Protocol
1. Fremstilling af Larver
- Til at analysere en ønsket larve til brug eller position præference, vokser larver under standardbetingelser til den ønskede alder til at analysere 10 ved anvendelse af standard flue fødevarer 11.
- Lav en maske filter ved at strække serigrafisk kvalitet nylon mesh over en tragt. Fastgør maske på tragten hals med elastik. Anbring tragten i et bæger.
- At indsamle larver til analyse, øse en spatel fuld af fødevarer, der indeholder fouragering larver fra kulturen flasken og vask med RT postevand over mesh-filter, indsamle individuelle larver direkte fra nettet med en pensel 10.
2. Fremstilling af assayreagensglas
- At forberede at lukke assayreagensglas, omhyggeligt koge en 4% agar gel og hældes i en petriskål til en dybde på 1,5 cm. Dette vil give et stik til hver side af røret, når dyret er vedlagt. Den 4% opløsning er tilstrækkeligt tæt til at forhindre larver fra penetrating stikkene.
- Sørg for, at rørene er rene og klare før indsættelse af larve. Hvis de ikke er, kan dette blokere bevægelser fra at blive optaget.
- At sikre larver har tilstrækkelig fugt til bevægelse, forberede en sprøjteflaske indeholdende en lille mængde af varmt vand. Vend flasken omhyggeligt orientere stikkontakten mod en vask og klem forsigtigt for at uddrive vand fra pickup røret.
- Sæt flasken udløb i assayrør. På flasken for at levere vanddamp ind i assayrør indtil et tyndt lag af kondensvand vises på væggen af røret. Video 1 viser en larve bevæger sig i et rør med en passende mængde fugt.
- At forsegle larve i røret, fjern 1,5 cm tykke agargel fra petriskålen og placere over en maske overflade for at tillade luftstrøm under agar, således at en agar stik kan indsættes i røret. Tryk på en ende af assayrør ind i gelen to gange for at indsætte to propper af gelen i den ene ende.
- Med en paintbhaste, placeres en larve i røret ca. 1,5 inches dyb og forsegle røret ved at trykke enden nærmest larve i agar gel. Den resulterende tryk vil tvinge den anden prop af agar gel fra den modsatte ende og forsegle dyret inden i røret.
- Rørene anbringes i det MB5 Multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM) enhed og justere rør holdninger, så dyrene ikke kan bevæge sig ud over området for sensorerne.
- At sikre, at assayet rør ikke glider ud af indretningen infrarøde læseramme under transport, holde røret på plads ved at fastgøre en ring af kit omkring hvert rør, hvor den kommer i kontakt optageenheden.
3. Måling Activity
- Optag aktivitet i en inkubator for at forhindre unøjagtige aflæsninger, der kan opstå på grund af skygger, fluorescerende lys eller temperaturvariationer i laboratoriet. Se figur 5 for en foreslået arrangement af systemet.
- Indstil en inkubator til 20 ° C (se figur 1). For at undgå falske optagelser på grund af interferens fra glødelamper lyskilder under optagelsen, slukke fluorescerende inkubator lys og bruge en separat LED-lyskilde, mens du optager i kuvøse. Udfør en retssag uden dyr at sikre, at lysforholdene ikke afvigende udløser sensorer. Der bør ikke være optagede bevægelse data efter denne test.
- Lade larverne akklimatisere sig til de 20 ° C inkubator indstillinger i 5 min før start af analysen.
- Sådan indstilles DAM system til ønskede optagelse intervaller (f.eks 1 min), sikre DAM-systemet optagelse software downloades til vært computer 12 og åbn DAM System-filen inden etablering af optagelsen kammeret til PSIU interface.
- For at indstille den ønskede optagelse frekvens, hvor data vil blive gemt, ved at vælge præferencer og derefter klikke over eller under læsning interval mulighed for at vælge forskellige tidsrammer, hvor datavil blive gemt. Vælg f.eks læse interval tider fra 1 sek til 1 time.
- Hvis du vil vælge varierende parameter for registrering af data, skal du vælge indstillinger, og vælg derefter de tilsvarende bokse under output datatype (tæller, bevæger sig, holdninger og dvæle, se tabel 1). Hver parameter giver en unik analyse af larvestadiet aktivitet inden i røret.
- For at starte optagelsen, skal du tilslutte skærmen til Power Supply interface Unit (PSIU) ved hjælp CAB6 telefonkabel. Slut PSIU til en stikkontakt. Et grønt lys vil indikere passende tilslutning.
- Slut PSIU gennem en Universal Serial Bus (USB) kabel til en Macintosh eller Windows PC til dataregistrering. Åbn DAM SystemMB1v6x program på computeren til automatisk at starte dataregistrering.
- Efter den ønskede samling tid er færdig, skal du vælge Afslut og derefter Afslut nu på skærmen DAM aktivitet; data vil derefter blive automatisk gemt under DAM System data. Tag denne datafil (f.eks overvåge 1) og træk i en separat mappe. Dette vil gemme de rå data fra DAM software, så de kan senere blive behandlet.
4. Forberedelse af data til Processing (DAM FileScan)
- At behandle de rå data i et forståeligt format åbner DAM FileScan program, og vælg Select Input data mappe. Vælg derefter de data mappe og den ønskede fil, og vælg scanningen mulighed. Endelig skal du vælge bin længde til den ønskede læsning periode. Dette vil organisere de rå data i parametre af operatøren og programmet vil rapportere de indsamlede i det pågældende område af data.
- Vælg output datatype til at analysere den ønskede bevægelse indstilling (monitor tæller, bevæger sig, dvæle). Under den ekstra aflæsninger menuen ved at vælge sum i bin (dette hvis bin længde er større end det valgte system læsning interval).
- Navngiv filen hensigtsmæssigt og gemme. Filen vil blive gemt i den samme placering som den mappe fra trin 3.9.
- For at indsamle gennemsnitlige bevæger sig, processen de rå data genereret fra trin 4. For at generere en tabel i et regnearksprogram, åbne filen, der tidligere blev gemt (trin 4.3), og når teksten guiden import vises, skal du vælge slut åbne datafilerne i et regneark format.
Bemærk: Afhængigt af den datatype analyseret, vil regnearket læses forskelligt. Typisk at måle monitor flytter eller tæller, tidsperioden af undersøgelsen vil blive registreret numerisk, mens hver enkelt læsning rør vil modtage en udpeget brev. Når du får vist dataene i regnearket, kz søjler repræsenterer slots for assay rør 1-16 hhv. Rækkerne repræsenterer datapunkter indsamlet. - For eksempel, hvis bevægelser blev indsamlet i 20 minutter i 1 min intervaller, gennemsnit de 20 rækker for at beregne en gennemsnitlig antal træk / minut og andre målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser resultaterne fra en temperatur respons undersøgelse af kontrol tredje stadium larver, w 1118, under anvendelse moniteringsenheden at detektere forskelle i larvernes bevægelse ved syv forskellige temperaturer. Larver blev vasket og anbragt i DAM aktivitet som beskrevet ovenfor, og anbragt i en inkubator indstillet til den ønskede temperatur. Apparatet blev derefter lov til at akklimatisere til omgivelserne i 5 minutter før optagelsen begyndte. Hver larve var individuelt analyseret til brug i løbet af en 20 min periode, og det gennemsnitlige antal bevægelser per minut blev beregnet for hvert dyr, og gennemsnittet for hvert sæt af 32 dyr. Data blev analyseret og afbildet ved hjælp af et regnearksprogram. Larver udviste markant stigende aktivitet som temperaturen steg tilsvarende 5-35 ° C i trin 5-graders, bortset fra en pause i denne tendens ved 20 ° C og 25 ° C.
At kontrollere, at forskelle coudetekteres ld mellem en kontrol og en blev testet mutant tidligere beskrevet som hypoaktiv, inaktive larver (IAV 1). Data blev analyseret som bevæger sig / minut i hver af de 32 dyr, og et gennemsnit blev derefter beregnet. Som vist i figur 2, analysen viser, at inaktive larver var betydeligt mindre mobile end en kontrol. Mens de er meget mindre end tredje stadie larver, aktivitet af første og andet stadium larver var også målbare, som vist i figur 3. Aktivitet af tredje stadie larver i hvert minut af 20 min assay viste sig at forblive relativt konsistent hele perioden ( Figur 4).
Figur 1. w 1118 larve bevægelse blev registreret ved temperaturer varierende fra 5 ° C -. 35 ° C Each kolonne repræsenterer gennemsnittet bevægelse af 32 tredje stadiums dyr med individuelle bevægelser per minut i gennemsnit blandt sættet. * Alle gennemsnit er væsentligt forskellige fra hinanden undtagen 10 ° C og 15 ° C (p = 0,116) (Forskellige bogstaver angiver en signifikant forskel, Student t-test).
Figur 2. Tredje stadium kontrol larver sammenlignet med inaktiv (IAV 1) larver ved 20 ° C. IAV 1 larver udviser signifikant mindre mobilitet sammenlignet med kontrol.
Figur 3. Måling af aktivitet af første, anden og tredje stadie larver i løbet af en 20 min optagelse interval ved 20 ° C. N = 32 for hvert larvestadiet.
Figur 4. Histogram viser gennemsnitlige antal træk, der forekommer i hver minut af 20 min optagelsesintervallet. 32 tredje stadie larver blev analyseret ved 20 ° C. Den røde linje repræsenterer antallet af bevægelser i minuttet i gennemsnit for hele 20 min interval.
Figur 5. Diagram, som viser Drosophila Activity Monitor opsætning og dens forbindelse til PSIU grænsefladeenhed og en stationær computer. Indersiden af inkubatoren er afbildet, men under optagelse inkubatoren er at blive lukket.
| Beskrivelse | Parameter |
| Registrerer data hver gangen larve krydser en bjælke, og yderligere optællinger registreres, hvis larve bevæger mens inden for en enkelt stråle. | Tæller |
| Registrerer data kun, når en flue repositions mellem separate bjælker, betyder det ikke optage bevægelse inden en bjælke. | Flytter |
| Registrerer dyr position ved hver anden over et optagelsesintervallet. Disse data afslører foretrukket placering som en funktion af tid brugt på hver sensor i løbet af en analyse. | Dwell |
| Denne indstilling analyserer dyrets generelle holdning inden i røret, som viser, hvilke sensor dyret udløsning under bevægelse. | Position |
| Denne indstilling bestemmer den frekvens, som data indsamlet under et sæt tidsramme gemmes på den stationære computer. | Optagelse Interval |
Tabel 1. Beskrivelse af measurement parametre (Counts, Moves, Dwell og positioner).
Video 1. DAM-system assayrør før indsættelse i drivindretningen. Fugt leveres af kondensvand fra ånde. Dette niveau er tilstrækkeligt til at opretholde larvernes bevægelse i hele studieperioden uden at dyret til at flyde eller svømme. Klik her for at se denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktivitet af Drosophila larver påvirkes af en række faktorer, herunder genotype 8, alder 13 og omgivelsestemperatur 2. Selv kraftige videografisk metoder i stand til meget detaljeret analyse er udviklet af dem, der studerer bevægelse 5, kan dette detaljeringsniveau være overflødig for dem, der ønsker at bestemme grundlæggende parametre for aktivitet. Den her beskrevne fremgangsmåde anvender en enhed, der er tilgængelig i mange laboratorier, er nem at betjene, genererer yderst reproducerbare resultater, og er overskuelige selv for dem, hvis primære forskningsfokus er ikke bevægelse. Eksemplet viser, at denne assay kan anvendes til at detektere betydelige ændringer i motilitet i larver udsættes for forskellige temperaturer (figur 1) og af forskellige genotyper (figur 2).
Når larverne blev målt ved temperaturer fra 5 ° C - 35 ° C, deresaktivitet steg med temperaturen, bortset fra en pause i udviklingen mellem 20 ° C og 25 ° C (figur 1). Det er blevet vist ved Ainsley og medarbejdere, at fouragering tidligt tredje stadie larver foretrækker temperaturer inden for +/- 2 ° C i den typiske 25 ° C kultur temperatur. Men når larverne ind vandrer mid-tredje instar fase de foretrækker noget køligere temperaturer 2. Denne konstatering er i overensstemmelse med den observation, at bevægelsesaktivitet for tredje-stadie larver er større ved 20 ° C end 25 ° C, hvilket antyder, at en del af dyr analyseret var i vandrer fase og mere aktive på de køligere temperaturer, og i mindre grad på den normale kultur temperatur på 25 ° C.
Denne metode giver enkelhed, objektivitet og robust gennemløb, men der er begrænsninger. Ansøgningerne er beskrevet ovenfor repræsenterer analyser forekommer over en relativt kort tidshorisont, dels fordi den nuværende set-up ikke provide larver med en fødekilde. Sikre tilstrækkelig ernæring vil være nødvendigt at undersøge ændringer i aktivitet over længere perioder eller for at måle døgnrytme på længere sigt. De 4% agar stik kan begrænse gasudveksling mellem kammeret og det ydre miljø, hvilket kan resultere i larverne oplever hypoxiske betingelser. Men dette synes ikke at påvirke aktiviteten inden for en 20 min assay periode, for når gennemsnittet flytter i minuttet af larver under hvert minut af perioden blev analyseret, var larver ikke at vise nogen ændring i aktivitet i optagelsen periode (figur 4) .
Fordi enhedens optegnelser position kontinuerligt det repræsenterer en forbedring af opfange mere bevægelse i forhold til de ikke-automatiserede metoder citeret, men nogle bevægelse gør undslippe opdagelse. Meget små flytninger af dyr måske ikke udløse en reaktion fra denne enhed, og larver kan bevæge sig i en perifer måde inden for en infrarøde stråle uden at bryde tilstødende bjælker, hvilket resulterer i unøjagtigt lave aflæsninger. Men da denne type fejl ville forventes at forekomme i alle behandlingsgrupper, er det usandsynligt at forårsage misvisende resultater. Selvom tredje stadie larver er det primære fokus i denne analyse, er enheden i stand til at måle bevægelsen af meget mindre første og anden stadie larver samt (figur 3). Som forventet, at antallet af bevægelser optages pr minut i de yngre dyr er lavere end for de større tredje stadiums dyr.
Selvom den fulde vifte af anvendelser for denne anordning er endnu ikke påvist, er der en række andre tilpasninger, der kunne sprede anvendelser af denne anordning til undersøgelser med larver. For eksempel indretningen tillader en "opholdstid" måling, som repræsenterer tid tilbragt i et bestemt område af røret. Det kan give værdifulde oplysninger, når de anvendes i forskellige Drosophila larvestadiet taxier enssays. Ved at placere apparatet på siden, så at rørene er orienteret lodret i stedet for vandret, kunne man måle larvernes geotaxis. For at måle phototaxis, kunne en let gradient være etableret i rørene, teste, om larver har en præference for lys eller sit fravær. At studere kemotaksi kunne en teststof anbringes på en af de agarpropper og positionen af larverne kunne så afsløre bestemme deres præference for eller undgåelse af kemikaliet.
Monitoren system tillader analyse af forskellige motion parametre, der er sammenfattet i tabel 1. Ved at vælge alle parametre i før-analysen setup (se trin 3.6), forsøgslederen kan vælge, hvilken parameter til at analysere efter analysen. Men hvis nogen indstilling ikke er valgt, at data ikke vil være til rådighed for post-hoc analyse. Det skal bemærkes, at efter hver valgt tidsrum, er data frosset ved nuværende tællinger og gemmes til værtscomputeren. Dataindsamling derefter nulstilles tilnul efter denne periode og begynder igen, hvilket giver en række af tidsinterval datapunkter. Man skal manuelt stoppe for at afslutte dataregistrering.
Fremtidige undersøgelser med denne metode vil fokusere på brugen af opholdstiden parameter og dens forskellige anvendelser. Det kan også være muligt at udvikle en protokol, der vil muliggøre undersøgelser at forekomme over en længere tidsperiode, såsom cirkadiske undersøgelser, ved at tilvejebringe fødevarer og udveksle agarpropper for en mere gaspermeabelt materiale 14. Fugtniveauer vil skulle kontrolleres så godt, som tørre forhold hæmmer bevægelse 15. I øjeblikket er denne protokol giver en præcis, enkel, omkostningseffektiv metode til at evaluere grundlæggende parametre for larvernes aktivitet under forskellige eksperimentelle betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837 (2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449 (2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
