Protocol
Sebrafisk (Nacre stamme) ble avlet og oppvokst i henhold til etablerte protokoller. Alle forsøk ble gjort for å minimere lidelse, ved hjelp av 0,4 mm Tricaine for anestesi og 1 mM Tricaine for aktiv dødshjelp. Sebrafisk embryo og larver ble håndtert i henhold til god dyr praksis som er godkjent av den aktuelle komiteen (MDI Biological Laboratory dyr kjerne IACUC nummer 13-20). Denne studien ble godkjent av National Human Genome Research Institute Animal Care og bruk komité, MDIBL Institutional Assurance # A-3562-01 etter protokoll # 14-09.
Merk: Bilde prosedyre som fanger fin regenerering i larvesebrafisk er oppsummert i følgende trinn:
1. Heving av Sebrafisk til larvestadier
- Samle inn egg og legg ca 50 egg i en 100 x 25 mm petriskål som inneholder 0,03% Instant Ocean salt i avionisert vann supplert med 0,00004% metylenblått. Ruge O / N i en 28.5 ° C inkubator. <li> Neste morgen fjerne de døde fostre med et glass pipette og skyll eggene i en sil med 0,03% Instant Ocean salt i avionisert vann (kalt embryo medium).
- sup> Legg til frisk embryo medium til parabolen. Ved hjelp av pigmenterte stammer, eventuelt legge 0,2 mM 1-fenyl-2-tiourea (PTU), som PTU vil hindre melanogenese og dermed pigmentering av larvene. La embryoene videreutvikle i inkubatoren inntil to dager etter befruktning, eller en hvilken som helst annen ønsket larvestadiet.
Merk: Medium som Ringers 18, Hanks 18, E2 19 E3 20 og Danieau 21 være foretrukket.
2. Utarbeidelse av Imaging Chamber
- Metode 1: Imaging kamre laget av PVC eller Teflon rør (figur 1)
Merk: Denne metoden er lik Concha og Adams (1998) 22.- Erverve drikkevann grade plast eller Teflon slange fra en jernvarehandel med en 25 mm ytre enda 20 mm indre diameter. Kutte røret for å gjøre ringer av omtrent 10 mm tykkelse med en jevn overflate på begge sider. Bruk> 200 sandpapir for å jevne ut kantene.
- Rengjør ringer med varmt vann og 70% etanol og la dem lufttørke.
- Med en pipette, påfør silikonfett til halvparten av en ring og fest ringen til en 75 mm x 25 mm glassdekselstrimmel. Alternativt kan du bruke en 3 ml sprøyte fylt med silikonfett i stedet for en pipette.
Merk: Fordi det er vanskelig å sette silikonfett inn i 3 ml sprøyte, tilsett silikonfett på en 30 ml sprøyte først og bruker dette for å fylle 3 ml sprøyte.
- Metode 2: Fremstilling av en petriskål som et avbildningskammeret.
- Erverve 35 eller 60 mm diameter Petri-skåler med et dekkglass festet til lokket (figur 2A). Alternativt, som vist i figur 3 av Distel & Koester (2007) 23, bore en åpning som er liten nok til å hgammel en dekkglass i lokket på en liten petriskål og bruke silikonfett på utsiden med en 3 ml sprøyte. Ved hjelp av en ren pipette, feste en rund eller firkantet dekk av ønsket tykkelse på utsiden (figur 2B) nøye.
- For å sikre at agarose som benyttes for montering forblir fast festet i avbildningsprosedyren, feste en fin plastnett inne i ringen. Først skjæres mesh laget av vindusskjerm oppnådd fra en jernvarehandelen, i størrelsen av den indre ringdiameter ved hjelp av fin saks med en vinkel. Deretter skjæres et lite rektangel> to ganger størrelsen av larven inn i midten av nettet (figur 1, 2).
- Anvende fire små punkter av ikke-toksiske silikonfett på grenseflaten mellom dekkglass og kammerringen (figur 1A).
- Bruk tang for å feste maske fast til bunnen av glass dekkglass.
3. Montering og Imaging av Pre-injfigurert Larva (Dette trinnet er valgfritt)
Merk: Dette trinnet er egnet for sammenligninger mellom den amputerte og regenerert fin lengde, som amputasjon flyet etter fin regenerering er ikke gjenkjennelig i sebrafisk larver.
- Forberede en 0,5 til 1,2% lavt smelte agarose løsning i embryo medium for immobilisering av prøven.
- Varm agarose i en mikrobølgeovn og overføre det flytende agarose i 1,5 ml rør som er forvarmet til 42 ° C i en varmeblokk.
- La varm agarose avkjøles til 42 ° C, som kan opprettholdes i flere uker ved denne temperatur. Prøv å unngå å pipettere larvene inn agarose over 42 ° C, da dette vil være skadelig for dyrene.
- Bedøve flere larver ved hjelp av 10 ml av 0,4 mM Tricaine (pH 7) i embryo medium i en 60 mm diameter petriskål. Klargjør Tricaine henhold til sebrafisk Bestill Oppskrifter 18.
- Alternativt kan bruke 10 ml av en 1: 1000 fortynning av 99% 2-fenoksyetanol i en 60 mm diameter petriskål. Poke larvene med en avkortet microloader pipette for å vurdere deres touch respons før du fortsetter. Bruk kun ikke-responsive larver.
- Overfør en larve i den 42 ° C agarose løsning ved anvendelse av en glass Pasteur-pipette. Ikke overføre dreven væske inn i agarose, ellers agarose blir også fortynnet og ikke stivner.
- Kast den gjenværende væske fra pipette og overføre larven med en dråpe av agarose i en liten petriskål (35 eller 60 mm diameter). Plasser larve på sin side for avbildning av halefinnen.
- Tillat agarose å stivne. Vurdere agarose med en plast pipette tips; spissen vil senke det i agarosen hvis den er for flytende. Når agarosen har størknet, vil en liten innrykk være synlig ved å berøre med en pipette. Etter størkning, legge Tricaine løsning og gå videre til stereo som skal brukes senere for time-lapse bildebehandling.
- Bruk en stereomikroskop med time-lapse programvare. Velg et passende objektiv og forstørrelse, som vil bli brukt senere for time-lapse bildebehandling. Her bruker en 3,5 x, 16 mm arbeidsavstand objektiv på et stereomikroskop. Som ønsket, utnytte alternative mikroskoper og objektiv, men velger en skikkelig forstørrelse å gjøre rede for potensiell xy-drift og vekst av finnen under bildebehandling prosedyren.
- Velg kameradeteksjon modus på mikroskopet.
- I programvaren velger du "live" modus, for å vise larven på skjermen.
- Åpne 'Properties' vinduet for å automatisk registrere lysstyrken.
- Justere kontrasten på mikroskop trans-belysning basen manuelt.
- Flytt larven ut av synsfeltet og velg Shading Correction-funksjonen for å minimere bakgrunns neiise.
- Plasser larve tilbake i synsfeltet og ta et øyeblikksbilde. Lagre bildet.
- Ta av agarose fra larven ved først å skrape agarosen av hodet. Denne måten larven kan gled ut av agarose ved å trekke forsiktig hodet vekk fra den gjenværende agarose med en avkortet microloader pipette tips eller et insekt pin.
- Med et glass Pasteur pipette overføre larven til frisk Tricaine løsning.
4. Amputasjon analysen
- Forberede en 1,5% agarose løsning med embryo medium og hell et tynt lag i en petriskål. La agarose stivne.
- Under en stereomikroskop, plasserer larven sideveis på størknet agarose og amputere halefinnen med en 23 G sprøyte nål med et lett trykk (figur 3A).
5. Montering av Larva for Time-lapse Imaging
- Fortsett som beskrevet i trinn 3.1 til 3.5 (Figur 3B).
- For å sikre tilstrekkelig sårtilheling eller vev regenerering å skje, forsiktig skrape av agarose rundt distal halefinnen ved hjelp av en avkortet microloader pipette eller et insekt pin. Prøv å ikke skade finnen flere ganger (Figur 3C).
- Dekanter Tricaine oppløsning inneholdende det fjernede agarose og fylle kammeret ring med frisk Tricaine løsning.
- Påfør silikonfett til toppen av kammeret ring og fest en 75 mm x 25 mm glass lysbilde. Prøv å unngå luftlommer i kammeret, som de vil forstyrre lysfelt bildebehandling og desiccate larven over tid.
- Hvis du bruker en petriskål somen avbildning kammer, gjelder silikonfett på den øvre kant av bunnkammeret og fyller den nederste kammer med Tricaine løsning. Decant nøye Tricaine løsning i lokket og vri lokket over til fordype larven inn i Tricaine løsning av bunnkammeret i en liten vinkel for å unngå luftlommer. Kammeret blir forseglet på grunn av silikonfett.
6. Time-lapse Imaging
- Montere et oppvarmet inkubasjon kammer som beskrevet i 23,24 (figur 4) .Sett inkubasjonstiden kammeret rundt mikroskopet og slå på varmen. Juster temperaturen til 28 ° C i ca 10 - 20 minutter eller inntil temperaturen har stabilisert seg.
- Åpne fronten av den oppvarmede inkubering kammeret og plassere avbildningskammeret på mikroskopstativet med dekkglasset vender oppover mot målet.
- Plasser larvefinnen på en måte at 2/3 av synsfeltet forblir ledig. Dette sørger for fangst avvekst og regenerering av finnen i løpet av bilde prosedyre uten å måtte omplassere larven.
- Juster montert larve til 28 ° C i ~ 30 min før start av intervallopptak for å unngå endringer i lysfelt intensitet eller potensielle skift av agarose. Alternativt bruke forvarmet buffer for å starte bilde etter kortere tid justering.
- Slik setter du opp intervallopptak, åpner 6D flerdimensjonale Acquisition vindu i Axiovision programvare og velger z-stack og time-lapse alternativet.
- Valgfritt) I kategorien z-stack og Slice Mode, velg skive tykkelse og velg Start / Stopp-modus da.
- Definerer den øvre og nedre stilling i stabelen.
- I kategorien time-lapse, velge intervallet og varigheten av filmen og deretter starte filmen ved å trykke på startknappen. Vi har funnet at 30 minutters intervaller er tilstrekkelig, og dette intervallet ikke genererer dreven data; men shorter intervaller kan brukes.
- Sjekk posisjons- og z-stack dimensjoner i løpet av den første timen dersom larven ikke var forhåndsjustert. Om nødvendig omplassere larve igjen etter en dag, som larven kan ha forskjøvet.
- Lagre filen på slutten av intervallopptak og fortsette med etterbehandling og kvantifisering ved hjelp av tilgjengelig programvare for bildeanalyse, for eksempel Imaris 25 eller åpen kildekode programvarepakker Bilde J 26 og Fiji 27.
7. Data Analysis
- Bestemme fin lengde.
- Åpne time-lapse film i bildebehandlingsprogrammer og lagre filene i den proprietære filformat for å forbedre programvare ytelse.
- Velg den ortogonale visningen for å vise individuelle seksjoner som projiserte stabler. For korreksjon av drifting, under Fiji-menyen, velg Plugins, deretter Registrering, og 'Korrekt 3D-drift ". Dette vil åpne et Fiji vindu og utføre drift korreksjoner. Riktigrotasjons drift i Imaris Spots funksjon. Alternativt installere StackReg og TurboReg plugins i bilde J og importere til Fiji. Velg ønsket transformasjon algoritmen i StackReg plugin.
- Å måle avstander (f.eks sår diameter eller fin lengde), velg "Legg til nye målepunkter 'alternativet i øvre venstre verktøylinjen.
- Under "Konfigurer listen over synlige Statistikk Verdier" i nedre venstre menyen, velg statistikk verdier som skal vises.
- I "linjemodus" under fanen innstillinger velge 'Pairs (AB, CD ...)'.
- I "Etiketter Properties 'velger' Navn 'og' Avstand", for å vise avstanden mellom punktene A og B ved siden av målelinjen.
- Bytte til "Rediger" modus og hold nede shift-knappen for å velge det første punktet på slutten av ryggstreng. Deretter bruker samme konfigurasjon for å velge det andre punktet på distal fin margin.
- Under Statistikk-fanen, velg disken knappen (Export All) nederst til høyre for å vise og eksportere avstand i bildet.
- Gjenta målinger på utvalgte tider ved å flytte glidebryteren under bildet til høyre. I stedet for å lage nye målepunkter, kan de forrige flyttes ved først å velge punkt med venstre museknapp, deretter samtidig trykke shift og venstre museknapp på den nye posisjonen.
- Alternativt til målepunktene alternativet, utnytte skive betrakteren til å måle avstander. I stykket view-modus, bla til ønsket posisjon og klikk på den første og andre posisjon med venstre museknapp. Avstanden vil bli vist. Dette alternativet er imidlertid ikke tillater eksport av data.
- Bestemme fin lengde og areal i ImageJ.
- Åpne time-lapse film i ImageJ ved hjelp av en plugin som gjenkjenner .zvi filformat. Alternativt, legger i en QuickTime fil eller tiff sekvens.
Merk: Hvis du bruker en ukomprimert tiff-fil format, gjør bildet dimensjoner ikke må spesifiseres. - Hvis du åpner et annet filformat uten filinformasjonen, velg "Sett Scale" under "Analyser" menyen for å først definere bilde avstand og enhet. I "Sett Scale meny", skriv inn "Avstand i piksler ', under type i' kjent avstand 'for pikselverdien (dette kan oppnås ved å måle antall piksler på en skala bar som ble lagt til bildet Klikk deretter Mål for å få resultatet), og "Enhet for avstand (typisk mikrometer). Klikk deretter på OK.
- For finn målinger området velg "Freehand Selection" verktøy på verktøylinjen og skissere fin området ved å holde venstre museknapp nede mens du tegner langs omrisset av finnen. For finnelengdemålinger, velg "Straight" linje verktøy og trekke en linje mellom de ønskede punkter for å væremålt.
- Klikk på "Measure 'alternativ under" Analyser "for å vise området og lengden på finnen. Gjenta dette trinnet så ofte som nødvendig for flere tidspunkter av filmen.
- Åpne time-lapse film i ImageJ ved hjelp av en plugin som gjenkjenner .zvi filformat. Alternativt, legger i en QuickTime fil eller tiff sekvens.
- Ved hjelp av statistikk programvare kan dataene grafisk.
Representative Results
Den presenterte teknikk er egnet til å belyse vevsreparasjon dynamikken i respons til amputasjon. Filmen viser at amputasjon av finnen innledningsvis utløser en pung-streng effekt, karakterisert ved kontraksjoner via aktin-myosin kabler som er tilstede i den fin-fold 28 (figur 5 A, B). Samtidig, blir cellene ekstrudert fra såret (se film). Sammentrekning kan således være et middel for å utvise celler som er sannsynlig bestemt til å gjennomgå celledød. Våre resultater viser videre at utviklings vekst av larven oppstår uavhengig av regenerering (film), mens finnen regenerering ikke starte før om 14 timer etter amputasjon målt ved fin lengde og området over tid løpet av 36 timer etter amputasjon (figur 5C , D). Den totale regenerative finne vekst etter 1,5 dager, var omtrent 60% av den opprinnelige finnelengden (figur 5E). Samlet utgjør disse resultatene viser at amputasjon tr iggers finne sammentrekning, ekstrudering av celler fra såret, og en tidsmessig forsinket regenerativ respons. Mens ekstruderte celler er sannsynlig dømt til å gjennomgå celledød, må innholdet i disse cellene til å bli ytterligere avklart.
Figur 1. Imaging kammer ring montering
(A) vist en plastring som er festet til et dekkglass med silikonfett. En plastduker er festet til innsiden av kammeret med fire små punkter av silikonfett. (B) Et kammer inneholdende det montert larven er fylt med Tricaine løsning og en glassplate er festet til toppen. (C) En montert to dager gammel larve (pil) er vist ved høyere forstørrelse for å fremstille dens størrelse i forhold til nettingen."_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Imaging kammer montering laget av petriskåler. (A) Vist er en kommersiell glass topp glassbunn petriskål med en plast netting festet til glass dekkglass. (B) Det er vist en selv konstruert petriskål kammer med et boret hull i lokket, og et dekkglass festet fra utsiden med silikonfett. Mesh og larven er montert inne i kammeret inneholder Tricaine løsning. Å forsegle kammeret, er silikonfett brukes på øvre, ytre kanten av bunnen kammer og topplokket vedlagt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Scheme av amputasjon og montering av en larve for bildebehandling. (A) For amputasjon, plassere en bedøvet larve på en agarose-belagt petriskål og amputere halefinnen med en sprøyte nål. (B) For montering, overføre larven med en overføring pipette i en 1,5 ml rør fylt med 42 ° C væske agarose og pipette en dråpe som inneholder larven inn bildekammeret, orientere fisk og dekke størknet agarose med embryo medium. (C) Skrap av agarosen fra halefinnen ved hjelp av en avkortet microloader pipette eller lignende verktøy og erstatte embryo medium med frisk medium. (D) Bilde halefinnen under en stereomikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Self-bygget oppvarmet inkubasjon kammeret. (AC) Vist er et oppvarmet inkubasjon kammer laget av papp, bobleplast og borrelås. Et kablet kuppel varmeapparat (opprinnelig utviklet for kylling egg inkubasjon) er festet til kammeret ved hjelp av aluminiumstape. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Fin regenerering dynamikk. (A) Reaksjonsskjema for den benyttede halefinnen amputasjon analyse og kvantifisering metode for å bestemme den finnelengden (rød pil) og området (rød kontur av finnen). (B) halefinnen amputasjon utgangspunktet utløser sammentrekning av finnen, etterfulgt av Regenerative vev utvekst. Finnen gjennomgår også utviklings vekst, noe som gjenspeiles av den laterale størrelse økning. (C) Det er vist at finnelengden som en funksjon av tid, og viser en lineær regenerativ veksten starter på ~ 14 HPA. (D) Kvantifisering av finnen området avslører en innledningsvis avta i størrelse, noe som kan tilbakeføres til den sammentrekning av finnen. Etter ~ 14 timer, finn størrelsen øker på en lineær hastighet. (E) Sammenligning av fin lengde før amputasjon og etter 36 timers viser ~ 60% gjenvekst. Skala bar: 100 mikrometer Forkortelser: pre-amp, pre-amputasjon; timer etter amputasjon, hpa; regen, gjenfødelse; amp, amputasjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film . Fin regenerering over tid løpet av 36h. Det er vist en halefinne av en 2,5-dag gamle larver i løpet av regenereringen. Starter 30 min etter amputasjon regenerativ vekst avbildes i 30 min intervaller på en stereo å bruke en 3,5x objektiv.
Discussion
Den presenterte metoden gjør for å observere sårheling og regenerering av vev i levende sebrafisk larver med in vivo time-lapse bildebehandling på en lysfelt stereomikroskop, ved hjelp av et relativt enkelt oppsett. Denne fremgangsmåten krever visse viktige aspekter som vi har testet, noe som vil optimalisere resultatet: 1) Lave agarose konsentrasjoner (~ 0,5%) vil redusere vekst hindringer av stadig voksende larvesebrafisk, 2) Fjerning av agarose rundt finnen er viktig ikke å skjule helbredelsesprosessen, 3) Overlapping agarose i en plast mesh beholder agarose og dyr i en stabil posisjon under hele prosedyren, og 4) passende temperatur-kontrollert miljø, noe som er viktig for larve levedyktighet. Vi har tilpasset en oppvarmet inkubasjon kammer 23,24, som benytter bobleplast som er tapet på papp, og et kablet kuppel varmeapparat å kontrollere temperaturen og luftsirkulasjon med minimale svingninger i løpet avbildebehandling prosedyre. Denne enkle og kostnadseffektive kammer kan være forberedt på å passe enhver mikroskop. En tilsvarende oppvarmet inkubasjon kammeret er også benyttet for avbildnings mus og kylling utvikling 24,29.
Vi foreslår at pre-amputert larver er montert for en pre-amputasjon image, demonteres for amputasjon, og spent for time-lapse bildebehandling. Selv om det er mulig å utføre fremgangsmåten i et enkelt trinn i den endelige avbildning kammeret, etter vår erfaring har vi funnet at amputating halefinnen på et dekkglass er ikke optimal, da den river vevet og ikke resulterer i et rent snitt. Agarosen baserte amputasjon metode ved hjelp av en sprøyte nål ble opprinnelig beskrevet av Kawakami og kolleger (2004) 16 og er også, i vår erfaring, ideelt å utføre amputasjoner. Dermed er det ganske komplisert serie av trinn som vi presenterte godt begrunnet og sikrer en optimal regenerering utfall.
Vi viste at Larval sebrafisk ved 2 dpf kan avbildes opp til 1,5 dager i agarose og Tricaine løsning. Vi brukte pH-optimalisert Tricaine (pH 7) løsning forberedt med Instant Ocean salt, som ikke forstyrrer prøven helse for den present bildebehandling periode. Vi tidligere imidlertid også vist at bruk Tricaine i Danieau medium tillater time-lapse avbildning av 2,5 dpf larvesebrafisk på en konfokal mikroskop for minst 2 dager 30. Således kan optimal bufferbetingelser strekker larve helse og lengden av bildebehandling. Alternativt kan nedre Tricaine konsentrasjoner anvendes for anestesi, eller 2-fenoksyetanol, som vi har funnet er godt tolerert under larve og adulte stadier ved 28 ° C i minst 60 timer.
For å unngå feil i fin gjenfødelse, fjernet vi agarosen fra halefinnen før bildebehandling. Våre data viser at i løpet av 1,5 dager finnen har regenereres til omtrent 60%. Denne regenerering frekvens stemmer overens med en tidligere undersøkelse som avgrenser tre dagerer en gjennomsnittlig tid for halefinnen regenerering i sebrafisk larver opp til seks dpf 16. Alternative metoder til agarose kunne imidlertid bli anvendt for å montere fisk for avbildning. For eksempel propper tynn plasma 31 eller fluorert etylen-propylen (FEP) rør som er belagt med metylcellulose og fylt med svært lave konsentrasjoner av agarose (0,1%) har vært anbefalt for lys mikros ark 32, og kan være egnet for vår fremgangsmåte presentert. Imidlertid, har vi ikke anbefalt metylcellulose og 0,1% agarose, da de krever at prøven er montert i bunnen av kammeret på grunn av mangel på størkning av disse medier. Svært høye konsentrasjoner av metylcellulose vil dessuten generere luftlommer basert på vår erfaring, og disse kan påvirke bilde prosedyren. Hvis disse media er foretrukket til bruk i bunnkammeret, er det viktig at en passende arbeidsavstand mellom objektivlinsen og prøven er til stede. Det skal bemerkes at methylcellulose som en monteringsmedium anbefales kun for opp til 1 dag, da det kan forstyrre med larve helse 32.
Montering av prøven i lokket kan resultere i en langsom nedadrettet gravitasjonsdrift. Det anbefales derfor å avbilde flere seksjoner på hvert tidspunkt, som enten kan projiseres inn i en enkelt plan eller kun bilder som er i fokusplanet kan trekkes ut for å sette sammen den endelige filmen. Avbildning av prøven i bunnen kammeret kan være en alternativ metode for å unngå potensiell nedadglidning. Plasmalevringer kan være nyttig for å unngå drift, som plasma vil holde seg til det ytre omsluttende lag (EVL, periderm) 31 og derfor kan stabilisere prøven. Dette trenger imidlertid å bli testet, samt hvor lang larve sebrafisk kan opprettholdes i plasmalevringer uten å forstyrre larve helse eller fin regenerering.
Vår film ble satt sammen utnytte enkelte seksjoner (26 mikrometer)av et innspilt z-stabel, som dekket hele tykkelsen av finnen (~ 10 nm) og som utgjorde potensiell Z-drift av finnen i avbildningsprosedyren. For å beholde 3-D-informasjon, er det også mulig å projisere z-stabler i enkeltbilder. Fordi dette kan føre til uskarphet i bildet, kan lysfelt dekonvolvering være ønsket. Programvare, for eksempel dekonvolvere eller Autoquant X3 kan utnyttes for dette formål. Alternativt kan matematiske algoritmer (beskrevet i Tadrous 33) anvendes for oppnåelse av en punkt-spredning funksjon av høyt signal-til-støy-forholdet (SNR). Innhenting av en høy SNR representerer en av de store hindrene i lysfelt dekonvolvering. Selv om denne fremgangsmåten krever høy kontrast og tynne prøvetykkelse, vil det være hensiktsmessig for avbildning av halefinnen på grunn av redusert bredde.
En klar fordel med den fremlagte avbildningsmetoden er at det er raskt tilpasses til en hvilken som helst stereomikroskop utstyrt med et CCD-kamerad time-lapse programvare og tilbyr et rimelig alternativ til dyrere confocal imaging-systemer. Selv om denne metoden ikke utnytter fluorescens for celledeteksjon, kan den forlenges for slike anvendelser ved å benytte et automatisert system for lukkerkontroll og post-avbildning dekonvolvering programvare 34. Dette ville gjøre det mulig for brukere å ytterligere observere såret reparasjon og regenereringsprosesser med enkelt celle eller subcellulære oppløsning over lengre tidsperioder.
Den optiske klarhet og letthet som embryonale og larvesebrafisk kan håndteres, og tilpasning av denne metoden til noen stereo gjør den egnet for undervisning grunnleggende virveldyr biologi i et klasserom. Denne metoden kan gi studentene en bedre forståelse av de grunnleggende biologiske prosesser underliggende vev reparasjon og regenerering. Andre biologiske prosesser som har blitt fanget med en lignende metode er sebrafisk embryoutvikling 23,34 og hjertefunksjon (upublisert). Denne fremgangsmåte gir også mulighet for å overvåke såret reparasjon og regenerering i larver som er blitt genetisk manipulert og farmakologisk.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bullseye Agarose | MidSci | BE-GCA500 | |
| Low-melt agarose | Fisher BioReagents | BP1360-100 | |
| 1-phenyl-2-thiourea | Alfa Aesar | L06690 | |
| Instant Ocean Aquarium Salt | Pet store | ||
| Methylene Blue (0.1% solution) | Sigma | M9140 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10505 | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77699 | |
| Petri Dish 35 x 15 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri Dish 60 x 15 mm | BD Falcon | 351007 | |
| Petri Dish 100 x 25 mm | BD Falcon | 351013 | |
| 5.75 inch boroschillate glass pipets | Fisher | ||
| 35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (Glass: 0.085-0.115mm) | MatTek Corporation | D35-20-0-TOP | |
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Glass coverslips | Electron Microscopy Services | 72191-75 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments | CS-18R15 | |
| Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48" | Home Depot | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microloader pipette tips 20 µl | Eppendorf | 930001007 | |
| Fine Scissors - Sharply Angled Up | Fine Science Tools | 14037-10 | |
| 3 ml Luer-Lok™ disposable syringe | BD | 309657 | |
| 60 ml Luer-Lok™ disposable syringe | BD | 309653 | |
| 23 G syringe needles | BD | 305145 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Equipment | |||
| LabDoctor Mini Dry Bath | MidSci | ||
| Discovery.V12 compound microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo S 3.5X objective | Zeiss | ||
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011) | Zeiss | ||
References
- San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115 (2007).
- Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A.
- Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
- Slack, J. M.
- Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
- Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
- Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
- Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
- Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
- Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
- Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
- Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).
- Dahm, N. -V. a Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , reprint, Oxford University Press. 303 (2002).
- The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).
- Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766 (2012).
- Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
- Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).
