We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.
The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.
The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.
Den presenterte metoden gjør for å observere sårheling og regenerering av vev i levende sebrafisk larver med in vivo time-lapse bildebehandling på en lysfelt stereomikroskop, ved hjelp av et relativt enkelt oppsett. Denne fremgangsmåten krever visse viktige aspekter som vi har testet, noe som vil optimalisere resultatet: 1) Lave agarose konsentrasjoner (~ 0,5%) vil redusere vekst hindringer av stadig voksende larvesebrafisk, 2) Fjerning av agarose rundt finnen er viktig ikke å skjule helbredelsesprosessen, 3) Overlapping agarose i en plast mesh beholder agarose og dyr i en stabil posisjon under hele prosedyren, og 4) passende temperatur-kontrollert miljø, noe som er viktig for larve levedyktighet. Vi har tilpasset en oppvarmet inkubasjon kammer 23,24, som benytter bobleplast som er tapet på papp, og et kablet kuppel varmeapparat å kontrollere temperaturen og luftsirkulasjon med minimale svingninger i løpet avbildebehandling prosedyre. Denne enkle og kostnadseffektive kammer kan være forberedt på å passe enhver mikroskop. En tilsvarende oppvarmet inkubasjon kammeret er også benyttet for avbildnings mus og kylling utvikling 24,29.
Vi foreslår at pre-amputert larver er montert for en pre-amputasjon image, demonteres for amputasjon, og spent for time-lapse bildebehandling. Selv om det er mulig å utføre fremgangsmåten i et enkelt trinn i den endelige avbildning kammeret, etter vår erfaring har vi funnet at amputating halefinnen på et dekkglass er ikke optimal, da den river vevet og ikke resulterer i et rent snitt. Agarosen baserte amputasjon metode ved hjelp av en sprøyte nål ble opprinnelig beskrevet av Kawakami og kolleger (2004) 16 og er også, i vår erfaring, ideelt å utføre amputasjoner. Dermed er det ganske komplisert serie av trinn som vi presenterte godt begrunnet og sikrer en optimal regenerering utfall.
Vi viste at Larval sebrafisk ved 2 dpf kan avbildes opp til 1,5 dager i agarose og Tricaine løsning. Vi brukte pH-optimalisert Tricaine (pH 7) løsning forberedt med Instant Ocean salt, som ikke forstyrrer prøven helse for den present bildebehandling periode. Vi tidligere imidlertid også vist at bruk Tricaine i Danieau medium tillater time-lapse avbildning av 2,5 dpf larvesebrafisk på en konfokal mikroskop for minst 2 dager 30. Således kan optimal bufferbetingelser strekker larve helse og lengden av bildebehandling. Alternativt kan nedre Tricaine konsentrasjoner anvendes for anestesi, eller 2-fenoksyetanol, som vi har funnet er godt tolerert under larve og adulte stadier ved 28 ° C i minst 60 timer.
For å unngå feil i fin gjenfødelse, fjernet vi agarosen fra halefinnen før bildebehandling. Våre data viser at i løpet av 1,5 dager finnen har regenereres til omtrent 60%. Denne regenerering frekvens stemmer overens med en tidligere undersøkelse som avgrenser tre dagerer en gjennomsnittlig tid for halefinnen regenerering i sebrafisk larver opp til seks dpf 16. Alternative metoder til agarose kunne imidlertid bli anvendt for å montere fisk for avbildning. For eksempel propper tynn plasma 31 eller fluorert etylen-propylen (FEP) rør som er belagt med metylcellulose og fylt med svært lave konsentrasjoner av agarose (0,1%) har vært anbefalt for lys mikros ark 32, og kan være egnet for vår fremgangsmåte presentert. Imidlertid, har vi ikke anbefalt metylcellulose og 0,1% agarose, da de krever at prøven er montert i bunnen av kammeret på grunn av mangel på størkning av disse medier. Svært høye konsentrasjoner av metylcellulose vil dessuten generere luftlommer basert på vår erfaring, og disse kan påvirke bilde prosedyren. Hvis disse media er foretrukket til bruk i bunnkammeret, er det viktig at en passende arbeidsavstand mellom objektivlinsen og prøven er til stede. Det skal bemerkes at methylcellulose som en monteringsmedium anbefales kun for opp til 1 dag, da det kan forstyrre med larve helse 32.
Montering av prøven i lokket kan resultere i en langsom nedadrettet gravitasjonsdrift. Det anbefales derfor å avbilde flere seksjoner på hvert tidspunkt, som enten kan projiseres inn i en enkelt plan eller kun bilder som er i fokusplanet kan trekkes ut for å sette sammen den endelige filmen. Avbildning av prøven i bunnen kammeret kan være en alternativ metode for å unngå potensiell nedadglidning. Plasmalevringer kan være nyttig for å unngå drift, som plasma vil holde seg til det ytre omsluttende lag (EVL, periderm) 31 og derfor kan stabilisere prøven. Dette trenger imidlertid å bli testet, samt hvor lang larve sebrafisk kan opprettholdes i plasmalevringer uten å forstyrre larve helse eller fin regenerering.
Vår film ble satt sammen utnytte enkelte seksjoner (26 mikrometer)av et innspilt z-stabel, som dekket hele tykkelsen av finnen (~ 10 nm) og som utgjorde potensiell Z-drift av finnen i avbildningsprosedyren. For å beholde 3-D-informasjon, er det også mulig å projisere z-stabler i enkeltbilder. Fordi dette kan føre til uskarphet i bildet, kan lysfelt dekonvolvering være ønsket. Programvare, for eksempel dekonvolvere eller Autoquant X3 kan utnyttes for dette formål. Alternativt kan matematiske algoritmer (beskrevet i Tadrous 33) anvendes for oppnåelse av en punkt-spredning funksjon av høyt signal-til-støy-forholdet (SNR). Innhenting av en høy SNR representerer en av de store hindrene i lysfelt dekonvolvering. Selv om denne fremgangsmåten krever høy kontrast og tynne prøvetykkelse, vil det være hensiktsmessig for avbildning av halefinnen på grunn av redusert bredde.
En klar fordel med den fremlagte avbildningsmetoden er at det er raskt tilpasses til en hvilken som helst stereomikroskop utstyrt med et CCD-kamerad time-lapse programvare og tilbyr et rimelig alternativ til dyrere confocal imaging-systemer. Selv om denne metoden ikke utnytter fluorescens for celledeteksjon, kan den forlenges for slike anvendelser ved å benytte et automatisert system for lukkerkontroll og post-avbildning dekonvolvering programvare 34. Dette ville gjøre det mulig for brukere å ytterligere observere såret reparasjon og regenereringsprosesser med enkelt celle eller subcellulære oppløsning over lengre tidsperioder.
Den optiske klarhet og letthet som embryonale og larvesebrafisk kan håndteres, og tilpasning av denne metoden til noen stereo gjør den egnet for undervisning grunnleggende virveldyr biologi i et klasserom. Denne metoden kan gi studentene en bedre forståelse av de grunnleggende biologiske prosesser underliggende vev reparasjon og regenerering. Andre biologiske prosesser som har blitt fanget med en lignende metode er sebrafisk embryoutvikling 23,34 og hjertefunksjon (upublisert). Denne fremgangsmåte gir også mulighet for å overvåke såret reparasjon og regenerering i larver som er blitt genetisk manipulert og farmakologisk.
The authors have nothing to disclose.
We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense – USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.
Reagents | |||
Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500) | |||
Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100) | |||
1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690] | |||
Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store) | |||
Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140) | |||
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505) | |||
2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699) | |||
Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008) | |||
Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007) | |||
Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013) | |||
5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher) | |||
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm | |||
Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15) | |||
Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75) | |||
Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15) | |||
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal – 48" (Home Depot) | |||
DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE | |||
Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007) | |||
Fine Scissors – Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10) | |||
3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657) | |||
60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653) | |||
23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145) | |||
Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00) | |||
Equipment | |||
LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci) | |||
Zeiss Discovery.V12 compound microscope | |||
Zeiss Plan Apo S 3.5X objective | |||
Zeiss AxioCam MRm | |||
Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011) |