Protocol
Larva hazırlanması 1.
- , Hareket ya da pozisyon tercihi için istenen larva analiz standart sinek gıda 11 kullanılarak 10 tahlil istenen yaşa standart koşullar altında larvaları büyümek için.
- Serigrafi dereceli naylon bir huni üzerinde örgü gererek bir örgü filtre yapın. Lastik bant ile huni boyun örgü sabitleyin. Bir beher huni yerleştirin.
- Analiz için larva toplamak için, bir spatula dolu kültür şişesinden kazarak larvaları içeren gıda kepçe ve bir fırça 10 örgü doğrudan bireysel larva toplama, örgü filtre üzerinde RT musluk suyu ile yıkayın.
Analiz tüpleri, 2. Hazırlık
- Tahlil tüpleri fiş hazırlamak için, dikkatle% 4 agar jel kaynatın ve 1.5 cm derinliğinde bir petri içine dökün. Hayvan kapalı olduğunda bu tüpün her iki tarafı için bir fiş sağlayacaktır. % 4 çözeltisi p larvaları önlemek için yeterince yoğundurtapaları enetrating.
- Tüpler temiz ve larva yerleştirilmesi açık önce olduğundan emin olun. Değilse, bu kaydedilen olmaktan hareketleri engelleyebilir.
- Larvalar hareketi için yeterli neme sahip olmak için, sıcak su, küçük bir miktar ihtiva eden bir sıkıştırma şişesi hazırlayın. Dikkatli bir lavabo doğru prizi yönlendirmek, şişe ters çevirin ve pikap tüp su çıkarmak için hafifçe sıkın.
- Tahlil tüpüne şişe çıkışını yerleştirin. Yoğunlaşma ince bir tabaka tüpün duvarında görünene kadar tahlil tüpüne su buharı sunmak için şişeyi sıkın. Video 1 nem uygun bir miktarda olan bir tüp içinde hareket eden bir larva göstermektedir.
- Tüp içinde larva mühür için, bir petri 1,5 cm kalınlığında agar jel kaldırmak ve agar tapa tüp içine sokulabilir, böylece agar altındaki hava akışı sağlamak için bir ağ yüzeyi üzerine yerleştirin. Bir ucuna jel iki fiş eklemek için iki kez jel içine deney tüpünün bir ucu basın.
- Bir paintb ileacele yaklaşık 1,5 inç derin tüp içine bir larva yerleştirin ve agar jel içine larva yakın ucu basarak tüp mühür. Ortaya çıkan basınç karşısında ucundan agar jeli ikinci fişini zorla ve tüp içinde hayvan mühür olacaktır.
- Yer MB5 Çok Işın Drosophila Activity Monitor (DAM) cihazdaki tüpler ve hayvanların sensörlerin aralığının ötesinde hareket edemez, böylece tüpleri konumlarını ayarlayın.
- Tüpler taşıma sırasında cihazın kızılötesi okuma çerçevesinin dışına kaydırarak olmadığını tahlil sağlamak için, her bir tüp temas kayıt cihazı etrafında macun bir halka sıkarak yerinde tüp tutun.
3. Ölçme Etkinliği
- Bir kuluçka Kayıt aktivite nedeniyle gölgeler, floresan ışıkları veya laboratuarda sıcaklık değişimlerine oluşabilecek yanlış okumaları önlemek için. Sistemin önerilen bir düzenleme için Şekil 5'e bakınız.
- 20 ° C (Şekil 1) bir inkübatör ayarlayın. , Kayıt sırasında nedeniyle akkor ışık kaynaklarından gelen parazit yanlış kayıtları önlemek floresan inkübatör ışıkları kapatmak ve inkübatör kaydederken, ayrı bir LED ışık kaynağı kullanın. Anormal sensörleri tetikler olmadığını ışık koşulları sağlamak için herhangi bir hayvanlarda olmayan bir deneme yapın. Bu testten sonra hiçbir kayıtlı hareketi verileri olmalıdır.
- Larva deneyi başlatmak için önce 5 dakika için 20 ° C inkübatör ayarlarına gelmesini izin verir.
- İstediğiniz kayıt aralıkları (örneğin, 1 dakika) BARAJI Sistemi ayarlamak için, DAM sistemi kayıt yazılımı bilgisayar 12 barındırmak ve PSIU arayüzüne kayıt odasına bağlanmadan önce BARAJI Sistem dosyayı açmak için indirilen olduğundan emin olun.
- Daha sonra veri kaydedileceği istenilen kayıt frekansı seçin tercihlerini ayarlamak ve farklı zaman dilimlerini seçmek için yukarıdaki veya okuma aralığı seçeneği aşağıdaki linke tıklayınız hangi verilersaklanacaktır. Örneğin, 1 saat 1 sn den aralık kez okuma seçin.
- , Veri kayıt için değişen parametreyi seçin tercihleri seçin ve çıkış veri türü altında gelen kutularını seçmek için (sayar, hamle, pozisyonları ve bekleme, bakınız Tablo 1). Her parametre tüpü içinde larva faaliyet eşsiz bir analizini sağlar.
- Kayda başlamak CAB6 telefon kablosunu kullanarak Güç Kaynağı Arabirim Ünitesi (PSIU) monitörü bağlamak için. Bir elektrik prizine bağlayın PSIU. Yeşil ışık uygun bağlantıyı gösterir.
- Veri kayıt için Macintosh veya Windows PC için Universal Serial Bus (USB) kablosu aracılığıyla PSIU bağlayın. Otomatik veri kaydını başlatmak için bilgisayarda BARAJI SystemMB1v6x programını açın.
- İstenilen toplama süresi tamamlandıktan sonra, Quit seçin ve ardından DAM etkinlik ekranda şimdi çıkın; Bu veriler daha sonra otomatik olarak DAM Sistemi Verileri altında kaydedilir. Bu veri dosyası alın (örn: 1 monitör) ve sürükle ayrı bir klasör içine. Daha sonra işlenebilir, böylece bu DAM yazılımı ham verileri saklamak olacaktır.
İşleme Veri Hazırlama 4. (DAM FileScan)
- Anlaşılabilir bir biçime ham verileri işlemek için DAM FileScan uygulamasını açın ve Select Input Veri Klasörü seçin. Sonra veri klasörü ve istediğiniz dosyayı seçin ve tarama seçeneği seçin. Son olarak istenen okuma dönemine bin uzunluğunu seçin. Bu operatör tarafından ayarlanan parametrelere ham verileri düzenlemek ve program söz konusu aralıkta toplanan verileri rapor edecektir.
- (Monitör sayısı, hamle, bekleme) istenen hareket ayarını analiz etmek için çıkış veri türünü seçin. İlave okumalar menüsü altında kutusu içine seçin toplamı (bu bin uzunluğu seçilen sistem okuma aralığından daha büyüktür ise).
- Uygun Dosyayı adlandırın ve kaydedin. Dosya aşama 3.9 klasörü ile aynı yerde saklanır.
- Önceden kaydedilmiş dosyayı (adım 4.3) açın, ortalama hamle süreci bir elektronik tablo programı bir tablo oluşturmak için 4. adımdan elde edilen ham veriler toplamak ve metin ithalat sihirbazı penceresi göründüğünde, seçeneğini bitirmek açmak için Bir çizelge formatında veri dosyaları.
Not: analiz veri türüne bağlı olarak, elektronik tablo farklı okunacaktır. Her okuma tüpü belirlenmiş bir mektup alacaksınız Tipik olarak, çalışmanın süresi sayısal kaydedilecektir monitör hamle veya sayıları ölçmek için. Elektronik tablodaki verileri görüntülerken, sütunlar tahlil tüpleri 1-16 sırasıyla yuvaları temsil kz. satırlar Toplanan veriler noktalarını temsil eder. - Hareket 1 dakika aralıklarla 20 dakika boyunca toplanmış, örneğin, hareket / dakika ve diğer ölçümlerin ortalama sayısını hesaplamak için 20 satır ortalama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, yedi farklı sıcaklıklarda larva hareketin farklılıkları tespit etmek için izleme cihazı kullanılarak, 1.118 w kontrol üçüncü instar larvaları bir sıcaklık yanıtı çalışmasında, elde edilen sonuçları gösterir. Larvalar yıkandı ve yukarıda tarif edildiği gibi DAM aktivitesi cihazı içerisine yerleştirilmiş ve istenen sıcaklığa ayarlanmış bir inkübatör içine yerleştirildi. Kayıt başlamadan önce Cihaz daha sonra 5 dakika boyunca ortama alışmaları sağlandı. Her bir larvaya ayrı ayrı 20 dakikalık bir süre boyunca hareket yeteneği ve dakikada hareket ortalama sayısı açısından analiz edildi, her bir hayvan için hesaplandı ve 32 her hayvan grubu için ortalaması alındı. Veriler analiz ve bir elektronik tablo programı kullanılarak grafikle edildi. Sıcaklık 20 ° C 'de, bu eğilim arası ve 25 ° C haricinde, 5 derecelik artışlarla 5-35 ° C arasında uygun bir biçimde yükseltilecektir larvaların anlamlı artan aktivite göstermiştir.
Farklılıklar cou doğrulamak içinld bir kontrol ve daha önce hipoaktif, inaktif larvaları (IAV 1) olarak tanımlanan bir mutant test edildi arasına tespit edilebilir. Veriler 32 hayvanların her biri için hareket / dakika gibi analiz edilmiş ve ortalama daha sonra hesaplandı. Şekil 2'de görüldüğü gibi, analiz inaktif larvaları, bir kontrole göre önemli ölçüde daha az mobil olduğunu göstermektedir. Üçüncü instar larvaları daha küçük olmakla birlikte 20 dakika deneyin her dakika içinde, üçüncü evre larvaların Şekil 3. Aktivite gösterildiği gibi, birinci ve ikinci instar larvaları aktivitesi süresi boyunca nispeten tutarlı kalmasını gösterilmiştir, aynı zamanda ölçülebilir idi ( Şekil 4).
1118 larva lokomosyon w Şekil 1. 5 ° C arasında değişen sıcaklıklarda kaydedildi -. 35 ° C Each sütun kümesi arasında ortalama dakikada bireysel hamle ile 32 Üçüncü dönem hayvanların ortalama hareketini temsil eder. * Tüm ortalamalar 10 ° C dışındaki birbirinden önemli ölçüde farklı ve 15 ° C (p = 0.116) (Farklı harfler anlamlı bir fark, Student t-testi gösterir).
Önemli ölçüde daha az hareketlilik kontrole göre 20 ° C. IAV 1 larva sergi inaktif (IAV 1) larva ile karşılaştırıldığında Şekil 2. Üçüncü evre kontrol larvaları.
Şekil, her larva aşamasında, 20 ° C. N = 32 20 dakika kayıt aralığı boyunca birinci, ikinci ve üçüncü instar larvaları aktivitesinin 3. Ölçüm.
20 dakika kayıt aralığında her dakika içinde meydana gelen hareket ortalama sayısını gösteren Şekil 4. Histogram. 32 üçüncü instar larvaları, 20 ° C'de tahlil edildi. Kırmızı çizgi dakikada hamle sayısı tüm 20 dakika aralığı için ortalama temsil eder.
PSIU arayüzü ünitesi ve bir masaüstü bilgisayara Drosophila Activity Monitor set-up ve bağlantı gösteren Şekil 5. diyagramı. Inkübatör içinde tasvir, ancak kuluçka kayıt kapatmaya olmaktır sırasında edilmektedir.
| Tanım | Parametre |
| Kayıtlar veriler her zamanBir larva bir ışın haçlar ve ek sayıları kaydedilir larva hareket ederse, tek bir kiriş içinde iken. | Sayımlar |
| Bir sinek ayrı kirişler arasında konumlandırır zaman kayıtlar verileri sadece, bir kirişin içinde hareket yazmaz. | Hamle |
| Bir kayıt aralığı boyunca her saniye de hayvanların konumunu kaydeder. Bu veriler, bir deneyin boyunca her bir sensörün harcanan zamanın bir fonksiyonu olarak konum tercihi göstermektedir. | Yaşamak |
| Bu ayar, hayvan hareketi sırasında tetikliyor sensörü hangi belirten tüp içinde hayvanın genel pozisyonunu analiz eder. | Pozisyon |
| Bu ayar, bir dizi zaman diliminde toplanan veriler masaüstü bilgisayara kaydedilir frekansı belirler. | Kayıt Aralığı |
Ölçme işlemi Tablo 1. Açıklamasırement parametreler (sayar, Moves, Durmak ve Pozisyonları).
Önceki Video 1 DAM sistemi deney tüpü işletim cihazına yerleştirilmeden. Nem nefes yoğunlaşma tarafından sağlanmaktadır. Bu seviye şamandıra veya yüzmek için hayvan neden olmadan çalışma süresi boyunca larva lokomosyon korumak için yeterlidir. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila larvalarının aktivitesi genotip 8, 13 yaş ve ortam sıcaklığında 2 de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere etkilenir. Çok detaylı analiz yapabilen, güçlü videographic yöntemler lokomosyon 5 çalışma olanların geliştirilmiş olmasına rağmen, ayrıntı bu düzeyde etkinliğinin temel parametrelerini belirlemek isteyenler için gereksiz olabilir. Burada anlatılan yöntem, birçok laboratuvarda mevcut bir cihaz, kullanımı kolay istihdam yüksek tekrarlanabilir sonuçlar üretir ve hatta kimin öncelikli araştırma odak hareket değil olanlar için yönetilebilir. Örnek sonuçlar, bu deney, farklı sıcaklıklarda (Şekil 1) ve farklı genotipler (Şekil 2) tabi larva motilitesinde önemli değişiklikler tespit etmek için kullanılabileceğini gösterir.
35 ° C, onların - larva, 5 ° C arasında değişen bir sıcaklıkta ölçüldüğündeaktivite, 20 ° C ve 25 ° C (Şekil 1) arasındaki eğiliminde bir ara haricinde, sıcaklık arttı. Bu, yem erken üçüncü instar larvaları, tipik 25 ° C'de, kültür sıcaklığının +/- 2 ° C arasında sıcaklıklar tercih Ainsley ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. Larva orta Üçüncü dönem safhasına dolaşıp girdiğinizde Ancak, biraz soğuk sıcaklıkları 2 tercih ederim. Bu bulgu, tahlil hayvanların bir kısmı, daha soğuk sıcaklıklarda daha aktif ve daha az olarak gezgin aşamasında ve düşündüren, üçüncü evre larvaların lokomotor aktivitesi 25 ° C den 20 ° C 'de daha büyük olan gözlem ile tutarlıdır 25 ° C'lik normal kültür sıcaklığı.
Bu yöntem basitlik, tarafsızlık ve sağlam verim sunuyor, ancak sınırlamalar vardır. Geçerli set-up pr değil, çünkü yukarıda açıklanan uygulamalar bölümünde, nispeten kısa bir zaman dilimi içinde meydana gelen deneyleri temsilbir besin kaynağı ile ovide larva. Yeterli beslenme sağlanması zaman genişletilmiş süreler boyunca faaliyet değişiklikleri incelemek için ya da uzun vadede sirkadiyen ritim ölçmek için gerekli olacaktır. % 4-agar tamponlarıyla hipoksik koşullar karşılaşan larvaların neden olabilir hazne ile dış çevresi arasında gaz alışverişini kısıtlayabilir. Ancak bu dönemde her dakika boyunca larva dakika başına ortalama hareket analiz edildiğinde, larva kayıt dönemi süresince aktivitede herhangi bir değişiklik göstermek için görünmedi, çünkü 20 dk tahlil süre içinde faaliyetini etkilediği görünmüyor (Şekil 4) .
Cihaz kayıtları pozisyonu sürekli onu gösterdi otomatik olmayan yöntemlere göre daha hareket yakalama bir gelişme temsil ettiği, ancak bazı hareket algılama kaçış yok. Çok hayvanların küçük hareketleri bu cihazdan bir yanıt tetiklemek olmayabilir ve larva tek infra içinde çevresel şekilde hareket edebiliryanlış düşük okumalara neden komşu kirişleri bozmadan kırmızı ışın. Bu tür hata, tüm tedavi gruplarında meydana beklenir çünkü Ancak, yanıltıcı sonuçlara neden mümkün değildir. Üçüncü instar larvaları Bu analiz odak noktası olmasına rağmen, cihazı da (Şekil 3) daha küçük bir birinci ve ikinci instar larvalarının hareket ölçme özelliğine sahiptir. Beklendiği gibi, daha küçük hayvanlarda dakikada kaydedildi hamle sayısı daha büyük üçüncü instar hayvanların daha düşüktür.
Bu aygıtın kullandığı dizi henüz ispat etmek olmasına rağmen, larva içeren çalışmalar için bu cihazın kullanımını çeşitlendirmek olabilecek diğer uyarlamalar çeşitli vardır. Örneğin, cihaz, borunun bir tespit bölgede harcanan zamanı temsil eden bir "aynı yerde kalma" ölçülmesine de izin verir. Çeşitli Drosophila istihdam Bu larva, bir taksi değerli bilgiler verebilirssays. Tüpler dikey yerine yatay olarak yönlendirilmiş böylece yan aparatı yerleştirerek, tek bir larva geotaxis ölçebilir. Phototaxis ölçmek için bir ışık degrade larvaları ışık veya yokluğu için bir tercih olup olmadığını test tüplerinde kurulabilir. Kemotaksisini incelemek için bir test kimyasal ardından tercihlerini belirlemek ya da kimyasal kaçınma açığa olabilir Agar fişleri ve larva pozisyonuna birinde yer olabilir.
monitör sistemi ön tahlil kurulum sırasında tüm parametreleri seçerek Tablo 1'de özetlendi çeşitli hareket parametrelerinin analizine olanak deneyci tahlil sonra analiz için hangi parametre seçebilirsiniz (adım 3.6). Herhangi bir ayar seçili değilse Ancak bu veri post hoc analizi için geçerli olmayacaktır. O zaman, seçilen her bir süre sonra, veriler mevcut sayım C'de donduruldu ve ana bilgisayara kaydedilir unutulmamalıdır. Veri toplama sonra sıfırlarBu süreden sonra, sıfır ve zaman aralığı veri noktaları, bir dizi sağlamaktadır, yeniden başlar. Bir elle veri Kaydı sona erdirmek için çıkmalısınız.
Bu yöntemi içeren Gelecekteki çalışmalarda bekleme parametresi ve çeşitli uygulamaların kullanımı üzerinde durulacak. Ayrıca çalışmaların yiyecek sağlama ve bir daha gaz geçirgen malzeme 14 agar fişleri alışverişinde gibi sirkadiyen çalışmaları gibi uzun bir süre üzerinde gerçekleşmesi için izin verecek bir protokol geliştirmek mümkün olabilir. Kuru şartlarda lokomosyon 15 inhibe nem seviyeleri, hem de kontrol edilmesi gerekir. Şu anda, bu protokol, deney koşulları altında çeşitli larva aktivitesi temel parametrelerini değerlendirmek için doğru ve basit ve maliyet-etkin bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837 (2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449 (2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
