समय चूक Brightfield Stereomicroscopy साथ zebrafish लार्वा में ऊतकों की मरम्मत पर कब्जा

Summary

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Abstract

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

Introduction

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival ¹. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system ^2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae ^5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages ^8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential ^13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.

We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells ¹⁵. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses ^16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days ¹⁶, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.

The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

Protocol

Zebrafish (सीप तनाव) स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार नस्ल और उठाए गए थे। सभी प्रयासों संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु के लिए 1 मिमी Tricaine के लिए 0.4 मिमी Tricaine का उपयोग कर, पीड़ा कम करने के लिए किए गए थे। उपयुक्त समिति (एमडीआई जैविक प्रयोगशाला पशु कोर IACUC संख्या 13-20) द्वारा अनुमोदित के रूप में zebrafish भ्रूण और लार्वा अच्छा पशु अभ्यास के साथ सख्त अनुसार संभाल रहे थे। इस अध्ययन प्रोटोकॉल # 14-09 के तहत राष्ट्रीय मानव जीनोम रिसर्च इंस्टीट्यूट पशु की देखभाल और उपयोग समिति, MDIBL संस्थागत आश्वासन # एक-3562-01 द्वारा अनुमोदित किया गया था। नोट: निम्न चरणों में संक्षेप लार्वा zebrafish में फिन उत्थान को दर्शाता है कि इमेजिंग प्रक्रिया: लार्वा चरणों के लिए Zebrafish की 1. स्थापना अंडे ले लीजिए और 0.00004% methylene नीले रंग के साथ पूरक विआयनीकृत पानी में 0.03% त्वरित महासागर नमक युक्त एक 100 x 25 मिमी पेट्री डिश में लगभग 50 अंडे जगह है। एक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हे / एन सेते हैं। <ली> अगली सुबह एक गिलास विंदुक के साथ मृत भ्रूण को हटा दें और विआयनीकृत पानी (करार दिया भ्रूण माध्यम) में 0.03% त्वरित महासागर नमक के साथ एक छलनी में अंडे कुल्ला। नोट: पसंद किया जा सकता है, जैसे Ringers के 18, हैंक्स 18, E2 के 19 E3, 20, और Danieau 21 के रूप में मध्यम। समर्थन> डिश के लिए नए सिरे से भ्रूण मध्यम जोड़ें। पिगमेंटड उपभेदों का उपयोग अगर पी टी यू melanogenesis और लार्वा के इस प्रकार रंजकता को रोकने जाएगा, के रूप में वैकल्पिक रूप से, 0.2 मिमी 1-फिनाइल-2-Thiourea (पी टी यू) जोड़ें। भ्रूण आगे दो दिनों के बाद निषेचन या किसी भी अन्य वांछित लार्वा चरण तक इनक्यूबेटर में विकसित करते हैं। इमेजिंग कक्ष की 2. तैयारी विधि 1: परमवीर चक्र या Teflon टयूबिंग से बनाया इमेजिंग कक्षों (चित्रा 1) नोट: इस विधि सीपी और एडम्स (1998) 22 के समान है। एक 25 मिमी बाहरी एक साथ एक हार्डवेयर की दुकान से पीने के पानी ग्रेड प्लास्टिक या Teflon टयूबिंग मोलदा 20 मिमी भीतरी व्यास। प्रत्येक पक्ष पर एक भी सतह के साथ लगभग 10 मिमी मोटाई के छल्ले बनाने के लिए ट्यूबिंग काटें। किनारों smoothen करने के लिए> 200 धैर्य sandpaper का प्रयोग करें। गर्म पानी और 70% इथेनॉल के साथ छल्ले साफ करें और उन्हें शुष्क हवा हैं। एक विंदुक टिप के साथ, एक अंगूठी में से एक आधा करने के लिए सिलिकॉन तेल लागू करते हैं और एक 75 मिमी x 25 मिमी गिलास को कवर पर्ची के लिए अंगूठी देते हैं। वैकल्पिक रूप से, सिलिकॉन तेल के बजाय एक विंदुक टिप के साथ भरा एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें। नोट: यह, 3 मिलीलीटर सिरिंज में सिलिकॉन तेल डालने के पहले एक 30 मिलीलीटर सिरिंज के लिए सिलिकॉन तेल जोड़ने और 3 मिलीलीटर सिरिंज भरने के लिए इस का उपयोग करने के लिए मुश्किल है। विधि 2: एक इमेजिंग चैम्बर के रूप में एक पेट्री डिश तैयार करना। ढक्कन (2A चित्रा) से जुड़ी एक गिलास coverslip के साथ 35 या 60 मिमी व्यास पेट्री डिश मोल। Distel और Koester (2007) 23 से 3 चित्र में दिखाया के रूप में वैकल्पिक रूप से, एच काफी छोटे से एक खोलने ड्रिलपुराने एक एक छोटे से पेट्री डिश के ढक्कन में coverslip और एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के साथ बाहर करने के लिए सिलिकॉन तेल लागू होते हैं। एक साफ विंदुक टिप का उपयोग करना, ध्यान से बाहर (चित्रा 2 बी) के लिए एक गोल या इच्छित मोटाई के वर्ग coverslip के लिए देते हैं। Agarose मजबूती इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान संलग्न रहता बढ़ते के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, रिंग के अंदर ठीक एक प्लास्टिक की जाली देते हैं। सबसे पहले, एक कोण के साथ ठीक कैंची का उपयोग आंतरिक रिंग व्यास के आकार में, एक हार्डवेयर की दुकान से प्राप्त खिड़की के पर्दे से बना जाल काट दिया। फिर जाल के बीच में> लार्वा का दो बार आकार एक छोटे आयत में कटौती (चित्रा 1, 2)। कवर पर्ची और कक्ष की अंगूठी (चित्रा 1 ए) के बीच इंटरफेस के लिए गैर विषैले सिलिकॉन तेल के चार छोटे डॉट्स लागू करें। कांच coverslip के नीचे करने के लिए मजबूती से जाल संलग्न करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। 3. बढ़ते और पूर्व inj के इमेजिंगured लार्वा (यह कदम वैकल्पिक है) नोट: फिन उत्थान के बाद विच्छेदन विमान zebrafish लार्वा में स्वीकार करने योग्य नहीं है के रूप में यह कदम, काट और पुनर्जीवित पंख की लंबाई के बीच तुलना के लिए उपयुक्त है। नमूना के स्थिरीकरण के लिए भ्रूण मध्यम में एक 0.5-1.2% कम पिघल agarose समाधान तैयार करें। एक माइक्रोवेव में agarose गर्मी और एक हीटिंग ब्लॉक में 42 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म कर रहे हैं कि 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में तरल agarose हस्तांतरण। गर्म agarose इस तापमान पर कई हफ्तों से अधिक बनाए रखा जा सकता है, जो 42 डिग्री सेल्सियस, के लिए शांत हो जाओ। यह जानवरों के लिए हानिकारक होगा, के रूप में agarose से ऊपर 42 डिग्री सेल्सियस में लार्वा pipetting बचने की कोशिश करें। एक 60 मिमी व्यास पेट्री डिश में भ्रूण माध्यम में 0.4 मिमी Tricaine (पीएच 7) के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर कई लार्वा anesthetize। Zebrafish बुक व्यंजनों 18 के अनुसार Tricaine तैयार करें। 99 के 1000 कमजोर पड़ने: वैकल्पिक रूप से, एक एक के 10 एमएल का उपयोगएक 60 मिमी व्यास पेट्री डिश में% 2-Phenoxyethanol। आगे बढ़ने से पहले उनके स्पर्श प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक छाया हुआ microloader विंदुक टिप के साथ लार्वा प्रहार। केवल गैर जिम्मेदार लार्वा का प्रयोग करें। एक गिलास पाश्चर pipet का उपयोग कर 42 डिग्री सेल्सियस agarose समाधान में एक लार्वा स्थानांतरण। अन्यथा agarose भी पतला और जमना नहीं किया जाएगा, agarose में अत्यधिक तरल स्थानांतरण नहीं है। Pipet से शेष तरल त्यागें और एक छोटे से पेट्री डिश (35 या 60 मिमी व्यास) में agarose की एक बूंद के साथ लार्वा हस्तांतरण। पूंछ फिन के इमेजिंग के लिए अपने पक्ष में लार्वा स्थिति। Agarose जमना करने की अनुमति दें। एक प्लास्टिक विंदुक टिप के साथ agarose आकलन; यह भी तरल है अगर टिप agarose में विसर्जित कर देंगे। Agarose जम गया है, एक छोटे खरोज एक विंदुक टिप के साथ छू पर दिखाई जाएगी। दृढ़ीभवन के बाद, Tricaine समाधान जोड़ने के लिए और समय चूक इमेजिंग के लिए बाद में इस्तेमाल किया जाएगा कि stereomicroscope के लिए आगे बढ़ें। <bआर /> नोट: यह कदम भी भ्रूण माध्यम में 1.5% agarose के साथ लेपित एक पेट्री डिश पर संवेदनाहृत लार्वा रखकर प्रदर्शन किया जा सकता है। समय चूक सॉफ्टवेयर के साथ एक stereomicroscope का प्रयोग करें। समय चूक इमेजिंग के लिए बाद में इस्तेमाल किया जाएगा जो एक उपयुक्त उद्देश्य और बढ़ाई, का चयन करें। इधर, एक stereomicroscope पर 3.5 एक्स, 16 मिमी दूरी काम उद्देश्य लेंस का उपयोग करें। के रूप में वांछित, वैकल्पिक माइक्रोस्कोप और उद्देश्य लेंस का उपयोग लेकिन इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान संभावित XY-बहाव और फिन के विकास के लिए खाते में करने के लिए एक उचित बढ़ाई चयन करें। माइक्रोस्कोप पर कैमरे का पता लगाने के मोड का चयन करें। सॉफ्टवेयर में, स्क्रीन पर लार्वा देखने के लिए 'लाइव' मोड का चयन करें। स्वचालित रूप से चमक पता लगाने के लिए 'गुण' विंडो खोलें। मैन्युअल खुर्दबीन के पार रोशनी के आधार पर विपरीत समायोजित। देखने के क्षेत्र के बाहर लार्वा ले जाएँ और पृष्ठभूमि में कोई कम से कम करने शेडिंग सुधार सुविधा का चयनआईएसई। वापस देखने के क्षेत्र में लार्वा स्थिति और एक स्नैपशॉट ले। छवि बचाने के लिए। पहले सिर बंद agarose scraping द्वारा लार्वा से agarose निकालें। लार्वा धीरे एक छाया microloader pipet टिप या एक कीट पिन के साथ शेष agarose से दूर सिर खींच कर agarose के बाहर फिसल किया जा सकता है इस तरह। एक गिलास पाश्चर pipet के साथ ताजा Tricaine समाधान में लार्वा हस्तांतरण। 4. विच्छेदन परख भ्रूण माध्यम का उपयोग कर एक 1.5% agarose समाधान तैयार है और एक पेट्री डिश में एक पतली परत डाल देना। Agarose जमना। एक stereomicroscope के तहत, जम agarose पर लार्वा बगल की ओर जगह है और थोड़ा दबाव (चित्रा 3 ए) के साथ एक 23 जी सिरिंज सुई के साथ पूंछ पंख काटना। 5. समय चूक इमेजिंग के लिए लार्वा बढ़ते 3.5 (3B चित्रा) – चरणों 3.1 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें। <li>, इमेजिंग कक्ष अंगूठी (कदम 2.1) में लार्वा युक्त 42 डिग्री सेल्सियस पर 0.5-1.2% तरल agarose की एक बूंद स्थानांतरण लार्वा पूरबी और agarose जमना करते हैं। Tricaine समाधान के साथ अंगूठी भरें। पेट्री डिश चैम्बर (2.2 कदम) का उपयोग किया जाता है, तो वैकल्पिक रूप से, ढक्कन coverslip पर लार्वा माउंट और Tricaine समाधान के साथ ढक्कन भरें। घटित करने के लिए उचित घाव भरने या ऊतक उत्थान की अनुमति देने के लिए, ध्यान से एक छाया हुआ microloader विंदुक टिप या एक कीट पिन का उपयोग डिस्टल पूंछ पंख आसपास के agarose परिमार्जन। फिन बार बार (चित्रा -3 सी) को घायल करने के लिए नहीं की कोशिश करें। Agarose हटाया युक्त Tricaine समाधान छानना और ताजा Tricaine समाधान के साथ चैम्बर अंगूठी भरें। चैम्बर की अंगूठी के शीर्ष करने के लिए सिलिकॉन तेल लागू करते हैं और एक 75 मिमी x 25 मिमी गिलास स्लाइड देते हैं। वे brightfield इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप और समय के साथ लार्वा सूखना के रूप में होगा, चैम्बर में हवा जेब से बचने की कोशिश करें। एक पेट्री डिश के रूप में प्रयोग करते हैंएक इमेजिंग कक्ष, नीचे चैम्बर के शीर्ष रिम के लिए सिलिकॉन तेल लागू करते हैं और Tricaine समाधान के साथ नीचे चैम्बर भरें। ध्यान से ढक्कन में Tricaine समाधान छानना और हवा जेब से बचने के लिए एक मामूली कोण पर नीचे चैंबर के Tricaine समाधान में लार्वा को विसर्जित करने के ढक्कन पर बारी। कक्ष सिलिकॉन तेल की वजह से बंद हो जाएगा। 6. समय चूक इमेजिंग 23,24 (चित्रा 4) खुर्दबीन के आसपास ऊष्मायन चैम्बर .Place और गर्मी पर बारी में वर्णित के रूप में एक गर्म ऊष्मायन चैम्बर इकट्ठे। 20 मिनट या तापमान स्थिर हो गया है – जब तक के बारे में 10 के लिए 28 डिग्री सेल्सियस के तापमान को समायोजित करें। गरम ऊष्मायन चैम्बर के सामने खोलें और उद्देश्य की ओर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ coverslip के साथ माइक्रोस्कोप स्टैंड पर इमेजिंग कक्ष जगह है। देखने के क्षेत्र के 2/3 खाली रहता है कि एक तरह से लार्वा फिन स्थिति। इस का कब्जा सुनिश्चित करता हैलार्वा का स्थान बदलने के लिए बिना विकास और इमेजिंग प्रक्रिया के पाठ्यक्रम पर फिन के उत्थान। पूर्व brightfield तीव्रता या agarose के संभावित पारियों में परिवर्तन से बचने के लिए समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए 30 मिनट ~ के लिए 28 डिग्री सेल्सियस के लिए मुहिम शुरू लार्वा को समायोजित करें। वैकल्पिक रूप से, कम समायोजन समय के बाद इमेजिंग शुरू करने के लिए पूर्व गर्म बफर का उपयोग। समय चूक रिकॉर्डिंग की स्थापना करने के लिए, AxioVision सॉफ्टवेयर में 6D बहुआयामी अधिग्रहण खिड़की खुली और z ढेर और समय चूक विकल्प चुनें। Z ढेर टैब और स्लाइस मोड में) वैकल्पिक, टुकड़ा मोटाई का चयन करें और फिर शुरु / बंद करो मोड का चयन करें। ढेर के ऊपरी और निचले स्थिति को परिभाषित करें। समय चूक टैब में, अंतराल और फिल्म की अवधि का चयन करें और फिर शुरू बटन दबाकर फिल्म शुरू करते हैं। हम 30 मिनट के अंतराल पर्याप्त हैं और इस अंतराल अत्यधिक डेटा उत्पन्न नहीं करता पाया कि; हालांकि shorteआर के अंतराल में इस्तेमाल किया जा सकता है। लार्वा पूर्व समायोजित नहीं किया गया था कि अगर पहले घंटे के दौरान स्थिति और z ढेर आयामों की जाँच करें। यदि आवश्यक हो लार्वा स्थानांतरित कर दिया है हो सकता है, के रूप में, एक दिन के बाद फिर से लार्वा रखते हैं। समय चूक रिकॉर्डिंग के अंत में फ़ाइल सहेजें और बाद के प्रसंस्करण और इस तरह के Imaris 25 या खुला स्रोत सॉफ्टवेयर संकुल छवि जम्मू में 26 और फिजी में 27 के रूप में उपलब्ध है, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर quantifications साथ आगे बढ़ना। 7. डेटा विश्लेषण फिन लंबाई निर्धारित। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में समय व्यतीत फिल्म खुला और सॉफ्टवेयर प्रदर्शन को बढ़ाने के मालिकाना फ़ाइल प्रारूप में फाइल को बचाने के लिए। अनुमान के ढेर के रूप में अलग-अलग वर्गों प्रदर्शित करने के लिए ओर्थोगोनल दृश्य चुनें। बहाव सुधार के लिए, फिजी मेनू के तहत, प्लगइन्स, तो पंजीकरण, और 'सही 3 डी बहाव' का चयन करें। यह एक फिजी खिड़की खुली और बहाव सुधार प्रदर्शन करेंगे। सहीImaris स्पॉट समारोह में बारी-बारी से बहाव। वैकल्पिक रूप से, छवि जम्मू में StackReg और TurboReg plugins स्थापित और फिजी के लिए आयात करते हैं। StackReg प्लगइन में वांछित परिवर्तन कलन विधि चुनें। दूरी (जैसे, घाव व्यास या पंख लंबाई) को मापने के लिए, ऊपरी बाएँ टूल बार में 'जोड़ें नई माप अंक' विकल्प का चयन करें। नीचे बाएँ मेनू में 'दिखाई दे सांख्यिकी मूल्यों का कॉन्फ़िगर सूची' के तहत, सांख्यिकी मूल्यों प्रदर्शित करने के लिए चयन करें। सेटिंग्स टैब के तहत 'लाइन मोड' में 'जोड़े (एबी, सीडी …)' का चयन करें। चुनिंदा 'नाम' और 'दूरी' 'गुण लेबल' में, माप लाइन के बगल अंक ए और बी के बीच की दूरी को प्रदर्शित करने के लिए। 'संपादन' मोड में स्विच करें और पृष्ठदंड के अंत में पहला बिंदु का चयन करने के लिए पाली बटन दबाए रखें। फिर बाहर का पंख मार्जिन पर दूसरा बिंदु का चयन करने के लिए एक ही विन्यास का उपयोग करें। 'आँकड़े' टैब के अंतर्गत, प्रदर्शन और छवि में दूरी निर्यात करने के लिए निचले सही में डिस्क बटन (निर्यात सभी) का चयन करें। सही करने के लिए नीचे दी गई छवि स्लाइडर चलती द्वारा चयनित समय पर माप दोहराएँ। इसके बजाय नई माप अंक बनाने का, पिछले वाले पहले बाईं माउस बटन के साथ बिंदु चुना है, तो एक साथ नए स्थान पर पारी और बाईं माउस बटन दबाकर repositioned किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से माप अंक विकल्प के लिए, दूरी को मापने के लिए टुकड़ा दर्शक का उपयोग। टुकड़ा दृश्य विधा में, एक इच्छित स्थान के लिए स्क्रॉल और बाईं माउस बटन के साथ पहले और दूसरे स्थान पर क्लिक करें। दूरी प्रदर्शित किया जाएगा। यह विकल्प हालांकि डेटा निर्यात के लिए अनुमति नहीं है। ImageJ में फिन की लंबाई और क्षेत्र का निर्धारण। .zvi फ़ाइल स्वरूप को पहचानता है कि एक प्लगइन का उपयोग ImageJ में समय व्यतीत फिल्म खुला। वैकल्पिक रूप से, एक qu में लोडickTime फ़ाइल या झगड़ा अनुक्रम। नोट: एक असम्पीडित झगड़ा फ़ाइल स्वरूप का उपयोग करते हैं, तो छवि आयाम निर्दिष्ट करने की जरूरत नहीं है। फ़ाइल जानकारी के बिना एक अलग फ़ाइल स्वरूप खोलने हैं, पहली छवि दूरी और इकाई को परिभाषित करने के लिए 'विश्लेषण' मेनू के तहत 'सेट स्केल' का चयन करें। 'पिक्सल में दूरी' में 'सेट स्केल मेनू', प्रकार में, पिक्सेल मूल्य के लिए 'ज्ञात दूरी' में प्रकार के नीचे (इस छवि को जोड़ा गया है कि एक पैमाने पर पट्टी पर पिक्सल की संख्या को मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है , तब) परिणाम प्राप्त करने के लिए उपाय क्लिक करें, और 'लंबाई की इकाई' (आम तौर पर 'माइक्रोन')। उसके बाद OK। फिन क्षेत्र मापन टूल बार में 'मुक्तहस्त चयन' उपकरण का चयन करें और बाईं माउस बटन पकड़ नीचे है, जबकि फिन की रूपरेखा के साथ ड्राइंग द्वारा फिन क्षेत्र रूपरेखा के लिए। फिन लंबाई मापन के लिए, 'सीधे' पंक्ति उपकरण का चयन करें और हो वांछित अंक के बीच एक रेखा खींचनामापा। फिन के क्षेत्र और लंबाई प्रदर्शित करने के लिए 'विश्लेषण' के अंतर्गत 'उपाय' विकल्प पर क्लिक करें। फिल्म के कई समय बिंदुओं के लिए आवश्यक के रूप में के रूप में अक्सर इस चरण को दोहराएँ। डेटा आँकड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सकते रेखांकन भी प्रदर्शित किया।

Representative Results

प्रस्तुत तकनीक विच्छेदन के जवाब में ऊतकों की मरम्मत की गतिशीलता को स्पष्ट करने के लिए उपयुक्त है। फिल्म फिन के विच्छेदन शुरू में में मौजूद हैं कि एक्टिन-मायोसिन केबलों के माध्यम से संकुचन द्वारा विशेषता एक पर्स-स्ट्रिंग प्रभाव, चलाता है यह दर्शाता है कि 28 फिन गुना (चित्रा 5 ए, बी)। समन्वित रूप से, कोशिकाओं घाव (फिल्म देखें) से निकाला जाता है। संकुचन इस प्रकार की संभावना कोशिका मृत्यु गुजरना करने के लिए किस्मत में हैं कि कोशिकाओं को निष्कासित करने का एक साधन हो सकता है। हमारे परिणाम आगे फिन उत्थान के बारे में 14 घंटे बाद विच्छेदन तक आरंभ नहीं करता है, जबकि (चित्रा 5C विच्छेदन निम्नलिखित 36 घंटा के समय के पाठ्यक्रम पर फिन की लंबाई और क्षेत्र के आधार पर मापा जाता है के रूप में लार्वा के विकास के विकास, स्वतंत्र रूप से उत्थान (फिल्म) के कारण होती है कि पता चलता है , डी)। 1.5 दिनों के बाद कुल पुनर्योजी पंख विकास मूल फिन लंबाई (चित्रा 5E) के बारे में 60% थी। साथ में ले ली, इन परिणामों कि विच्छेदन टीआर का प्रदर्शन फिन संकुचन, घाव, और एक अस्थायी देरी पुनर्योजी प्रतिक्रिया से कोशिकाओं के बाहर निकालना iggers। Extruded कोशिकाओं की संभावना कोशिका मृत्यु गुजरना करने के लिए किस्मत में हैं, वहीं इन कोशिकाओं की प्रकृति आगे स्पष्ट किया जाना चाहिए। चित्रा 1. इमेजिंग कक्ष अंगूठी विधानसभा दिखाया गया है (ए) सिलिकॉन तेल के साथ एक coverslip से जुड़ा हुआ है कि एक प्लास्टिक की अंगूठी है। एक प्लास्टिक की जाली सिलिकॉन तेल के चार छोटे डॉट्स के साथ कक्ष के अंदर से जुड़ी है। (बी) घुड़सवार लार्वा युक्त चैम्बर Tricaine समाधान से भर जाता है और एक गिलास स्लाइड शीर्ष से जुड़ा हुआ है। (सी) एक दो दिन पुरानी लार्वा (तीर) के जाल के संबंध में उसके आकार को दर्शाती उच्च बढ़ाई दिखाया गया है मुहिम शुरू की।"_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2. इमेजिंग कक्ष विधानसभा पेट्री डिश से बनाया है। दिखाया गया है (ए) कांच coverslip से जुड़ी एक प्लास्टिक की जाली के साथ एक वाणिज्यिक गिलास शीर्ष गिलास नीचे पेट्री डिश है। दिखाया (बी) ढक्कन और सिलिकॉन तेल के साथ बाहर से जुड़ी एक coverslip में drilled छेद के साथ एक आत्म-निर्माण पेट्री डिश चैम्बर है। जाल और लार्वा Tricaine समाधान युक्त कक्ष के अंदर बढ़ रहे हैं। चैम्बर सील करने के लिए, सिलिकॉन तेल नीचे कक्ष और संलग्न ऊपर ढक्कन के ऊपरी, बाहरी रिम के लिए लागू किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <iमिलीग्राम alt = "चित्रा 3" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 52,654 / 52654fig3.jpg" /> विच्छेदन और इमेजिंग के लिए एक लार्वा के बढ़ते 3. योजना चित्रा। (ए) के विच्छेदन के लिए, एक agarose लेपित पेट्री डिश पर एक anesthetized लार्वा जगह और एक सिरिंज सुई के साथ पूंछ पंख काटना। बढ़ते के लिए (बी), 42 डिग्री सेल्सियस तरल agarose के साथ भरा एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक हस्तांतरण विंदुक के साथ लार्वा हस्तांतरण और इमेजिंग चेंबर में लार्वा युक्त एक बूंद पिपेट, मछली पूरबी और भ्रूण मध्यम के साथ agarose जम कवर किया। (सी) एक छाया microloader विंदुक टिप या इसी तरह के उपकरण का उपयोग कर पूंछ पंख से agarose परिमार्जन और ताजा माध्यम से भ्रूण मध्यम बदलें। (डी) छवि एक stereomicroscope के तहत पूंछ पंख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <p class="jove_content" fo:keep-together.within पृष्ठ = "हमेशा"> 4. स्व-निर्माण गरम ऊष्मायन चैम्बर चित्रा। दिखाया (एसी) गत्ता, बुलबुला लपेटो और वेल्क्रो का बना एक गर्म ऊष्मायन चैम्बर है। (मूल चिकन अंडे ऊष्मायन के लिए डिजाइन) एक दूसरे से जुड़े गुंबद हीटर एल्यूमीनियम टेप का उपयोग कर कक्ष से जुड़ा हुआ है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 5. फिन उत्थान गतिशीलता चित्रा। उपयोग किया पूंछ पंख विच्छेदन परख और मात्रा का ठहराव विधि (ए) योजना फिन लंबाई (लाल तीर) और क्षेत्र (फिन के लाल रूपरेखा) निर्धारित करने के लिए। (बी) के पूंछ पंख विच्छेदन शुरू में फिन के संकुचन, रेगे द्वारा पीछा चलाता हैnerative ऊतक परिणाम। पार्श्व आकार में वृद्धि के सबूत के रूप फिन भी, विकासात्मक विकास आए। दिखाया (सी) 14 HPA ~ पर एक रेखीय पुनर्योजी विकास प्रारंभिक खुलासा समय के एक समारोह के रूप में फिन की लंबाई है। फिन क्षेत्र (डी) मात्रा शुरू में एक पंख के संकुचन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जो आकार में कमी का पता चलता है। ~ 14 घंटा के बाद, एक रेखीय दर पर फिन का आकार बढ़ता है। विच्छेदन से पहले फिन लंबाई की और 36 घंटे के बाद (ई) तुलना ~ 60% पुनर्वृद्धि पता चलता है। स्केल बार: 100 माइक्रोन लघुरूप: पूर्व amp, पूर्व विच्छेदन; घंटे विच्छेदन, HPA पोस्ट; regen, उत्थान; और, विच्छेदन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। मूवी । 36 के समय के पाठ्यक्रम पर फिन उत्थानघंटा। दिखाया उत्थान के दौरान 2.5-दिन पुराने लार्वा की एक पूंछ पंख है। शुरू में 30 मिनट पद विच्छेदन पुनर्योजी विकास एक 3.5 उद्देश्य लेंस का उपयोग कर एक stereomicroscope पर 30 मिनट के अंतराल में imaged है।

Discussion

प्रस्तुत विधि, एक brightfield stereomicroscope पर इन विवो समय चूक इमेजिंग के साथ zebrafish लार्वा रहने वाले एक अपेक्षाकृत सरल सेट-अप का उपयोग करने में घाव भरने और ऊतक उत्थान के अवलोकन के लिए अनुमति देता है। इस प्रक्रिया के परिणाम का अनुकूलन होगा जो हम परीक्षण किया है कि कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं की आवश्यकता है: लगातार बढ़ रही लार्वा zebrafish के विकास के लिए बाधाओं को कम कर देंगे 1) कम से agarose सांद्रता (~ 0.5%), 2) फिन के आसपास agarose की हटाना महत्वपूर्ण नहीं है घाव भरने की प्रक्रिया अस्पष्ट करने के लिए, 3) एक प्लास्टिक की जाली में agarose फँसाने प्रक्रिया के दौरान एक स्थिर स्थिति में agarose और जानवर को बरकरार रखे हुए है, और 4) लार्वा व्यवहार्यता के लिए आवश्यक है, जो एक उचित तापमान नियंत्रित वातावरण,। हम गत्ते पर टेप है कि बुलबुला लपेटो का इस्तेमाल करता है जो एक गर्म ऊष्मायन चैम्बर ^23,24, और के दौरान कम से कम उतार चढ़ाव के साथ तापमान और उचित हवा परिसंचरण को नियंत्रित करने के लिए एक दूसरे से जुड़े गुंबद हीटर अनुकूलित हैइमेजिंग प्रक्रिया। यह सरल और लागत प्रभावी चैम्बर किसी भी माइक्रोस्कोप फिट करने के लिए तैयार किया जा सकता है। इसी प्रकार का एक गर्म ऊष्मायन चैम्बर भी इमेजिंग चूहों और लड़की विकास ^24,29 के लिए उपयोग किया गया है।

हम पूर्व काट लार्वा एक पूर्व विच्छेदन छवि के लिए मुहिम शुरू कर रहे हैं सुझाव है कि, विच्छेदन के लिए demounted, और समय चूक इमेजिंग के लिए remounted। यह अंतिम इमेजिंग कक्ष में एक भी कदम में इन चरणों को पूरा करने के लिए संभव है, हमारे अनुभव में हम यह ऊतक आँसू और एक साफ कटौती में परिणाम नहीं करता है के रूप में एक गिलास coverslip पर पूंछ पंख amputating, इष्टतम नहीं है कि पाया। एक सिरिंज सुई का उपयोग agarose आधारित विच्छेदन विधि मूल Kawakami और उनके सहयोगियों (2004) ¹⁶ से वर्णित है और हमारे अनुभव में, यह भी amputations प्रदर्शन करने के लिए आदर्श हो गया है। इस प्रकार, हम प्रस्तुत कदम है कि की नहीं बल्कि जटिल श्रृंखला में अच्छी तरह से उचित है और एक इष्टतम उत्थान परिणाम सुनिश्चित करता है।

हम चाहते हैं कि larv दिखाया2 DPF पर अल zebrafish agarose और Tricaine समाधान में 1.5 दिनों के लिए imaged किया जा सकता है। हम प्रस्तुत इमेजिंग अवधि के लिए नमूना के स्वास्थ्य के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, जो तुरंत महासागर नमक, के साथ तैयार पीएच अनुकूलित Tricaine (pH7) समाधान का इस्तेमाल किया। हम पहले हालांकि यह भी Danieau माध्यम में Tricaine का उपयोग करते हुए कम से कम दो दिनों ^{में 30} के लिए एक confocal खुर्दबीन पर लार्वा zebrafish DPF 2.5 के समय चूक इमेजिंग कि परमिट का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, इष्टतम बफर शर्तों लार्वा स्वास्थ्य और इमेजिंग की लंबाई बढ़ाई जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, कम Tricaine सांद्रता हम अच्छी तरह से कम से कम 60 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर लार्वा और वयस्क चरणों के दौरान सहन किया है जिसमें पाया गया संज्ञाहरण, या 2-Phenoxyethanol, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

फिन उत्थान में दोष से बचने के लिए, हम इमेजिंग के लिए पहले पूंछ पंख से agarose हटा दिया। हमारे डेटा 1.5 दिनों के भीतर फिन के बारे में 60% करने के लिए पुनर्जीवित किया है कि पता चलता है। इस उत्थान दर 3 दिन एक निर्णायक पिछले एक अध्ययन के अनुरूप है¹⁶ DPF से 6 zebrafish लार्वा ऊपर में पूंछ पंख के उत्थान के लिए एक औसत समय है। Agarose के लिए वैकल्पिक तरीकों हालांकि इमेजिंग के लिए मछली माउंट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पतली प्लाज्मा प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी ³² के लिए सिफारिश की गई है ³¹ या fluorinated ईथीलीन Propylene (FEP) ट्यूबों methylcellulose के साथ लेपित और बहुत कम agarose सांद्रता (0.1%) के साथ भर के थक्के और हमारे प्रस्तुत विधि के लिए उपयुक्त हो सकता है। वे नमूना वजह से इन मीडिया के solidification की कमी के कक्ष के तल पर बढ़ रहे हैं कि आवश्यकता के रूप में हालांकि, हम methylcellulose और 0.1% agarose सिफारिश नहीं है। Methylcellulose के बहुत उच्च सांद्रता इसके अलावा हमारे अनुभव के आधार पर हवा जेब उत्पन्न होगा, और इन इमेजिंग प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इन मीडिया नीचे चैम्बर उपयोग करने के साथ पसंद कर रहे हैं, यह उद्देश्य लेंस और नमूना के बीच एक उचित काम दूरी मौजूद है जो महत्वपूर्ण है। यह मीटर है कि ध्यान दिया जाना चाहिएयह लार्वा स्वास्थ्य ³² के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में एक बढ़ते माध्यम के रूप में ethylcellulose, केवल एक दिन के लिए के लिए सिफारिश की है।

ढक्कन में नमूना बढ़ते एक धीमी गुरुत्वाकर्षण नीचे बहाव में परिणाम हो सकता है। इसलिए यह या तो एक भी विमान या अंतिम फिल्म कोडांतरण के लिए निकाला जा सकता है फोकल हवाई जहाज़ में हैं कि केवल छवियों में पेश किया जा सकता है, जो हर बार बिंदु पर छवि कई वर्गों के लिए सिफारिश की है। नीचे चैंबर में नमूना इमेजिंग संभावित नीचे बहाव से बचने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति हो सकता है। प्लाज्मा नमूना को स्थिर कर सकते हैं इसलिए बाहरी घेर परत (EVL, periderm) ³¹ से चिपके रहते हैं और करेंगे के रूप में प्लाज्मा के थक्के, बहाव से बचने के लिए उपयोगी हो सकता है। हालांकि यह रूप में अच्छी तरह से लंबे समय लार्वा zebrafish लार्वा स्वास्थ्य या फिन उत्थान के साथ हस्तक्षेप किए बिना प्लाज्मा के थक्के में बनाए रखा जा सकता है कि कैसे के रूप में परीक्षण किया जा करने की जरूरत है।

हमारी फिल्म अलग-अलग वर्गों के उपयोग इकट्ठा किया गया था (26 माइक्रोन)इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान फिन के संभावित Z-बहाव के लिए जिम्मेदार है जो फिन (~ 10 माइक्रोन) और की पूरी मोटाई कवर किया है, जो एक रिकॉर्ड z ढेर, के। 3-डी जानकारी बनाए रखने के क्रम में, यह एकल छवियों में जेड के ढेर परियोजना के लिए भी संभव है। इस छवि के धुंधलेपन में हो सकता है, क्योंकि brightfield deconvolution के वांछित जा सकता है। ऐसे Deconvolve या Autoquant X3 के रूप में सॉफ्टवेयर, इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, (Tadrous ³³ में वर्णित) गणितीय एल्गोरिदम उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) के एक बिंदु-प्रसार समारोह प्राप्त करने के लिए आवेदन किया जा सकता है। एक उच्च SNR प्राप्त brightfield deconvolution में प्रमुख बाधाओं में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। इस विधि उच्च विपरीत और पतली नमूना मोटाई की आवश्यकता है, यह इसकी वजह से कम चौड़ाई के पूंछ पंख की इमेजिंग के लिए उपयुक्त होगा।

प्रस्तुत इमेजिंग विधि का एक स्पष्ट लाभ यह एक सीसीडी कैमरा एक से लैस किसी भी stereomicroscope के लिए तेजी से अनुकूलनीय हैD समय चूक सॉफ्टवेयर और एक कम लागत वैकल्पिक करने के लिए और अधिक महंगा confocal इमेजिंग प्रणाली प्रदान करता है। इस विधि सेल का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति का उपयोग नहीं करता है, यह शटर नियंत्रण और बाद इमेजिंग deconvolution के सॉफ्टवेयर ³⁴ के लिए एक स्वचालित प्रणाली के उपयोग के द्वारा इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए बढ़ाया जा सकता है। यह आगे अब समय अवधि से अधिक एकल कोशिका या subcellular संकल्प के साथ घाव की मरम्मत और उत्थान प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए उपयोगकर्ताओं के लिए सक्षम होगा।

ऑप्टिकल स्पष्टता और आसानी जो भ्रूण और लार्वा zebrafish साथ संभाला जा सकता है, और किसी भी stereomicroscope के लिए इस विधि का अनुकूलन क्षमता एक कक्षा में स्थापित करने में बुनियादी कशेरुकी जीव विज्ञान पढ़ाने के लिए यह उपयुक्त बनाता है। इस विधि के ऊतकों की मरम्मत और उत्थान अंतर्निहित बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं का एक बेहतर समझ के साथ छात्रों को प्रदान कर सकते हैं। इसी तरह की एक विधि के साथ कब्जा कर लिया गया है कि अन्य जैविक प्रक्रियाओं zebrafish भ्रूण विकास ^23,34 और हृदय हैंसमारोह (अप्रकाशित)। इस पद्धति का भी आनुवंशिक रूप से और औषधीय चालाकी से किया गया है कि लार्वा में निगरानी घाव की मरम्मत और उत्थान के लिए संभावना प्रदान करता है।

Materials

Reagents
Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)
Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)
1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]
Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)
Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)
2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)
Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)
Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)
Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)
5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm
Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)
Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)
Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal – 48" (Home Depot)
DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE
Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007)
Fine Scissors – Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)
3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657)
60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)
23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)
Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)
Equipment
LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)
Zeiss Discovery.V12 compound microscope
Zeiss Plan Apo S 3.5X objective
Zeiss AxioCam MRm
Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)