Protocol
1. Préparation des larves
- Pour analyser une larve souhaitée pour la locomotion ou la préférence de positionnement, de grandir larves dans des conditions standard pour l'âge souhaité pour doser 10 à l'aide alimentaire à la mouche norme 11.
- Faites un filtre à mailles en étirant nylon sérigraphie de qualité maille sur un entonnoir. Fixez le maillage au niveau du col de l'entonnoir avec une bande élastique. Placez l'entonnoir dans un bêcher.
- Pour collecter des larves pour l'analyse, ramasser une spatule-plein de nourriture contenant la recherche de nourriture des larves de la bouteille de culture et laver avec de l'eau du robinet RT sur le filtre de maille, la collecte de larves individuelle directement à partir de la maille avec un pinceau 10.
2. Préparation d'Assay Tubes
- Pour se préparer à boucher les tubes à essai, faire bouillir avec soin un gel d'agar à 4% et verser dans un plat de Petri à une profondeur de 1,5 cm. Cela fournira une fiche pour chaque côté du tube lorsque l'animal est enfermé. La solution à 4% est suffisamment dense pour empêcher les larves de penetrating les bouchons.
- Veiller à ce que les tubes sont propres et claires avant l'insertion de larve. Si elles ne sont pas, cela peut bloquer les mouvements de cours d'enregistrement.
- Pour assurer larves ont suffisamment d'humidité pour le mouvement, préparer un flacon souple contenant une petite quantité d'eau chaude. Retourner le flacon, orienter soigneusement la sortie vers un évier et presser doucement pour expulser l'eau du tube de ramassage.
- Insérer la sortie de la bouteille dans le tube de dosage. Pressez la bouteille pour fournir de la vapeur d'eau dans le tube à essai jusqu'à ce qu'une fine couche de la condensation apparaît sur la paroi du tube. Vidéo 1 représente une larve se déplaçant dans un tube avec une quantité appropriée de l'humidité.
- Pour sceller la larve dans le tube, enlever le gel d'agar 1,5 cm d'épaisseur de la boîte de Pétri et placez sur une surface de grillage pour permettre aux flux d'air sous l'agar de sorte qu'un bouchon de gélose peut être inséré dans le tube. Appuyer sur une extrémité du tube à essai dans le gel deux fois pour insérer deux bouchons de gel dans une extrémité.
- Avec un paintbprécipiter, placer une larve dans le tube d'environ 1,5 pouces de profondeur et sceller le tube en appuyant sur la fin proche de la larve dans le gel d'agar. La pression résultante va forcer le second bouchon de gel de gélose à partir de l'extrémité opposée de l'animal et sceller l'intérieur du tube.
- Placer les tubes dans le dispositif MB5 multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM), et ajuster les positions des tubes de sorte que les animaux ne peuvent pas aller au-delà de la portée des capteurs.
- Pour veiller à ce que dosage tubes ne glissent pas hors du cadre de lecture infrarouge de l'appareil pendant le transport, maintenir le tube en place par la fixation d'un anneau de mastic autour de chaque tube où il est en contact de l'appareil d'enregistrement.
3. mesure de l'activité
- l'activité d'enregistrement dans un incubateur pour éviter des lectures erronées qui peuvent survenir en raison d'ombres, les lumières fluorescentes ou aux variations de température dans le laboratoire. Voir la figure 5 pour un agencement proposé du système.
- Définir un incubateur à 20 ° C (voir Figure 1). Pour éviter les faux enregistrements de perturbations dues à des sources lumineuses incandescentes pendant l'enregistrement, éteindre les lumières fluorescentes de pépinières et d'utiliser une source de lumière LED séparée lors de l'enregistrement dans l'incubateur. Effectuer un essai sans animaux pour assurer que les conditions d'éclairage ne déclenche pas aberrante capteurs. Il devrait y avoir pas de données de mouvement enregistrées après ce test.
- Permettre aux larves de acclimater à 20 ° C les paramètres de l'incubateur pendant 5 min avant le début de l'essai.
- Pour définir le système de DAM à intervalles d'enregistrement désirée (par exemple, 1 min), assurer le logiciel d'enregistrement du système DAM est téléchargé sur l'ordinateur hôte 12 et ouvrez le fichier du système de DAM avant de connecter la chambre d'enregistrement à l'interface Psiu.
- Pour définir la fréquence souhaitée d'enregistrement à laquelle les données seront sauvegardées, sélectionnez Préférences, puis cliquez dessus ou en dessous de l'option d'intervalle de lecture pour sélectionner différentes échelles de temps dans lequel les donnéesseront stockées. Par exemple, sélectionnez la lecture temps de pause de 1 sec à 1 h.
- Pour sélectionner le paramètre variable pour l'enregistrement de données, choisissez Préférences puis cochez les cases correspondantes dans la section Sortie type de données (comptes, mouvements, positions et vous habiterez, voir le tableau 1). Chaque paramètre fournit une analyse unique de l'activité des larves à l'intérieur du tube.
- Pour commencer l'enregistrement, connecter le moniteur à l'unité d'interface d'alimentation (de Psiu) en utilisant le câble CAB6 téléphonique. Connectez le Psiu à une prise de courant. Une lumière verte indiquera un branchement approprié.
- Connectez le Psiu par un câble Universal Serial Bus (USB) à un Macintosh ou PC sous Windows pour l'enregistrement de données. Ouvrez le programme DAM SystemMB1v6x sur l'ordinateur de démarrer automatiquement l'enregistrement de données.
- Après le temps de collecte souhaitée est terminée, sélectionnez Quitter, puis Quitter maintenant sur l'écran de l'activité de DAM; données seront ensuite automatiquement enregistrée sous Données système DAM. Prenez ce fichier de données (par exemple, surveiller 1) et faites glisser dans un dossier distinct. Cela permettra de stocker les données brutes à partir du logiciel de DAM afin qu'ils puissent être traitées par la suite.
4. Préparation des données pour le traitement (DAM FileScan)
- Pour traiter les données brutes en un format compréhensible ouvrir l'application DAM FileScan et sélectionnez Sélectionner le dossier des données d'entrée. Ensuite, choisissez le dossier de données et le fichier souhaité, et sélectionnez l'option de numérisation. Enfin sélectionner la longueur de bin à la période de lecture souhaitée. Ce sera d'organiser les données brutes en paramètres fixés par l'opérateur et le programme va rapporter les données recueillies dans cette gamme particulière.
- Sélectionnez le type de données de sortie à analyser le paramètre de mouvement souhaitée (nombre de moniteurs, se déplace, habitent). Dans le menu des lectures supplémentaires, sélectionnez somme dans le bac (ce qui est si la longueur du bac est plus grande que le système intervalle de lecture sélectionnée).
- Nommez le fichier de manière appropriée et économisez. Le fichier sera stocké dans le même emplacement que le dossier de l'étape 3.9.
- Afin de recueillir des mouvements moyens, processus, les données brutes générées par l'étape 4. Pour générer une table dans un tableur, ouvrez le fichier qui a été précédemment enregistrée (étape 4.3), et lorsque la fenêtre de l'assistant d'importation de texte apparaît, sélectionnez Terminer pour ouvrir les fichiers de données dans un format de tableur.
Remarque: Selon le type de données analysées, la feuille de calcul sera lu différemment. Typiquement pour mesurer se déplace du moniteur ou chefs d'accusation, la période de l'étude sera enregistrée numériquement, tandis que chaque tube individuel de lecture recevra une lettre désigné. Lors de la visualisation des données dans le tableur, KZ colonnes représentent les fentes pour tubes à essai de 1 à 16, respectivement. Les lignes représentent les points de données collectés. - Par exemple, si se déplace ont été recueillies pendant 20 min à 1 min d'intervalle, la moyenne des 20 lignes de calculer un nombre moyen de coups / minute et d'autres mesures.
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Representative Results
La figure 1 montre les résultats d'une étude de réponse à la température de contrôle des larves de troisième stade larvaire, 1118 w, à l'aide du dispositif de surveillance pour détecter des différences dans la locomotion des larves à sept températures différentes. Les larves ont été lavées et placées dans le dispositif de l'activité de DAM comme décrit ci-dessus, et placé dans un incubateur réglé à la température désirée. L'appareil a ensuite été laissé à acclimater à l'environnement pendant 5 minutes avant le début de l'enregistrement. Chaque larve a été analysée individuellement pour la locomotion sur une période de 20 min et le nombre moyen de mouvements par minute a été calculée pour chaque animal et en moyenne pour chaque ensemble de 32 animaux. Les données ont été analysées et tracées à l'aide d'un tableur. Les larves présentait une activité augmenter de manière significative que la température a augmenté de façon correspondante de 5-35 ° C par incréments de 5 degrés, sauf pour une pause dans cette tendance à 20 ° C et 25 ° C.
Pour vérifier que les différences could être détecté entre un contrôle et un mutant précédemment décrit comme hypoactif, larves inactif (iav 1) ont été testés. Les données ont été analysées comme se déplace / minute pour chacune des 32 animaux et une moyenne a ensuite été calculée. Comme le montre la Figure 2, l'analyse indique que les larves inactif sont significativement moins mobiles que témoin. Alors qu'ils sont beaucoup plus petits que troisième stade larvaire, de l'activité de premier et deuxième stade larvaire est également mesurable, comme représenté sur la figure 3. Activité de troisième stade larvaire dans chaque minute de l'essai de 20 min a montré rester relativement constante tout au long de la période ( Figure 4).
Figure 1. w 1118 locomotion des larves a été observée à des températures variant de 5 ° C. - 35 ° C Each colonne représente le mouvement moyenne de 32 animaux tiers des stades avec des mouvements individuels par minute en moyenne parmi l'ensemble. * Toutes les moyennes sont significativement différents les uns des autres, sauf 10 ° C et 15 ° C (p = 0,116) (lettres différentes indiquent une différence significative, t-test de Student).
Figure 2. Troisième stade larvaire de contrôle par rapport aux inactifs (iav 1) larves à 20 ° C. Iav 1 larves présentent significativement moins de mobilité par rapport au témoin.
Figure 3. Mesure de l'activité de premier, second et troisième stade larvaire sur un intervalle d'enregistrement de 20 minutes à 20 ° C. N = 32 pour chaque stade larvaire.
Figure 4. Histogramme affichant nombre moyen de mouvements qui se produisent dans chaque minute de l'intervalle d'enregistrement de 20 min. 32 troisième stade larvaire ont été dosés à 20 ° C. La ligne rouge représente le nombre de coups par minute en moyenne pour l'ensemble de l'intervalle de 20 min.
Figure 5. Schéma illustrant le set-up Drosophila Activity Monitor et sa connectivité à l'unité d'interface de Psiu et un ordinateur de bureau. L'intérieur de l'incubateur est représenté, mais pendant l'enregistrement de l'incubateur doit être arrêté.
| Description | Paramètre |
| Enregistre les données à chaque foisune larve traverse un faisceau, et autres chefs d'accusation sont comptabilisés si la larve se déplace alors dans un seul faisceau. | Comtes |
| enregistre les données seulement quand une mouche repositionne entre faisceaux séparés, il ne comptabilise pas le mouvement dans un faisceau. | Moves |
| Enregistre la position des animaux à chaque seconde sur un intervalle d'enregistrement. Ces données révèlent que la préférence de positionnement en fonction du temps passé à chaque capteur au cours d'un dosage. | Habiter |
| Ce paramètre analyse la position générale de l'animal dans le tube, ce qui indique quel capteur l'animal déclenche pendant le mouvement. | Position |
| Ce paramètre détermine la fréquence à laquelle les données recueillies au cours d'un laps de temps de jeu est enregistré sur l'ordinateur de bureau. | Intervalle d'enregistrement |
Tableau 1. Description des mesuparamètres Rement (comtes, Moves, Dwell et positions).
Vidéo 1. DAM tube à essai du système avant l'insertion dans le dispositif d'exploitation. L'humidité est fourni par la condensation de l'haleine. Ce niveau est suffisant pour maintenir la locomotion des larves tout au long de la période d'étude sans provoquer l'animal à flotter ou nager. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
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Discussion
L'activité des larves de Drosophila est influencée par divers facteurs, y compris génotype 8, 13 l'âge et de la température ambiante 2. Bien que les méthodes vidéographiques puissants capables d'analyse très détaillée ont été développés par ceux qui étudient la locomotion 5, ce niveau de détail peut être superflu pour ceux qui souhaitent pour déterminer les paramètres de base de l'activité. La méthode décrite ici emploie un appareil qui est disponible dans de nombreux laboratoires, est facile à utiliser, génère des résultats très reproductibles, et est gérable même pour ceux dont l'objectif principal est la recherche pas la locomotion. Les exemples de résultats démontrent que ce dosage peut être utilisé pour détecter des changements significatifs dans la motilité chez les larves soumis à des températures différentes (figure 1) et de différents génotypes (figure 2).
Lorsque les larves ont été mesurés à des températures allant de 5 ° C - 35 ° C, leurl'activité augmentait avec la température, à l'exception d'une pause dans la tendance entre 20 ° C et 25 ° C (Figure 1). Il a été démontré par Ainsley et ses collègues que la recherche de nourriture troisième premières larves préfèrent des températures de +/- 2 ° C de la température de 25 ° C typique de la culture. Toutefois, lorsque les larves pénètrent errant milieu du troisième phase de stade larvaire, elles préfèrent des températures un peu plus frais 2. Ce résultat est cohérent avec l'observation que l'activité locomotrice des larves de troisième stade est supérieure à 20 ° C à 25 ° C, ce qui suggère qu'une partie des animaux testés étaient à l'étape de l'errance et plus actif aux températures plus fraîches et moins au la température de culture normale de 25 ° C.
Cette méthode offre la simplicité, l'objectivité et le débit robuste, mais il ya des limites. Les applications décrites ci-dessus représentent des essais qui se produisent sur une période de temps relativement court, en partie parce que la configuration actuelle ne provide larves avec une source de nourriture. Assurer une nutrition adéquate serait nécessaire d'étudier les changements dans l'activité sur des périodes de temps prolongées ou pour mesurer le rythme circadien dans le long terme. Les bouchons de gélose 4% peuvent restreindre l'échange de gaz entre la chambre et l'environnement extérieur, ce qui pourrait entraîner les larves connaissent des conditions hypoxiques. Toutefois, cela ne semble pas affecter l'activité dans une période de test de 20 minutes, parce que quand se déplace moyens par minute des larves au cours de chaque minute de la période ont été analysés, les larves ne semble pas montrer un changement dans l'activité au cours de la période d'enregistrement (Figure 4) .
Parce que la position des dossiers de l'appareil en continu, il représente une amélioration de capturer plus de mouvement par rapport aux méthodes non automatisées citées, cependant un certain mouvement fait échapper à la détection. Très petits mouvements d'animaux pourraient ne pas déclencher une réponse de ce dispositif, et les larves peuvent se déplacer de façon périphérique dans l'infrafaisceau rouge sans casser faisceaux voisins, entraînant inexacte faibles lectures. Cependant, puisque ce type d'erreur serait prévu de se produire dans tous les groupes de traitement, il est peu probable de causer des résultats trompeurs. Bien que troisième stade larvaire sont l'objectif principal de cette analyse, l'appareil est capable de mesurer le mouvement des larves premier et deuxième stade beaucoup plus petit ainsi (Figure 3). Comme prévu, le nombre de déplacements enregistrés par minute chez les animaux plus jeunes est inférieure à celle des plus grands animaux de troisième stade.
Bien que la gamme complète d'utilisations pour ce dispositif n'a pas encore été démontré, il ya une variété d'autres adaptations qui pourraient diversifier les usages de cet appareil pour des études impliquant des larves. Par exemple, le dispositif permet une mesure «d'arrêt», qui représente le temps passé dans une région déterminée du tube. Cela peut fournir des informations précieuses lorsqu'ils sont employés dans diverses larves de drosophile taxis unssays. En plaçant l'appareil sur le côté afin que les tubes sont orientés verticalement plutôt qu'horizontalement, on pourrait mesurer géotaxie larvaires. Pour mesurer phototaxie, un gradient de lumière pourrait être établi dans les tubes, tester si les larves ont une préférence pour la lumière ou de son absence. Pour étudier la chimiotaxie, une substance chimique de test peut être placé sur l'un des bouchons d'agar-agar et de la position des larves peut alors révéler déterminer leur préférence pour l'évitement ou de la substance chimique.
Le système de surveillance permet l'analyse des différents paramètres de mouvement, résumées dans le tableau 1. En sélectionnant tous les paramètres lors de la configuration pré-test (voir l'étape 3.6), l'expérimentateur peut choisir quel paramètre à analyser après le dosage. Cependant, si un réglage est pas sélectionnée, que les données ne seront pas disponibles pour l'analyse post hoc. Il convient de noter que, après chaque période de temps choisie, les données sont congelés à chiffres actuels et enregistrées sur l'ordinateur hôte. La collecte de données réinitialise ensuiteaprès cette période zéro et recommence, en fournissant une série de points de données d'intervalle de temps. Il faut quitter manuellement pour terminer l'enregistrement de données.
Les futures études impliquant cette méthode se concentreront sur l'utilisation du paramètre de séjour et ses différentes applications. En outre, il peut être possible de développer un protocole qui permettrait d'études se produire sur une plus longue période de temps, telles que des études circadiens, en fournissant l'alimentation et l'échange des bouchons de gélose pour un matériau plus perméable au gaz 14. auraient besoin de taux d'humidité doit être contrôlée aussi bien, que les conditions sèches inhibent la locomotion 15. Actuellement, ce protocole fournit une méthode précise, simple, rentable pour évaluer les paramètres de base de l'activité larvaire sous une variété de conditions expérimentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
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