Abstract
Luminescente Identificazione di elementi funzionali a 3'UTRs (3'LIFE) permette la rapida identificazione di bersagli di miRNA specifici all'interno di un array di centinaia di 3'UTRs interrogati. Identificazione di destinazione è basato sul dosaggio dual-luciferasi, che rileva vincolante a livello di mRNA misurando uscita traslazionale, dando una lettura funzionale miRNA targeting. 3'LIFE utilizza i buffer non proprietari e reagenti, e biblioteche giornalista pubblicamente disponibili, rendendo gli schermi genome-wide fattibile e conveniente. 3'LIFE può essere eseguita in un ambiente di laboratorio standard o scalato utilizzando robot gestione dei liquidi e altra strumentazione high-throughput. Illustriamo l'approccio con un set di dati di 3'UTRs umani clonati in piastre a 96 pozzetti e due miRNA test, lasciamo-7c e miR-10b. Dimostriamo come eseguire preparazione del DNA, trasfezione, coltura cellulare e saggi di luciferasi in formato 96-bene, e di fornire gli strumenti per i datianalisi. In conclusione 3'LIFE è altamente riproducibile, veloce, sistematico, e individua gli obiettivi alti di fiducia.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di individuare e mappare con precisione microRNA target (miRNA) in high-throughput. MiRNA sono endogeni RNA non codificanti ~ 22 nucleotidi di lunghezza. In seguito la trascrizione e la lavorazione, miRNA maturi sono incorporati in un complesso proteico chiamato RNA induced silencing complex (RISC). Ogni miRNA guida il RISC ad elementi situati principalmente nelle regioni 3'untranslated (3'UTRs) di RNA messaggeri (mRNA) di destinazione, con conseguente sia repressione traduzione o mRNA cleavage 1. Mirna riconoscere siti di destinazione basate su standard di Watson-Crick e G: U Wobble appaiamento delle basi, e sono degenerati in natura, contenente più paia di basi non corrispondenti e le regioni si gonfiarono. Molti miRNA sono ampiamente conservati dalle piante all'uomo 2,3, dove giocano una vasta gamma di ruoli biologici. In metazoi miRNA possono influenzare molteplici processi biologici, tra cui le decisioni destino cellulare 4, i tempi di sviluppo 5 6,7. Mirna misexpression può anche provocare regolazione genica aberranti, che può avere notevole influenza sul comportamento cellulare basato esclusivamente sulla funzione dei geni bersaglio. Come tale, miRNA sono collegati ad una vasta gamma di malattie, compreso neurodegenerazione 8,9, diabete e cancro 10 11. Bioinformatica e gli approcci bagnato banco suggeriscono che ogni miRNA può essere in grado di colpire centinaia di migliaia di mRNA distinte 12-14, indicando che gli approcci a livello di high-throughput o del genoma sono tenuti a sondare questa grande piscina di potenziali interazioni.
Identificare geni bersaglio è una componente critica di meccanicamente definire funzione miRNA, e per farlo i ricercatori deve essere in grado di rivelare gli obiettivi su larga scala. Diversi approcci sono stati sviluppati per identificare bersagli miRNA, tra cui algoritmi di predizione bioinformatica, high-throughput sequencingmRNA di mirati e giornalista saggi basa. Ognuno di questi approcci ha punti di forza e di debolezza intrinseci. Dato che il targeting miRNA è guidata dalla specificità di sequenza, in particolare di 2-6 nucleotidi del miRNA (definita regione di seme), diversi algoritmi sono stati sviluppati per prevedere bersagli miRNA nel genoma di molti organismi. Questi algoritmi sono addestrati con i motivi osservati base-accoppiamento di obiettivi miRNA validati, e spesso utilizzano parametri quali l'associazione rigorosa seme, la conservazione del sito, e / o la stabilità termodinamica 15. Mentre questi filtri perfezionare il gran numero di bersagli putativi con complementarità sufficiente per obiettivi solo un'elevata fiducia, essi possono escludere determinate specie e non canonici siti bersaglio miRNA, che recenti evidenze suggerisce sono diffusi 16-24. Inoltre, queste previsioni non tengono conto dei meccanismi di trasformazione mRNA che escludono siti bersaglio miRNA, come poliadenilazione alternativa25, RNA editing 26, RNA metilazione 27, e cooperativo vincolante. In quanto tale, gli alti tassi di falsi positivi e falsi negativi sono stati riportati per molti algoritmi 22,24,28. Mentre questi algoritmi sono utili per identificare candidati bersagli miRNA per la successiva validazione sperimentale, questi tassi di errore elevati limitano l'efficacia di approcci bioinformatici per la rilevazione sistematica bersaglio miRNA.
Per sondare sistematicamente per le interazioni tra un dato miRNA e 3'UTRs potenzialmente mirate abbiamo sviluppato un saggio ad alta prestazione denominato luminescente Identificazione di elementi funzionali in 3'UTRs (3'LIFE) 24. Questo saggio misura interazioni dirette e repressione di traslazione del 3'UTR di prova da una query miRNA utilizzando un sistema duale giornalista luciferasi. In questo sistema, il 3'UTR di un gene di interesse viene clonato a valle della luciferasi (fluc) giornalista telaio lettura lucciola. I contro giornalistatruct è cotransfected con una query miRNA nelle cellule HEK293T. Mirna Il targeting è determinata misurando la variazione relativa tra il fluc prova :: giornalista 3'UTR e un secondo non specifico giornalista Renilla luciferasi. È importante sottolineare che, saggi luciferasi rilevano funzionali interazioni miRNA / mRNA che influenzano l'uscita di traslazione del giornalista. Questo è un vantaggio fondamentale rispetto ai metodi tradizionali per individuare regolamentazione miRNA, come la RT-qPCR e macchie occidentali, che questo ignora le differenze di degradazione mRNA e di repressione traslazionale, così come i cambiamenti nelle proteine abbondanza indipendente di regolamentazione basata 3'UTR.
Saggi luciferasi sono ampiamente utilizzati per convalidare bersagli diretti miRNA a causa della loro relativa semplicità e sensibilità, ma il loro uso in schermi high-throughput è limitato dai costi elevati associati con reagenti consumabili, la mancanza di librerie 3'UTR da fonti pubbliche, e l'assenza di standard luciferasi protocols, con conseguenti difficoltà nel confrontare repressione funzionale tra più insiemi di dati. Per facilitare l'uso del test 3'LIFE, abbiamo posto l'accento sulla semplificazione del disegno sperimentale, l'utilizzo di trasfezione 24 e luciferasi reagenti non commerciali 29, la creazione di una biblioteca 3'UTR che viene regolarmente aggiornato e ampliato, ed è disponibile attraverso un repository plasmide pubblico 30.
La scalabilità del saggio 3'LIFE permette proiezione di una grande biblioteca 3'UTR per il targeting per un dato miRNA, senza falsare la schermata verso geni bioinformatically identificati. Oltre a testare le interazioni canoniche e previste, questo approccio sistematico permette l'identificazione di nuovi bersagli azionati tramite interazioni non canonici e / o specie-specifici. È importante sottolineare che l'effetto di miRNA targeting produzione di proteine è generalmente inteso a provocare modesto repressione traslazionale 15,31 </ Sup>, suggerendo che un ruolo primario della regolamentazione miRNA è quello di mettere a punto l'uscita di proteine, la protezione contro i livelli aberranti di espressione genica, e dare maggiore solidità alla cella programmi specifici 32,33. La sensibilità del saggio luciferasi combinato con il intrinsecamente gran numero di interazioni negative miRNA / mRNA nella schermata 3'LIFE permette la rilevazione di effetti sottili di miRNA mira su un gran numero di geni, e l'identificazione di componenti multipli di reti geniche che sono regolati da un dato miRNA 24.
Qui si descrive il protocollo 3'LIFE, e dimostrare che è fattibilità per lo screening due miRNA ben caratterizzati, miR-10b e let-7c contro un gruppo di 275 3'UTRs umani (Figura 1).
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Protocol
1. coltura cellulare (24-48 ore prima della trasfezione)
- 24-48 hr prima di seme trasfezione quantità sufficiente di cellule HEK293T base al numero di piastre a 96 pozzetti essere trasfettate.
NOTA: Per trasfezioni coerenti, cellule piastra ad una densità sufficiente per favorire una rapida divisione, ma non essere a più del 70-90% di confluenza al momento della transfezione. - Ogni piastra a 96 pozzetti richiede 9 x 10 6 cellule (75.000 cellule per bene, e 120 pozzi per piastra per tenere conto per l'utilizzo di serbatoio e pipetta multicanale). Calcolare il tempo di raddoppio delle cellule HEK293 (tipicamente ~ 20 hr), e sementi il numero appropriato di cellule per ottenere almeno 9 x 10 6 cellule al momento della trasfezione. Una piastra di coltura circolare 145 millimetri è in genere sufficiente per 3 trasfezioni 96 pozzetti, se coltivate al ~ 90% di confluenza, con ~ 10% delle cellule rimanenti per reseed una nuova piastra.
2. Preparazione Prima di Trasfezione
_content "> NOTA: La preparazione dei buffer e DNA plasmidico a passo 2.0-2.2 deve essere eseguita nei giorni prima trasfezione poiché la preparazione di questi reagenti può richiedere molto tempo.- Cloni 3'UTR umani che sono compatibili con il test 3'LIFE sono disponibili attraverso un archivio plasmide pubblico 30. Purificare DNA plasmidico manualmente o con robot gestione dei liquidi. Utilizzare un kit di mini-prep 96 pozzetti lisi alcalina grado trasfezione e seguire le istruzioni del produttore. Risospendere i vettori purificati a ~ 100 ng / ml per pozzetto.
NOTA: Il segnale luciferasi insufficiente risulterà se la concentrazione plasmide scende al di sotto di 40 ng / ml. - Ottenere il pLIFE-miRNA vettori 30 o clone utilizzando la pipeline in Figura 1B 24. Risospendere i vettori ad una concentrazione di 500 ng / ml per ciascun miRNA e plasmidi controllo in bianco.
- A causa della sensibilità delle condizioni tampone nucleofection, affinchéil volume totale di materiali (comprese le cellule transfettate e plasmidi) non supera il 10% del liquido totale in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti trasfezione. Per raggiungere questo obiettivo, concentrare il plasmide magazzino pLIFE-miRNA ad una concentrazione di almeno 500 ng / ml.
- Preparare 10x lucciola luciferasi reagenti tampone (Tabella 1), e le 1x Renilla luciferasi reagenti tampone (Tabella 2), che possono essere conservati per un massimo di 6 mesi.
NOTA: Il DTT nel buffer luciferasi di lucciola deve essere conservato in soluzione a -20 ° C in aliquote uso singoli.
3. Preparare punti seguenti Immediatamente prima Trasfezione
- Preparare tampone trasfezione contenente PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Preparare questo fresco, anche se può essere conservata fino a 1 mese a 4 ° C senza diminuzioni notevoli in termini di efficienza di trasfezione. Nel formulare i volumi tampone e plasmide DNA, assumere 120 reazioni per ogni piastra a 96 pozzetti a sufficiently tenere conto di errori di pipettaggio e volume perso con serbatoi di liquidi e pipette multicanale. Aliquota 18 microlitri per buffer trasfezione bene (120 pozzi / 96 pozzetti = 2,16 ml per piastra), e mettere da parte.
NOTA: Il dispositivo cellulare elettroporazione è estremamente sensibile alle condizioni di buffer utilizzati per trasfettare cellule. Precisione quando i buffer preparazione garantiranno prestazioni costanti dell'apparecchiatura. La cura supplementare deve essere presa quando si esegue il test per evitare l'evaporazione di buffer, in particolare riducendo al minimo il tempo che buffer viene lasciato scoperto in tubi microcentrifuga, piastre a 96 pozzetti, serbatoi, e piastre di elettrodi. - Riserva quattro pozzi per i seguenti controlli, no pLIFE-3'UTR (per misurare sfondo di test luciferasi), pLIFE-SV40 3'UTR (controllo di destinazione negativo), controllo positivo per miRNA # 1, controllo positivo per miRNA # 2.
ATTENZIONE: Questi vettori sono pubblicamente disponibili 30. In alternativa, qualsiasi obiettivo precedentemente convalidatopuò essere utilizzato come controllo positivo. - Media caldi, tripsina (0,25%) a 37 ° C.
- Per ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti di coltura cellulare, aggiungere 200 ml di DMEM supplementato con 10% FBS, 1% Pen / Strep, e posto in un incubatore a 37 ° per uso seguente trasfezione.
- Accendere tutti i dispositivi di elettroporazione cellule seguiti dal software di supporto. Usa il codice di impulsi FF120 per HEK293T cellule e PBS / HEPES.
4. Preparazione di DNA plasmidico e miscela di cellule
NOTA: Il seguente protocollo assume trasfettando tre piastre da 96 pozzetti in un esperimento per uno schermo con due miRNA (miRNA- # 1 e # 2 miRNA-). Ogni piatto sarà conforme a la stessa piastra a 96 pozzetti di plasmidi pLIFE-3'UTR, ed essere trattati per tre volte con pLIFE-miRNA-vuoto, pLIFE-miRNA- # 1, o pLIFE-miRNA- # 2.
- Preparare 3 scorte di tampone trasfezione pLIFE-miRNA + per ogni miRNA. Questa azione dovrebbe rappresentare il 50% (10 ml) del volume totale di ognibene, moltiplicato per 120 pozzi. Così, ogni azione deve contenere 1,08 ml tampone + 120 microlitri DNA plasmide (pLIFE-miRNA).
- Rimuovere le cellule da 145 mm Piastra cultura eluendo media, lavare delicatamente con PBS, e trattando con 5 ml ~ 0,25% tripsina per 5 min a 37 ° C. Neutralizzare tripsina con un volume uguale di supporto, e le cellule pellet a 300 xg per 5 min.
- Rimuovere tripsina / media, e risospendere pellet in ~ 5-10 ml supporti (a seconda della densità cellulare e la gamma precisa di contatore di cellule).
- Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule. Assicurarsi che le cellule sono> 95% praticabile e nel raggio d'azione preciso di macchine.
NOTA: Un numero di celle imprecisa può derivare da concentrazioni cellulari estremamente elevate (> 6.0x 10 6 / ml). Trasfettando troppe cellule in grado di ridurre drasticamente l'efficienza di miRNA mira riducendo plasmide: rapporto cellulare e / o diminuendo l'efficienza di trasfezione. - Aliquote tre provette contenenti ciascuna 9 x 10 6 cellule, corrispondenti alle celle r, facoltativo per la trasfezione di una piastra a 96 pozzetti. Spin cellule a 300 xg per 3 min.
- Rimuovere il supporto. Assicurarsi di rimuovere il più media come possibile con il minimo disturbo della pellet come supporti in eccesso possono avere un impatto efficienza di trasfezione.
- Risospendere le cellule in 1,2 ml di tampone trasfezione / miscela plasmide miRNA, e mettere da parte.
- Le seguenti fasi riportano risospensione di pLIFE-3'UTR plasmide in tampone trasfezione. Come ciò si verifica in piastre da 96 pozzetti, fare attenzione per evitare l'evaporazione di tampone coprendo piastre in ogni momento.
- Utilizzando una pipetta multicanale, spostare 32,4 microlitri di buffer trasfezione in ciascun pozzetto di una piastra 96 pozzetti PCR (9 pl [per trasfezione] * [3 piastre] * 1.2 [per tenere conto di errori pipetta]).
- Aggiungere 3,6 microlitri (~ 100 ng / ml) di mini-prepped pLIFE-3'UTR plasmide ad ogni pozzetto e mescolare accuratamente.
- Pipettare 10 ml di questa miscela in ogni pozzetto della piastra trasfezione 96 pozzetti e la copertura.
- Spostare 1,2 ml della cellula prima / tampone / miscela plasmide pLIFE-miRNA nel serbatoio. Mescolare bene.
- Aggiungere 10 ml di questa miscela nel primo piatto trasfezione 96 pozzetti già contenente 10 microlitri di buffer trasfezione / pLIFE-3'UTR. Mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte.
NOTA: Equal sospensione di cellule nel buffer garantirà ancora e il passaggio completo della corrente elettrica attraverso la cuvetta e massimizzare l'efficienza di trasfezione. - Mettere 96 pozzetti trasfezione sul dispositivo elettroporazione delle cellule e iniziare trasfezione.
- Una volta transfezione è completa, aggiungere 100 ml di media pre-riscaldato da 96 pozzetti piastra di coltura in ciascun pozzetto della piastra trasfezione 96 pozzetti e mescolare bene. Spostare 100 microlitri da ogni pozzetto nella piastra di coltura a 96 pozzetti.
- Mescolare cellule in piastra di coltura con pipetta posizionato verticalmente al centro del pozzo, come cellule tenderanno ad aggregarsi sui lati del well meno mescolati correttamente.
- Ripetere 5,1-5,5 per i restanti due piastre.
- Pulizia piatto trasfezione 96 pozzetti
- Le piastre di transfezione 96 pozzetti possono essere riciclati da lavaggio con EtOH 70% per garantire l'assenza riporto degli acidi nucleici tra esperimenti. Eseguire due 70% EtOH lavaggi utilizzando uno spray di riempire completamente ciascun pozzetto, quindi asciugare giù eccesso EtOH sulle strisce elettrodi (lato inferiore) e consentendo le piastre di transfezione a completamente asciutto nel cofano cultura.
NOTA: Abbiamo testato per riporto contaminazione del DNA trasfettando 12 pozzi con 2 mg pmaxGFP plasmide ciascuno in cellule HEK293T, seguito da un singolo lavaggio con il 70% EtOH, e una seconda trasfezione senza DNA plasmidico. Con questa concentrazione estremamente elevata plasmide, giornalista estremamente luminoso, ed un lavaggio singolo, non vi era alcuna fluorescenza osservabile in uno qualsiasi dei 12 trasfezioni replicati.
- Le piastre di transfezione 96 pozzetti possono essere riciclati da lavaggio con EtOH 70% per garantire l'assenza riporto degli acidi nucleici tra esperimenti. Eseguire due 70% EtOH lavaggi utilizzando uno spray di riempire completamente ciascun pozzetto, quindi asciugare giù eccesso EtOH sulle strisce elettrodi (lato inferiore) e consentendo le piastre di transfezione a completamente asciutto nel cofano cultura.
- Cellule di coltura per 48-72 ore a 37 ° C, seguita dalla duplice lucifcancellare test.
6. Preparazione del lisato per Luciferasi Assay
- Diluire tampone di lisi con 4 parti di acqua, 1 parte 5x tampone di lisi passive in un serbatoio. Calcolare 26 microlitri / bene, aggiungendo ~ 20 volumi in più per tenere conto di perdite nel serbatoio.
NOTA: Il buffer è conservato a -20 ° C e può essere estremamente viscoso, quindi prima di consentire il buffer 5x per avvicinarsi temperatura ambiente migliorerà l'accuratezza di pipettaggio. - Analizzare ogni bene per l'efficienza di trasfezione usando la microscopia a fluorescenza. Prendere nota di eventuali incoerenze nei pozzi che non transfect efficiente (> 90% di efficienza di trasfezione), o stanno esprimendo bassi livelli di richiesta di offerta indicativa di sovraffollamento o supporto esaurimento. Rimuovere questi pozzi dall'analisi.
- Rimuovere completamente il supporto da parte delle cellule, facendo attenzione a non eluire troppo in fretta che indurre le cellule a staccare.
NOTA: i media rimanenti saranno diluire le fluttuazioni lisato e causare dei valori attraverso experimenti. - Aggiungere 26 ml di tampone di lisi per ogni bene, e posto su un piatto agitatore / rocker a bassa velocità / moderato per ~ 20-30 minuti. Utilizzare questo tempo per preparare il buffer luciferasi, lavare e adescare la luminometro (s), e trasferire lisato di piastre di misura opache.
7. Doppio Luciferase Assay
NOTA: Se più piastre vengono misurati in sequenza su un luminometro, creare buffer di Master Mix con tutto tranne ATP e substrati, aggiungendo questi reagenti seguita da regolazione del pH al momento dell'uso con ogni piatto. ATP e substrati possono degradare nel tempo; coerenza nel tempo questi reagenti sono nel buffer migliorerà coerenza tra più piastre.
- Preparare buffer luciferasi 1x (Tabella 1):
- Avvolgere due tubi (tipicamente 15/50 ml provette centrifuga) contenente la lucciola e buffer Renilla con un foglio di alluminio, come substrati possono essere sensibile alla luce.
- Preparare 1x tampone luciferasi Firefly. Aggiungere 1 ml di ciascuno dei cinque 10x reagenti lucciola luciferasi, aggiungendo EGTA scorso, a 5 ml H 2 0 ad una concentrazione finale 1x.
- Aggiungere 0,025 g ATP a 10 ml 1x tampone lucciola. Mescolare capovolgendo più volte. Tenere ATP su ghiaccio in ogni momento. ATP si degradano, quindi se la misura più di una sequenza piatto, buffer deve essere fatto all'inizio fresca in questa fase per ogni targhetta supplementare.
- Aggiungere 100 ml di 100 scarabeo luciferina (substrato) (Tabella 1) Buffer deve modificare per colore giallastro in base a pH.
- 1x Renilla tampone luciferasi ricostituzione: Per piastra a 96 pozzetti, un'aliquota di 10 ml di 1 "tampone Renilla".
- Aggiungere 100 ml di BSA (44 mg / ml di brodo).
- Se lo screening più di una piastra, master mix separata in 10 ml aliquote.
- Aggiungere 100 ml di coelenterazine di buffer (in precedenza aliquotare e conservare a 100x conc.)
<li> Regolare il pH del tampone 1x lucciola a 8,0, seguita dalla 1x tampone Renilla a 5,0 usando NaOH e HCl.
NOTA: L'attività di ogni buffer, e la capacità del buffer Renilla per estinguere l'attività della luciferasi della lucciola è fortemente dipendente dal pH. Per risultati coerenti essere estremamente accurate in questa fase. - Portare il volume di ciascun buffer (corrispondente alla piastra 1 a 96 pozzetti) a 10,5 ml di ospitare per luminometro priming.
- Selezionare i pozzi di essere tressati (tutti i pozzetti è l'impostazione predefinita).
- Estendere il 'Ritardo prima della misura' impostazione a 5 secondi, con un tempo di misura di 10 sec (vedi 29 per la spiegazione).
- Capillare lavaggio passi: 3x acqua, EtOH 3x, 3x acqua, 3x asciutto. Buffer Prime volta nei rifiuti, e poi serata una seconda volta indietro nelle provette tampone per garantire la miscelazione. Iniettare il buffer lucciola prima e primo nel capillare sinistra, seguito dal Renilla nel capillare destra.
NOTA: piastre multipli possono essere letti e dati memorizzati sullo stesso file excel, tuttavia problemi possono essere riscontrati con piastra più letture in cui il programma andrà in crash luminometro. Assicurarsi di salvare tutti i dati tra le misurazioni e prendere screenshot se il programma va in crash prima è possibile salvare.
- Sostituire vecchi tamponicon il nuovo, assicurandosi di primo almeno due volte con nuovi buffer prima di iniziare la nuova piastra.
Analisi 8. Dati
- Utilizzare le tabelle excel "3'LIFE - analisi piatto unico" e "3'LIFE - analisi multidisco" disponibile da www.mangonelab.com . Copiare i dati grezzi per lucciola e Renilla luciferasi misurazioni da file di output luminometer in posizioni corrispondenti alla condizione negativa, miRNA # 1 e # 2 miRNA nel "3'LIFE - analisi piatto unico" foglio di calcolo.
- Il foglio di calcolo calcolerà automaticamente lucciola / rapporto Renilla e normalizzare ogni miRNA al controllo negativo appropriato e normalizzare i valori di repressione su ogni piatto.
NOTA: Questo foglio di calcolo identificherà automaticamente pozzi con segnale a basso luciferasi, evidenziare pozzi significativamente repressi, e prevedere misure di repressisu tutta l'intera piastra. Vedere 24 per una spiegazione dettagliata di analisi statistica.- Copiare i valori dalla casella "normalizzato RI Index", in celle corrispondenti nel - foglio "3'LIFE analisi multidisco" nella posizione corrispondente a replicare # 1 per ogni miRNA testata. Ripetere l'operazione per tutte le repliche biologiche effettuate in giorni diversi.
- Se lo si desidera, inserire i nomi dei geni e lo stato di previsione bersaglio nelle colonne B e D, rispettivamente.
- Lasciare che il foglio di calcolo per calcolare automaticamente la media di tutto piatto. Osservare i dati in formato 96 ed una mappa di calore (figura 2). Il file organizza anche i dati in formato elenco (Figura 2).
NOTA: L'indice di repressione è la misura utilizzata per identificare bersagli putativi miRNA. Diversi parametri stringenza possono utilizzare, in base a preferenze individuali. In media si considera probabili colpi sotto indice repressione di 0.8 e statisticamente significativa con il test t (p -value <0,05). Come mostrato in Figura 3 potenziali obiettivi sulla base di questi criteri saranno evidenziati in rosso.
- Lasciare che il foglio di calcolo per calcolare automaticamente la media di tutto piatto. Osservare i dati in formato 96 ed una mappa di calore (figura 2). Il file organizza anche i dati in formato elenco (Figura 2).
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Representative Results
Il file di output luminometro contiene misure prime per entrambe le proteine luciferasi lucciola e Renilla. Questo formato raw è compatibile con il "3'LIFE - analisi piatto unico" e "3'LIFE - analisi multidisco" fogli di calcolo disponibile sul sito web laboratorio Mangone ( www.mangonelab.com ). Il singolo analisi piatto foglio elettronico calcola automaticamente lucciola / rapporto Renilla, normalizza ogni miRNA al controllo negativo appropriata, e normalizza i valori repressione su ogni piatto. Questo foglio di calcolo identifica automaticamente i pozzetti con basso segnale luciferasi Renilla, mette in evidenza i pozzi che presentano la repressione rispetto al controllo negativo, e fornisce misure di repressione di tutta la piastra (Figura 2). Vedere 24 per una spiegazione dettagliata di analisi statistica.
Più repliche possono essere analizzared utilizzando il foglio di calcolo "analisi multidisco". Ogni replica viene confrontato fianco a fianco, e misure statistiche dei dati sono calcolati automaticamente (Figura 3). Oltre al confronto tra repliche con le colonne "Repressione normalizzato", l'utente può confrontare repressione tra le due miRNA sotto il "miRNA # 1 / miRNA # 2" colonne. Questa misura divide l'indice di repressione per ogni miRNA per ogni replica. Questa misura può indicare valori errati dal saggio di luciferasi (ad esempio anormalmente letture alte o basse, con il controllo negativo, vedi figura 3, riga A9, Rep # 3), e pozzi dove l'indice di repressione non può indicare sostanziale repressione, ma che fanno mostra differenze significative tra i miRNA. Anche se questo provvedimento non può essere utilizzato direttamente per indicare un bersaglio miRNA, è utile per identificare i valori anomali, pozzi problematici, o di modelli di dati che non sono esclusivamente attribuiti a dirigere miRNA regolamento.
La repressione Index (RI) viene utilizzato per chiamare un bersaglio putativo miRNA, con valori più bassi corrisponde ad una maggiore repressione relativa. La soglia per la chiamata bersagli putativi si basa sul livello di rigorosità richiesta dal ricercatore, ma combinando la RI con 3'UTRs che visualizzano statisticamente significativi valori di p (p <0,05) indicherà bersagli alta confidenza (vedi Figura 2 file B8 e B12).
Figura 1: 3'LIFE Assay (A). Vettori compatibili Gateway utilizzati nel test 3'LIFE. Top: il gene della luciferasi (Fluc) è fusa al 3'UTR di prova, mentre il gene della luciferasi Renilla (RLuc) è fusa alla aspecifica SV40 pA 3'UTR come controllo. In basso: Il RFP- miRNA-introne vector - La sonda di pre-miRNA, oltre a ~ 400nucleotidi nel suo locus genomico (ricapitolare elaborazione miRNA endogena), viene clonato all'interno di un introne per consentire la sua co-espressione con DsRed2 fluorocromo. Entrambi i vettori sono pubblicamente disponibili (Seiler et al., 2013). (B) Diagramma di flusso del 3'LIFE Assay. (C) 3'LIFE Pipeline: Il vettore dual-luciferasi contenente 3'UTR test con o senza i vettori miRNA sono co-trasfettate in cellule HEK293 in piastre da 96 pozzetti. L'interazione tra il miRNA e bona fide 3'UTR bersaglio abbasserà la relativa luminescenza in pozzi specifici (esemplificato dalla macchia arancione nel piatto sperimentale).
Figura 2: Esempio di dati prodotti con test 3'LIFE. Ogni sonda miRNA è testato in quattro copie (replica 1-4). I colori rappresentano i livelli di repressione, con il rossocolori che indicano forte miRNA / interazione 3'UTR. Tutte le repliche sono una media per la produzione di obiettivi di alta qualità presunti riportati nella targa di sintesi sotto la freccia gialla. Scatola bianca rappresentano i controlli, non è riuscito transfezioni o pozzi a bassa efficienza di trasfezione.
Figura 3:. La tabella che rappresenta i dati di riepilogo di un sottoinsieme di interazioni prodotte utilizzando il foglio di calcolo 3'LIFE I valori repressione sono come in Figura 2. Il software calcola la deviazione standard, l'errore standard e z-score per ogni interazione. Statisticamente interazioni significative sono evidenziati in rosso. Gli ultimi quattro righe mostrano repressione relativa di un miRNA all'altro, ed è utilizzato come indicatore secondario di confrontare repressione tra due miRNA diversi. Il foglio può essere scaricato dal www.mangonelab.com
| Firefly reagenti tampone luciferasi | Concentrazione finale (1x) |
| Glicilglicina | 25 MM |
| K x PO 4 (pH 7.8) | 15 MM |
| MgSO4 | 15 MM |
| DTT (conservare a 4º) | 1 mM |
| EGTA | 4 mm |
| ATP * | 2 mm |
| Beetle luciferina * | 250 micron |
Tabella 1: Archivio reagenti lucciola luciferasi: 10x soluzioni di riserva Glicilglicina, K x PO 4, MgSO 4, DTT e EGTA possono essere preparati e conservati separatamente prima di tamponare ricostituzione. 100x Beetle Luciferin (substrato luciferasi di lucciola) può essere negoziod sciogliendo 50 mg luciferina in 7,134 ml H 2 0 (25 mM). Aliquota 105 ml / piatto di disciolto luciferina Beetle in tubi e conservare a -80 ° C. Per supporto tecnico Promega, questo dovrebbe essere stabile per> 6 mesi, ma può essere sensibile alla luce. NOTA: EGTA non entrerà in soluzione a pH neutro. Aggiungere lentamente NaOH di EGTA fino a quando non si scioglie completamente. * Reagenti aggiunti al buffer finale subito prima del test luciferasi
| Renilla reagenti tampone luciferasi | Concentrazione finale (1x) |
| NaCl | 1.1 M |
| Na 2 EDTA | 2,2 mm |
| KH 2 PO 4 | .22 M |
| NaN 3 | 1,3 mm |
| BSA * | .44 Mg / ml |
| Coelenterazine * | 2.5 & #956; M |
Tabella 2: Renilla Archivio reagenti tampone luciferasi Tutti i reagenti, ad eccezione di BSA e coelenterazine possono essere mescolati ad una concentrazione di 1x e conservati a temperatura ambiente. Coelenterazine può essere sciolto in metanolo acidificato e aliquotati per piastra. Acidificare metanolo aggiungendo HCl a concentrazione finale di 5 mM (<3 pH). Sciogliere 250 mg coelenterazine a 2,36 ml di metanolo acidificato (250 micron) aliquote 105 ul / piastra. La miscela è stabile per almeno 6 mesi, ma può essere sensibile alla luce. * Reagenti aggiunto al tampone immediatamente prima del dosaggio luciferasi.
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Discussion
Il test 3'LIFE identifica obiettivi funzionali miRNA in 3'UTRs a high-throughput. Questo test è utile per i ricercatori che desiderano identificare sperimentalmente un gran numero di bersagli putativi per la loro miRNA di interesse. Il saggio 3'LIFE è un approccio potente per eseguire query per 3'UTR regolazione guidata, in quanto il test fornisce una misura funzionale di miRNA targeting e la sperimentazione binario di un singolo giornalista :: 3'UTR contro un singolo miRNA può tranquillamente affrontare lo stato di targeting dei singoli geni. Per convalidare questo approccio, abbiamo proiettato un panel di 275 3'UTRs e contro due miRNA, lasciamo-7c e miR-10b, e comprendeva 10 geni bersaglio precedentemente validate in questa libreria. Otto di questi dieci geni esposti repressione 24. Abbiamo anche osservato un arricchimento significativo di non convalidati obiettivi bioinformatically previsti, e 3'UTRs imprevedibili che contengono elementi di semi canonici tra i nostri migliori successi, suggesting che 3'LIFE è in grado di identificare in buona fede bersagli miRNA.
Un indicatore chiave della sensibilità di schermi high-throughput sono i tassi di falsi positivi e falsi negativi. Mentre il tasso di falsi positivi di questo test deve essere valutata utilizzando approcci alternativi aggiuntivi per convalidare colpi, otto dei dieci controlli positivi inclusi nel nostro schermo repressione esibito a prova di principio, che suggerisce un tasso di falsi negativi del 20%. Tuttavia, molte tecniche sono utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA in contesti cellulari diversi, e l'elaborazione 3'UTR e regolazione con fattori trans-agenti è noto per essere altamente specifico tessuto. Ad esempio, la maggior parte dei 3'UTRs contiene più siti di poliadenilazione, che controllano la lunghezza del 3'UTR nel mRNA maturo. In molti casi l'uso di siti di poliadenilazione prossimali è tessuto specifico, e può escludere siti bersaglio miRNA. Inoltre, cooperativa miRNA targeting, la concorrenza with RNA-binding proteins, e mRNA struttura secondaria possono tutti impatto la capacità di 3'LIFE di rilevare obiettivi miRNA in tessuti specifici. A causa di questo, la rivelazione di bersagli nel dosaggio 3'LIFE può variare in base al contesto cellulare in cui viene eseguito il test, complicando la valutazione dei tassi di errore assoluti. Questo protocollo è ottimizzato per le cellule HEK293T, ma linee cellulari alternativi può essere utilizzato se il ricercatore desidera eseguire il test in un contesto biologico specifico. Tuttavia, l'ottimizzazione dell'efficienza di transfezione e la sopravvivenza delle cellule con ciascuna linea cellulare dovrà essere ottimizzata utilizzando più condizioni di buffer, codici di impulsi, ed il numero di cellule. Un esempio di schema di ottimizzazione possono essere trovate all'indirizzo Wolter et al. 24.
Questo protocollo è stato ottimizzato in formato a 96 pozzetti e specifica l'uso di alcune strumentazioni high-throughput. Nel caso in cui l'ente non possiede le attrezzature necessarie per 96ebbene Nucleofection, Reagenti di transfezione alternativa potrebbe essere utilizzato per eseguire il test 3'LIFE, finché l'efficienza di trasfezione rimane alto. Inoltre, il saggio luciferasi è l'aspetto più tempo del saggio 3'LIFE. Come tale, l'uso di più luminometri è raccomandato per schermi ad alto rendimento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferin | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
| Trypsin | T2600000 | ||
| Consumables | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instruments | |||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
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