Protocol
1. Voorbereiding van de Larven
- Om een gewenste larve voor vervoer of positie de voorkeur te analyseren, te groeien larven onder standaard condities om de gewenste leeftijd om assay 10 met behulp van standaard vlieg voedsel 11.
- Maak een zeef door strekken silk-screen kwaliteit nylon over een trechter mesh. Bevestig het gaas in de trechter hals met rubberen band. Plaats de trechter in een bekerglas.
- Om larven voor analyse verzamelen, schep een spatel vol met levensmiddelen die foerageren larven uit de cultuur fles en wassen met RT kraanwater over het gaas filter, individuele larven direct van het gaas te verzamelen met een penseel 10.
2. Bereiding van analysebuizen
- Ter voorbereiding op de testbuizen plug voorzichtig koken een 4% agar gel en giet het in een petrischaal op een diepte van 1,5 cm. Dit zal een plug voor weerszijden van de buis wanneer dier is ingesloten. De 4% oplossing voldoende dicht larven van p voorkomenenetrating de stekkers.
- Zorg ervoor dat de buizen zijn schoon en helder voorafgaand aan het inbrengen van de larve. Als ze niet, dan kan dit de bewegingen van wordt opgenomen blokkeren.
- Om ervoor te zorgen larven voldoende vocht voor beweging, bereiden een knijpfles met een kleine hoeveelheid warm water. Keer de fles voorzichtig oriënteren de uitgang in de richting van een wastafel en knijp zachtjes om water te verdrijven uit de pick-up buis.
- Plaats de fles outlet in de test buis. Knijp het flesje waterdamp geven in de testbuis tot een dun laagje condens wordt op de wand van de buis. Video 1 toont een larve bewegen in een buis met een geschikte hoeveelheid vocht.
- Om de larve af te dichten in de buis, verwijder dan de 1,5 cm dik agar gel uit de petrischaal en plaats over een mesh oppervlak om de luchtstroom te laten onder de agar, zodat een agar plug in de buis kan worden ingebracht. Druk op een uiteinde van de assaybuis in de gel tweemaal twee pluggen gel invoegen in een einde.
- Met een paintbhaasten, plaats een larve in de buis ongeveer 1,5 inch diep en sluit de buis door te drukken op het einde het dichtst bij de larve in de agar gel. De resulterende druk zal dwingen de tweede stekker van agar gel uit de andere kant en sluit het dier binnen de buis.
- Plaats de buisjes in de MB5 Multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM) apparaat, en de standpunten van de buizen 'aan te passen, zodat de dieren niet kunnen bewegen buiten het bereik van de sensoren.
- Om deze test tubes niet uit infrarood reading frame van het apparaat te schuiven tijdens het vervoer te waarborgen, houdt de buis op zijn plaats door het bevestigen van een ring van stopverf rond elke buis waar het contact met het opnameapparaat.
3. Meten Activiteit
- Record activiteit in een incubator onnauwkeurige metingen die kunnen optreden als gevolg van schaduwen, tl-lampen of temperatuurschommelingen in het laboratorium te voorkomen. Zie Figuur 5 voor een voorgestelde inrichting van het systeem.
- Stel een incubator op 20 ° C (zie figuur 1). Om valse opnames door storingen van gloeilampen bronnen tijdens de opname te voorkomen, zet tl-incubator verlichting en het gebruik van een afzonderlijke LED lichtbron tijdens de opname in de incubator. Voer een proef zonder dieren te zorgen dat licht niet afwijkend triggeren sensoren. Er moeten geen opgenomen beweging gegevens na deze test.
- Laat larven wennen aan de 20 ° C incubator instellingen gedurende 5 minuten voor aanvang van de test.
- Om de DAM-systeem ingesteld om de gewenste opname-intervallen (bv 1 min), zorgen voor DAM-systeem opname-software wordt gedownload naar de computer 12 hosten en open het DAM-systeem file voorafgaand aan het aansluiten van de opname kamer op de Psiu interface.
- Om de gewenste opname frequentie waarmee gegevens worden opgeslagen, selecteer voorkeuren in te stellen en klik vervolgens boven of onder het lezen van interval optie om verschillende tijdspaden selecteren waarin gegevensworden opgeslagen. Selecteer bijvoorbeeld interval keer lezen vanaf 1 seconde tot 1 uur.
- Om verschillende parameters voor het opnemen van gegevens te selecteren, kiest voorkeuren en selecteer vervolgens de bijbehorende vakjes onder uitgang soort data (tellingen, bewegingen, posities en wonen, zie tabel 1). Elke parameter een unieke analyse van de larvale activiteit in de buis.
- Om de opname te beginnen, sluit u de monitor aan op de Power Supply Interface Unit (Psiu) met behulp van CAB6 telefoonkabel. Sluit de Psiu op een stopcontact. Een groen licht zal passende verbinding aan te geven.
- Sluit de Psiu via een Universal Serial Bus (USB) kabel aan op een Macintosh of Windows-pc voor gegevensregistratie. Open het DAM SystemMB1v6x programma op de computer om gegevens opname automatisch starten.
- Nadat de gewenste collectie tijd is voltooid, selecteert u Afsluiten en Quit dan nu op het scherm DAM activiteit; data wordt vervolgens automatisch opgeslagen onder DAM System Data. Neem deze gegevens bestand (bv, monitor 1) en slepen in een aparte map. Hierdoor wordt de ruwe data op te slaan van de DAM software zodat deze later kan worden verwerkt.
4. Voorbereiding Gegevens voor Processing (DAM FileScan)
- Om de ruwe data in een begrijpelijk formaat te verwerken open de DAM FileScan toepassing en selecteer Select Input Data Folder. Vervolgens kiest u de map gegevens en het gewenste bestand en selecteer de scan optie. Selecteer ten slotte de bak lengte tot de gewenste periode lezen. Dit zal de ruwe gegevens in door de gebruiker ingestelde parameters te organiseren en het programma zal het in die bepaalde reeks verzamelde gegevens te rapporteren.
- Selecteer het type gegevens uitvoeren naar de gewenste beweging instelling te analyseren (monitor telt, moves, wonen). Onder het menu extra metingen selecteert sum in bin (dit wordt als de bak lengte groter is dan het geselecteerde leessysteem interval).
- Noem het bestand op de juiste wijze en op te slaan. Het bestand wordt opgeslagen op dezelfde locatie als de map uit stap 3.9.
- Om de gemiddelde beweegt, verwerken de ruwe data gegenereerd uit stap 4. Als u een tafel in een spreadsheet-programma genereren verzamelen, open het bestand dat eerder werd opgeslagen (stap 4.3), en wanneer het tekstvenster import wizard verschijnt, selecteer afwerking te openen de databestanden in een spreadsheet.
Opmerking: Afhankelijk van het type geanalyseerde gegevens, wordt de spreadsheet anders gelezen. Typisch aan de monitor beweegt of telt, de periode van de studie zal numeriek opgenomen te meten, terwijl elk individu lezen buis een aangewezen brief zal ontvangen. Bij het bekijken van de gegevens in de spreadsheet, KZ kolommen de sleuven vertegenwoordigen respectievelijk test tubes 1-16. De rijen geven de gegevenspunten verzameld. - Bijvoorbeeld, indien door verzameld gedurende 20 min in 1 minuut intervallen, het gemiddelde van de 20 rijen gemiddeld aantal bewegingen / minuut en andere metingen berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de resultaten van een studie van temperatuurreactie derde instar larven control, w 1118 via de bewakingsinrichting verschillen in larvale motoriek bij zeven verschillende temperaturen te detecteren. Larven werden gewassen en geplaatst in de DAM activiteit inrichting zoals hierboven beschreven, en in een incubator ingesteld op de gewenste temperatuur. De inrichting werd vervolgens toegestaan te acclimatiseren aan de omgeving gedurende 5 minuten voordat werd opgenomen. Elke larve werd afzonderlijk geanalyseerd voor vervoer over een periode van 20 min en de gemiddelde aantal bewegingen per minuut werd berekend voor elk dier en gemiddeld voor elke set van 32 dieren. De gegevens werden geanalyseerd en stroomvorm opgenomen met behulp van een spreadsheet-programma. Larven vertoonden significante toename van de activiteit wanneer de temperatuur dienovereenkomstig verhoogd 5-35 ° C in stappen van 5 graden, met uitzondering van een breuk in deze trend bij 20 ° C en 25 ° C.
Om te controleren dat de verschillen could gedetecteerd tussen controle en een mutant eerder beschreven als hypoactive, inactieve larven (IAV 1) getest. De gegevens werden geanalyseerd zoals bewegingen / minuut voor elk van de 32 dieren en een gemiddelde werd vervolgens berekend. Zoals getoond in figuur 2, de analyse aan dat inactief larven waren beduidend minder mobiel dan een controle. Terwijl ze veel kleiner zijn dan derde instar larven, activiteit larven eerste en tweede instar was meetbaar, zie figuur 3. De werking van de derde instar larven per minuut van de 20 min assay bleek gedurende die periode relatief consistent blijven ( Figuur 4).
Figuur 1. w 1118 larvale motoriek werd opgenomen bij temperaturen variërend van 5 ° C -. 35 ° C Each kolom geeft de gemiddelde beweging van 32 derde instar dieren met individuele bewegingen per minuut gemiddeld tussen de set. * Alle gemiddelden significant van elkaar op 10 ° C en 15 ° C (p = 0,116) (Verschillende letters geven een significant verschil, Student t-test).
Figuur 2. Derde instar larven control opzichte inactieve (IAV 1) larven bij 20 ° C. Iav 1 larve vertonen significant minder mobiliteit in vergelijking met de controle.
Figuur 3. Meting van de activiteit van de larven eerste, tweede en derde instar gedurende een 20 min registreerinterval bij 20 ° C. N = 32 voor elke larvale stadium.
Figuur 4. Histogram weergave gemiddeld aantal zetten zich in elke minuut van 20 min opname. 32 derde instar larven werden getest bij 20 ° C. De rode lijn geeft het aantal bewegingen per minuut gemiddelde voor de gehele 20 minuten interval.
Figuur 5. Diagram van de Drosophila Activity Monitor set-up en de verbinding met de Psiu interface-eenheid en een desktop computer. De binnenkant van de incubator is afgebeeld, maar tijdens het opnemen van de incubator moet worden gesloten.
| Beschrijving | Parameter |
| Records data telkenseen larve kruist een balk en bijkomende tellingen worden opgenomen als de larve beweegt terwijl binnen een enkele straal. | Counts |
| Records gegevens alleen wanneer een vlieg herpositioneert tussen afzonderlijke balken, is het niet de beweging binnen een straal opnemen. | Moves |
| Registreert de dieren positie bij elke seconde over een opname-interval. Deze gegevens blijkt positie de voorkeur als functie van de tijd doorgebracht op elke sensor in de loop van een test. | Wonen |
| Deze instelling analyseert algemene standpunt van het dier binnen de buis, met vermelding van welke sensor het dier wordt triggering tijdens beweging. | Positie |
| Deze instelling bepaalt de frequentie waarmee de gegevens gedurende een bepaalde tijd verzameld wordt opgeslagen op de desktop computer. | Opname Interval |
Tabel 1. Beschrijving van measurement parameters (Graven, Moves, Dwell en Posities).
Video 1. DAM-systeem test buis voorafgaand aan het inbrengen in bedieningsapparaat. Vocht wordt geleverd door condensatie van de adem. Dit niveau is voldoende om larvale motoriek gedurende de onderzoeksperiode te behouden zonder dat het dier om te drijven of zwemmen. Klik hier om deze video te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Activiteit van Drosophila larven wordt beïnvloed door verschillende factoren, waaronder genotype 8, leeftijd 13 en omgevingstemperatuur 2. Hoewel krachtige videografische methoden in staat zeer gedetailleerde analyse zijn ontwikkeld door degenen die motoriek 5 bestuderen, kan dit niveau van detail overbodig voor degenen die willen fundamentele parameters van de activiteit te bepalen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een apparaat dat in vele laboratoria, is eenvoudig te bedienen, zeer reproduceerbare resultaten levert en ook geschikt om voor diegenen die primair focusgebied is motoriek. Het voorbeeld resultaten tonen aan dat deze assay kan worden gebruikt om significante veranderingen in motiliteit in larven blootgesteld aan verschillende temperaturen (figuur 1) en verschillende genotypen (figuur 2) te detecteren.
Wanneer larven werden gemeten bij temperaturen variërend van 5 ° C - 35 ° C, deactiviteit verhoogd met de temperatuur, met uitzondering van een trendbreuk tussen 20 ° C en 25 ° C (figuur 1). Het is aangetoond door Ainsley en medewerkers die larven voederen vroeg derde instar voorkeur temperaturen binnen +/- 2 ° C van de typische 25 ° C kweektemperatuur. Echter, wanneer de larven voer zwervende mid-derde fase instar ze liever iets koelere temperaturen 2. Deze vaststelling stemt overeen met de waarneming dat locomotorische activiteit derde instar larven groter bij 20 ° C dan 25 ° C, wat suggereert dat een gedeelte van de dieren onderzocht waren in het zwervende stadium actiever bij lagere temperaturen, en in mindere mate bij de normale kweektemperatuur van 25 ° C.
Deze werkwijze biedt eenvoud objectiviteit en robuust throughput, maar er zijn beperkingen. De hierboven beschreven toepassingen vertegenwoordigen assays die zich over een relatief kort tijdsbestek, voor een deel omdat de huidige set-up niet provide larven met een bron van voedsel. Zorgen voor voldoende voeding nodig zou zijn om veranderingen in de activiteit over langere tijd studeren of om circadiane ritme te meten op de langere termijn. De 4% agar pluggen kan gasuitwisseling tussen de kamer en de externe omgeving, wat kan resulteren in de larven ondervindt hypoxische omstandigheden beperken. Maar dit lijkt geen invloed op de activiteit binnen een 20 min test periode, want als de gemiddelde bewegingen per minuut van larven tijdens elke minuut van de periode werden geanalyseerd, larven verscheen niet aan een verandering in activiteit over de opname periode laten zien (figuur 4) .
Omdat het apparaat verslagen positie continu het vertegenwoordigt een verbetering in het vastleggen van meer beweging ten opzichte van de genoemde niet-geautomatiseerde methoden, maar sommige motion doet ontsnappen detectie. Zeer kleine bewegingen van de dieren misschien niet leiden tot een reactie van dit apparaat, en larven kunnen bewegen in een omtrek mode binnen een infrarode balk zonder te breken naburige balken, wat resulteert in onnauwkeurig lage lezingen. Aangezien dit soort fouten zou naar verwachting in alle behandelingsgroepen, is het onwaarschijnlijk dat misleidende resultaten opleveren. Hoewel derde instar larven zijn de primaire focus van deze analyse is de inrichting geschikt voor het meten van de beweging van de larven veel kleinere eerste en tweede instar ook (Figuur 3). Zoals verwacht, het aantal bewegingen per minuut opgenomen in de jongere dieren lager is dan die van de grotere derde instar dieren.
Hoewel het volledige gamma van toepassingen voor deze inrichting moet nog worden aangetoond, zijn er een aantal andere voorzieningen die het gebruik van dit apparaat kan spreiden voor studies met larven. Bijvoorbeeld, de inrichting kan een 'verblijftijd' meten, wat tijd doorgebracht in een bepaald gebied van de buis staat. Dit kan waardevolle informatie verstrekken wanneer die werkzaam zijn in verschillende Drosophila larvale taxi's eenssays. Door de inrichting op de zijkant zodat de buizen verticaal in plaats van horizontaal georiënteerd, zou men larven geotaxis meten. Om phototaxis te meten, kan een lichte helling worden vastgesteld in de buizen, testen of larven een voorkeur hebben voor lichte of haar afwezigheid. Chemotaxis te bestuderen, kan een chemische teststof op een van de agarproppen en de positie van de larven geplaatst kan dan onthullen bepalen hun voorkeur voor of vermijden van de chemische stof.
Het monitorsysteem maakt de analyse van diverse bewegingsparameters, samengevat in tabel 1. In alle parameters te selecteren tijdens de pre-test setup (zie stap 3.6), de experimentator kan kiezen welke parameter te analyseren na de test. Echter, als een instelling niet is geselecteerd, dat de gegevens zullen niet beschikbaar zijn voor post hoc analyse. Opgemerkt wordt dat na elke bepaalde tijd, gegevens ingevroren bij lopende telt en opgeslagen op de hostcomputer. Het verzamelen van gegevens reset vervolgens naarnul na deze periode en begint opnieuw, het verstrekken van een reeks tijdsinterval datapunten. Men moet handmatig stoppen om gegevens opname te beëindigen.
Toekomstige studies waarbij deze methode is gericht op het gebruik van de parameter verblijftijd en de verschillende toepassingen. Ook kan het mogelijk zijn om een protocol die het mogelijk maken studies plaatsvinden over een langere tijdsperiode, zoals circadiane studies, door voedsel en uitwisselen agar pluggen voor een gas-permeabel materiaal 14 te ontwikkelen. Vochtgehalte zou moeten ook worden gecontroleerd, als droge omstandigheden remmen motoriek 15. Momenteel is dit protocol voorziet in een nauwkeurige, eenvoudige, kosten-effectieve methode om fundamentele parameters van de larvale activiteiten te evalueren onder verschillende experimentele omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837 (2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449 (2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
