EtOH à 70% pour éviter la présence d'acides nucléiques entre expériences. Effectuer deux 70% EtOH lavages en utilisant un flacon pulvérisateur pour remplir complètement chaque puits, suivi par essuyer l'excès EtOH sur les bandes d'électrodes (partie inférieure) et en permettant aux plaques de transfection à complètement sec dans la hotte de culture.
- Culture de cellules de 48 à 72 heures à 37 ° C, suivie par la double Lucifeffacer dosage.
6. lysat cellulaire Préparation pour dosage de luciférase
- Diluer le tampon de lyse avec 4 parties d'eau, 1 partie de 5x tampon de lyse passif dans un réservoir. Calculez 26 pl / puits, ajoutant ~ 20 volumes supplémentaires pour tenir compte de la perte dans le réservoir.
NOTE: Le tampon est conservé à -20 ° C et peut être extrêmement visqueuse, donc avant de permettre le tampon 5x pour approcher la température ambiante sera d'améliorer la précision de pipetage. - Analyser chaque puits pour l'efficacité de transfection en utilisant la microscopie de fluorescence. Notez toutes les incohérences dans les puits qui ne transfecter efficacement (> 90% d'efficacité de transfection), ou expriment de faibles niveaux de DP indicative de la surpopulation ou les médias épuisement. Enlevez ces puits de l'analyse.
- Supprimer complètement les médias à partir des cellules, en faisant attention de ne pas éluer trop rapidement qui sera amener les cellules à se détacher.
REMARQUE: les médias restants seront diluera le lysat et causer des fluctuations de valeurs à travers experiments. - Ajouter 26 pi de tampon de lyse à chaque puits, et les placer sur une plaque agitateur / rocker à vitesse faible / modéré pour ~ 20-30 min. Utilisez ce temps pour préparer des tampons luciférase, laver et amorcer le luminomètre (s), et de transférer lysat à des plaques de mesure opaques.
7. Double Luciferase Assay
NOTE: Si plusieurs plaques sont mesurées séquentiellement sur un luminomètre, créer des master mix tampons de tout, sauf de l'ATP et des substrats, l'ajout de ces réactifs suivie par un ajustement du pH immédiatement avant utilisation avec chaque plaque. ATP et substrats peuvent se dégrader au fil du temps; la cohérence dans le temps ces réactifs dans la zone tampon permettra d'améliorer la cohérence entre plusieurs plaques.
- Préparer les tampons de luciférase 1x (tableau 1):
- Enroulez deux tubes (typiquement 15/50 ml tubes de centrifugeuses) contenant la luciole et de Renilla tampons de papier d'aluminium, comme substrats peuvent être sensibles à la lumière.
- Préparer tampon 1x de la luciférase Firefly. Ajouter 1 ml de chacune des cinq 10x réactifs de luciférase de luciole, l'ajout d'EGTA dernier, à 5 ml de H 2 0 à une concentration finale de 1 x.
- Ajouter 0,025 g ATP à 10 ml 1x tampon luciole. Mélanger en retournant plusieurs fois. Gardez ATP sur la glace en tout temps. ATP va se dégrader, si la mesure de plus d'une plaque séquentiellement, tampon doit être faite début frais à cette étape pour chaque plaque supplémentaire.
- Ajouter 100 pl de luciférine de coléoptère 100 (substrat) (tableau 1) tampon doit changer de couleur jaunâtre basé sur le pH.
- 1x Renilla luciférase tampon de reconstitution: Per plaque de 96 puits, aliquote de 10 ml de 1 "tampon Renilla".
- Ajouter 100 pi de BSA (44 mg / ml) actions.
- Si le dépistage plus d'une plaque, master mix séparé en aliquotes de 10 ml.
- Ajouter 100 pi de coelentérazine pour tamponner (précédemment aliquoté et stocké à 100x conc.)
<li> Ajuster le pH de luciole 1x tampon à 8,0, suivi par le tampon 1x Renilla à 5,0 en utilisant NaOH et HCl.
NOTE: L'activité de chaque tampon, et la capacité de la mémoire tampon de Renilla pour étancher l'activité de la luciférase de luciole est fortement dépendante du pH. Pour des résultats cohérents être extrêmement précis dans cette étape. - Amener le volume de chaque tampon (correspondant à la plaque 1 96 puits) à 10,5 ml pour accommoder luminomètre amorçage.
- Sélectionnez les puits pour être tintéressée (tous les puits est la valeur par défaut).
- Étendre le «Retard avant la mesure 'mise à 5 secondes, avec un temps de mesure de 10 secondes (voir 29 pour l'explication).
- Capillaires lavage étapes: 3x d'eau, EtOH 3x 3x, d'eau, 3x sec. Tampons Prime fois dans les déchets, puis amorcer une deuxième fois de retour dans les tubes de tampon pour assurer le mélange. Injecter le tampon luciole premier et le premier dans le capillaire à gauche, suivi par Renilla dans la bonne capillaire.
NOTE: Plusieurs plaques peuvent être lues et les données stockées sur le même fichier Excel, mais les problèmes peuvent être rencontrés avec plaque plusieurs lectures où le programme de luminomètre va se planter. Veillez à sauvegarder toutes les données entre les mesures et prendre des screenshots si le programme se bloque avant sauvegarde est possible.
- Remplacer les vieux tamponsavec le nouveau, en étant sûr de Premier au moins deux fois avec de nouveaux tampons avant de commencer la nouvelle plaque.
8. Analyse des données
- Utiliser tableaux Excel "de 3'LIFE - analyse de plaque unique" et "3'LIFE - analyse multidisques» disponible auprès www.mangonelab.com . Copiez les données brutes de luciole et de Renilla luciférase mesures de fichier de sortie de luminomètre dans des endroits correspondant à la condition négative, miRNA # 1, # 2 et miARN dans la "3'LIFE - analyse de plaque unique" feuille de calcul.
- La feuille de calcul calcule automatiquement luciole / rapport Renilla et normaliser chaque miARN au contrôle négatif approprié, et de normaliser les valeurs de répression à travers chaque plaque.
NOTE: Cette feuille de calcul permettra d'identifier automatiquement les puits à faible signal de la luciférase, mettez en surbrillance puits significativement réprimés, et de fournir des mesures de repressisur à travers la totalité de la plaque. Voir 24 pour une explication détaillée de l'analyse statistique.- Copier les valeurs de la boîte "indice normalisé de RI", dans les cellules correspondantes dans le "3'LIFE - analyse multidisques" feuille de calcul à la position correspondant à répliquer # 1 pour chaque miARN testé. Répétez l'opération pour toutes les répétitions biologiques effectués sur des jours différents.
- Si vous le souhaitez, insérer les noms de gènes et de l'état de prédiction de cible dans les colonnes B et D, respectivement.
- Laissez la feuille de calcul pour calculer automatiquement la moyenne de toutes les tôles. Respecter les données en format 96 ainsi qu'une carte de chaleur (Figure 2). Le fichier organise également les données sous forme de liste (figure 2).
NOTE: L'indice de la répression est la mesure utilisée pour identifier des cibles miARN putatifs. Différents paramètres de stringence peuvent être utilisées, en fonction des préférences individuelles. En moyenne, nous considérons résultats probables dessous indice de répression de 0.8 et statistiquement significative par le test t (valeur p <0,05). Comme le montre la Figure 3 cibles potentielles basées sur ces critères seront surlignées en rouge.
- Laissez la feuille de calcul pour calculer automatiquement la moyenne de toutes les tôles. Respecter les données en format 96 ainsi qu'une carte de chaleur (Figure 2). Le fichier organise également les données sous forme de liste (figure 2).
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Representative Results
Le fichier de sortie de luminomètre contient des mesures brutes pour les deux protéines de luciole et la luciférase de Renilla. Ce format brut est compatible avec le "3'LIFE - analyse de plaque unique" et "3'LIFE - analyse multidisques" des feuilles de calcul disponible sur le site du laboratoire Mangone ( www.mangonelab.com ). La seule feuille de calcul d'analyse de plaque calcule automatiquement luciole / rapport Renilla, normalise chaque miARN au contrôle négatif approprié, et normalise les valeurs de répression à travers chaque plaque. Cette feuille de calcul identifie automatiquement les puits à faible signal de la luciférase Renilla, souligne puits qui présentent la répression par rapport au contrôle négatif, et prévoit des mesures de répression à travers toute la plaque (Figure 2). Voir 24 pour une explication détaillée de l'analyse statistique.
Répétitions multiples peuvent être analyserd en utilisant l '"analyse multidisques" feuille de calcul. Chaque réplique est comparé côte à côte, et des mesures statistiques des données sont automatiquement calculés (Figure 3). En plus de comparer les répétitions avec les colonnes «Répression normalisé", l'utilisateur peut comparer la répression entre les deux miARN dans le cadre du "miARN # 1 / # 2" miRNA colonnes. Cette mesure divise l'indice de la répression pour chaque miARN pour chaque répétition. Cette mesure peut indiquer des valeurs erronées du dosage de la luciférase (par exemple anormalement lectures hautes ou basses avec le contrôle négatif, voir la figure 3, ramer A9, Rep n ° 3), et les puits où l'indice de la répression ne peut pas indiquer la répression substantielle, mais que faire présenter des différences significatives entre les miARN. Bien que cette mesure ne peut pas être utilisé directement pour indiquer une cible miRNA, il est utile pour identifier les valeurs aberrantes, puits problématiques, ou des motifs dans les données qui ne sont pas uniquement attribuable à diriger miARN regulation.
La répression Index (RI) est utilisé pour appeler une cible miARN putative, avec des valeurs inférieures correspondant à la répression relative plus élevée. Le seuil pour appeler cibles potentielles est basée sur le niveau de rigueur exigé par le chercheur, mais la combinaison de la RI avec 3'UTRs qui affichent les valeurs de p statistiquement significative (p <0,05) indiquera cibles de haute confiance (voir la figure 2 rangées B8 et B12).
Figure 1: 3'LIFE Assay (A). Passerelle vecteurs compatibles utilisées dans l'essai de 3'LIFE. En haut: Le gène de la luciférase (Fluc) est fusionné à la région 3'UTR d'essai, tandis que le gène de la luciférase de Renilla (Rluc) est fusionnée à l'UTR en 3 'non spécifique SV40 pA comme témoin. En bas: Le miARN-intron vecteur RFP- - La sonde pré-miARN, plus de 400 ~nucléotides au sein de son locus génomique (de récapituler traitement des miARN endogène), est cloné dans un intron pour permettre son co-expression avec DsRed2 fluorochrome. Les deux vecteurs sont disponibles publiquement (Seiler et al., 2013). (B) Organigramme de l'3'LIFE Assay. (C) 3'LIFE Pipeline: Le vecteur à double luciférase contenant le 3'UTR de test avec ou sans les vecteurs miARN sont co-transfectés dans des cellules HEK293 dans des plaques à 96 puits. L'interaction entre le miARN et une cible 3'UTR de bonne foi fera baisser la luminescence par rapport au puits spécifiques (illustré par la tache orange dans la plaque expérimentale).
Figure 2: Exemple de données produites avec dosage de 3'LIFE. Chaque sonde miARN est testé en quatre exemplaires (reproduit 1-4). Couleurs représentent des niveaux de répression, avec du rougecouleurs indiquant forte miRNA / interaction 3'UTR. Toutes les répétitions sont en moyenne pour produire cibles potentielles de haute qualité représentés dans la plaque de résumé ci-dessous la flèche jaune. Boîte blanche représentent contrôles, n'a transfections ou des puits de faible efficacité de transfection.
Figure 3:. Tableau représentant les données de synthèse d'un sous-ensemble d'interactions produites en utilisant la feuille de calcul 3'LIFE Les valeurs de répression sont comme sur la figure 2. Le logiciel calcule l'écart type, erreur standard et score z pour chaque interaction. Statistiquement interactions significatives sont marqués en rouge. Les quatre dernières lignes montrent une répression de miARN par rapport à l'autre, et est utilisé comme indicateur pour le comparer répression secondaire entre deux miARN différents. La feuille de calcul peut être téléchargé à partir www.mangonelab.com
| Firefly réactifs tampons de la luciférase | La concentration finale (1x) |
| Glycylglycine | 25 mM |
| K x PO 4 (pH 7,8) | 15 mM |
| MgSO 4 | 15 mM |
| TNT (magasin au 4º) | 1 mM |
| EGTA | 4 mM |
| ATP * | 2 mM |
| Beetle luciférine * | 250 pM |
Tableau 1: Stock réactifs luciférase de luciole: 10x solutions mères de Glycylglycine, K x PO 4, MgSO 4, TNT et EGTA peuvent être préparés séparément et stockés en mémoire tampon avant la reconstitution. 100x Beetle Luciferin (substrat de la luciférase de luciole) peut être magasind en dissolvant 50 mg de luciférine dans 7,134 ml H 2 0 (25 mM). Aliquote 105 pi / plaque de luciférine Beetle dissous dans des tubes et conserver à -80 ºC. Par un soutien technique Promega, cela devrait être stable pour> 6 mois, mais peut être sensible à la lumière. NOTE: EGTA ne va pas dans la solution à pH neutre. Ajouter lentement du NaOH à EGTA jusqu'à ce qu'il se dissolve complètement. * Les réactifs ajoutés au tampon finale immédiatement avant le dosage de la luciférase
| Renilla tampons réactifs de luciférase | La concentration finale (1x) |
| NaCl | 1,1 M |
| Na 2 EDTA | 2,2 mM |
| KH 2 PO 4 | 0,22 M |
| NaN3 | 1,3 mM |
| BSA * | 0,44 mg / ml |
| Coelentérazine * | 2,5 & #956; M |
Tableau 2: Quantité de réactifs tampons Renilla luciférase Tous les réactifs à l'exception de BSA et coelentérazine peuvent être mélangés à une concentration de 1 x et stockés à température ambiante. Cœlentérazine peut être dissous dans du methanol acidifié et aliquoté par plaque. Acidifier le methanol par addition de HCl à une concentration finale de 5 mM (<3 pH). Dissoudre 250 ug coelentérazine dans 2,36 ml de méthanol acidifié (250 M) aliquotes 105 ul / plaque. Le mélange est stable pendant au moins 6 mois, mais peut être sensible à la lumière. * Les réactifs ajouté à tampon immédiatement avant dosage de la luciférase.
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Discussion
Le dosage de 3'LIFE identifie des cibles miARN fonctionnels dans 3'UTRs à haut débit. Ce test est utile pour les chercheurs qui souhaitent identifier expérimentalement un grand nombre de cibles potentielles pour leur miARN d'intérêt. Le dosage de 3'LIFE est une approche puissante pour interroger 3'UTR réglementation entraîné, en ce que le test fournit une mesure fonctionnelle de miARN ciblage, et le test binaire d'un seul journaliste :: 3'UTR contre un seul miARN peuvent aborder en toute confiance l'état de ciblage de gènes individuels. Pour valider cette approche, nous avons projeté un panel de 275 3'UTRs et contre deux miARN, laissez-7c et miR-10b, et comprenait 10 gènes cibles déjà validées dans cette bibliothèque. Huit de ces dix gènes présentaient répression 24. Nous avons également observé un enrichissement significatif de cibles bioinformatique prédites non validés, et 3'UTRs imprévus qui contiennent des éléments de semences canoniques parmi nos grands succès, suggesting que 3'LIFE est capable d'identifier de bonne foi cibles miARN.
Un indicateur clé de la sensibilité des écrans à haut débit est les taux négatifs faux positifs et faux. Alors que le taux de faux positifs de cet essai doit être évaluée en utilisant des approches alternatives supplémentaires pour valider hits, huit des dix contrôles positifs inclus dans notre écran répression preuve-de-principe exposé, suggérant un taux de faux négatifs de 20%. Cependant, de nombreuses techniques sont utilisées pour identifier les cibles miARN dans différents contextes cellulaires, et le traitement 3'UTR et régulation par des facteurs agissant en trans est connu pour être très tissu spécifique. Par exemple, la majorité des 3'UTRs contient plusieurs sites de polyadénylation, qui contrôlent la longueur de la 3'UTR de l'ARNm mature. Dans de nombreux cas, l'utilisation de sites de polyadénylation proximales est un tissu spécifique, et peut exclure les sites cibles miARN. En outre, une coopérative miARN ciblage, la concurrence wie protéines liant l'ARN, et structure secondaire d'ARNm peuvent tous un impact sur la capacité des 3'LIFE pour détecter des cibles miARN dans des tissus spécifiques. Pour cette raison, la détection de cibles par l'analyse de 3'LIFE peut varier en fonction du contexte cellulaire dans lequel le dosage est effectué, ce qui complique l'évaluation des taux d'erreurs absolues. Ce protocole est optimisé pour des cellules HEK293T, mais d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées si le chercheur souhaite effectuer l'essai dans un contexte biologique spécifique. Cependant, l'optimisation de l'efficacité de transfection et la survie des cellules avec chaque lignée cellulaire devra être optimisé en utilisant des conditions multiples tampons, des codes d'impulsions, et le nombre de cellules. Un exemple d'un schéma d'optimisation peut être trouvé à Wolter et al., 24.
Ce protocole a été optimisé au format 96 puits et spécifie l'utilisation de certains instruments à haut débit. Dans le cas où l'institution ne possède pas le matériel nécessaire pour 96Nucléofection eh bien, d'autres réactifs de transfection peut être utilisée pour effectuer l'essai de 3'LIFE, aussi longtemps que l'efficacité de transfection reste élevé. En outre, le dosage de la luciférase est l'aspect le plus de temps de l'essai de 3'LIFE. En tant que tel, l'utilisation de plusieurs luminomètres est recommandé pour les écrans à haut débit.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferin | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
| Trypsin | T2600000 | ||
| Consumables | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instruments | |||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
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