Protocol
1. Preparazione di larve
- Per analizzare una larva desiderato per la locomozione o la preferenza di posizione, crescere le larve in condizioni standard per l'età desiderata per saggiare 10 utilizzando fly cibo standard 11.
- Fare un filtro a rete da stretching grado nylon serigrafica maglia su un imbuto. Fissare la rete al collo a imbuto con l'elastico. Inserire l'imbuto in un becher.
- Per raccogliere larve per l'analisi, paletta una spatola-pieno di cibo contenente foraggiamento larve dalla bottiglia coltura e lavare con acqua di rubinetto RT il filtro a rete, raccogliendo larve individuale direttamente dalla rete con un pennello 10.
2. Preparazione di Assay Tubes
- Per preparare per tappare le provette, bollire con attenzione un gel di agar 4% e versare in una capsula di Petri a una profondità di 1,5 cm. Ciò fornirà una spina per entrambi i lati del tubo quando animale è racchiuso. La soluzione al 4% è sufficientemente densa per evitare larve da penetrating i tappi.
- Assicurarsi che i tubi siano puliti e chiari prima dell'inserimento di larva. Se non lo sono, ciò può bloccare i movimenti vengano registrati.
- Per garantire larve ha umidità sufficiente per il movimento, preparare una spruzzetta contenente una piccola quantità di acqua calda. Capovolgere la bottiglia, orientare attentamente presa verso un lavandino e spremere delicatamente per espellere l'acqua dal tubo di prelievo.
- Inserire la presa della bottiglia nella provetta. Comprimere il flacone per fornire vapore acqueo nella provetta fino a visualizzare un sottile strato di condensa sulla parete del tubo. Video 1 mostra una larva muove in un tubo con una quantità appropriata di umidità.
- Per sigillare la larva nel tubo, rimuovere il gel di agar dello spessore di 1,5 cm dalla capsula di Petri e posizionare su una superficie mesh per permettere il flusso d'aria sotto l'agar in modo che una spina agar può essere inserito nel tubo. Premere un'estremità del tubo dosaggio nel gel due volte per inserire due tappi di gel in una delle estremità.
- Con un paintbcorrere, mettere una larva nel tubo di circa 1,5 pollici di profondità e sigillare il tubo premendo l'estremità più vicina la larva nel gel di agar. La pressione risultante costringerà il secondo tappo di gel di agar dall'estremità opposta e sigillare l'animale all'interno del tubo.
- Porre le provette nello dispositivo MB5 Multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM) e regolare la posizione delle valvole in modo che gli animali non possono andare oltre il campo dei sensori.
- Per garantire che assay tubi non scivolare fuori infrarossi quadro di lettura del dispositivo durante il trasporto, tenere il tubo in posizione da un anello di fissaggio mastice intorno ogni tubo nel punto di contatto del dispositivo di registrazione.
3. Misurazione Attività
- L'attività di registrazione in un incubatore per evitare letture errate che possono verificarsi a causa di ombre, luci fluorescenti o alle variazioni di temperatura in laboratorio. Vedere Figura 5 per una disposizione suggerita del sistema.
- Impostare un incubatore a 20 ° C (vedi Figura 1). Per evitare falsi registrazioni dovuta a interferenze da fonti luminose ad incandescenza durante la registrazione, spegnere le luci fluorescenti e incubatori utilizzare una sorgente luminosa a LED separato durante la registrazione in incubatrice. Eseguire una prova senza animali per garantire che le condizioni di luce non aberrante innescare sensori. Non ci dovrebbero essere i dati di movimento registrati dopo questa prova.
- Lasciare che le larve si adatti alle impostazioni di incubazione 20 ° C per 5 minuti prima dell'inizio della dosaggio.
- Per impostare il sistema DAM a intervalli di registrazione desiderata (ad esempio, 1 min), garantire software di registrazione di sistema DAM viene scaricato sul computer host 12 e aprire il file di sistema DAM prima di collegare il camera di registrazione all'interfaccia psiu.
- Per impostare la frequenza di registrazione desiderata in cui verranno salvati i dati, selezionare le preferenze e quindi fare clic sopra o sotto l'opzione intervallo di lettura per selezionare differenti frazioni di tempo in cui i dativerrà memorizzato. Ad esempio, selezionare la lettura tempi di intervallo da 1 sec a 1 ora.
- Per selezionare il parametro che varia per la registrazione dei dati, scegliere le preferenze e quindi selezionare le caselle corrispondenti sotto tipo di dati in uscita (conti, movimenti, posizioni e dimorare, vedi Tabella 1). Ciascun parametro fornisce un'analisi unica dell'attività larvale all'interno del tubo.
- Per iniziare la registrazione, collegare il monitor al Modulo di interfaccia di alimentazione (psiu) tramite cavo telefonico CAB6. Collegare il psiu ad una presa di corrente. Una luce verde indicherà connessione appropriata.
- Collegare il psiu tramite un cavo Universal Serial Bus (USB) per un Macintosh o PC Windows per la registrazione dei dati. Aprire il programma DAM SystemMB1v6x sul computer per avviare automaticamente la registrazione dei dati.
- Dopo il tempo di raccolta desiderato è completo, selezionare Esci e quindi chiudere ora sullo schermo l'attività DAM; dati verrà salvato automaticamente sotto DAM dati di sistema. Prendete questo file di dati (ad esempio, monitorare 1) e trascinate in una cartella separata. Ciò memorizzare i dati grezzi dal software DAM in modo che possano essere successivamente elaborati.
4. Preparazione dei dati per l'elaborazione (DAM FileScan)
- Per elaborare i dati grezzi in un formato comprensibile aprire l'applicazione DAM FileScan selezionare Seleziona cartella dei dati di ingresso. Quindi scegliere la cartella di dati e il file desiderato, e selezionare l'opzione di scansione. Infine selezionare la lunghezza bin per il periodo di lettura desiderata. Ciò organizzare i dati grezzi in parametri impostati dall'operatore ed il programma riporterà i dati raccolti in quel particolare intervallo.
- Selezionare il tipo di dati di uscita per analizzare il movimento impostazione desiderata (conteggi del monitor, si muove, dimorano). Nel menu letture supplementari, somma selezionare in bin (questo è se la lunghezza bidone è maggiore dell'intervallo di lettura sistema selezionato).
- Nome del file in modo appropriato e salvare. Il file verrà memorizzato nella stessa posizione come la cartella dal punto 3.9.
- Al fine di raccogliere mosse media, elaborare i dati grezzi generati dal punto 4. Per generare una tabella in un foglio di calcolo, aprire il file che è stato salvato in precedenza (punto 4.3), e quando appare la finestra di importazione guidata testo, selezionare finitura per aprire i file di dati in formato foglio di calcolo.
Nota: A seconda del tipo di dati analizzati, il foglio di calcolo verrà letto in modo diverso. In genere per misurare monitorare movimenti o conteggi, il periodo di tempo di studio sarà registrato numericamente, mentre ogni tubo lettura individuale riceverà una lettera designata. Quando si visualizzano i dati nel foglio di calcolo, le colonne KZ rappresentano gli slot per provette 1-16 rispettivamente. Le righe rappresentano i punti di dati raccolti. - Ad esempio, se sono stati raccolti muove per 20 min a intervalli di 1 minuto, la media dei 20 righe per calcolare un numero medio di mosse / minuto e altre misurazioni.
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Representative Results
La Figura 1 mostra i risultati di uno studio di risposta di temperature di controllo larve al terzo stadio, w 1118, utilizzando il dispositivo di monitoraggio per rilevare le differenze di locomozione larvale a sette diverse temperature. Le larve sono state lavate e collocato nel dispositivo dell'attività DAM come sopra descritto, e collocato in un incubatore alla temperatura desiderata. L'apparecchio è stato poi consentito di acclimatarsi all'ambiente per 5 minuti prima dell'inizio della registrazione. Ogni larva è stato analizzato singolarmente di locomozione su un periodo di 20 min e il numero medio di mosse per minuto è stato calcolato per ogni animale e in media per ogni gruppo di 32 animali. I dati sono stati analizzati e graficamente utilizzando un foglio di calcolo. Larve esposto significativamente aumentando l'attività come temperatura aumentata parallelamente da 5-35 ° C con incrementi di 5 gradi, tranne per una pausa in questa tendenza a 20 ° C e 25 ° C.
Per verificare che le differenze couessere rilevato ld tra un controllo e un mutante precedentemente descritto come hypoactive, larve inattiva (IAV 1) sono stati testati. I dati sono stati analizzati come muove / minuto per ciascuno dei 32 animali e una media stata quindi calcolata. Come mostrato in Figura 2, l'analisi indica che le larve inattivo erano significativamente meno mobile un controllo. Mentre sono molto più piccoli larve al terzo stadio, l'attività di primo e secondo larve instar era anche misurabile, come mostrato nella figura 3. Attività di terzi larve instar in ogni minuto del 20 min test ha dimostrato di rimanere relativamente costante per tutto il periodo ( Figura 4).
Figura 1. w 1118 locomozione larvale è stato registrato a temperature variabili tra 5 ° C -. 35 ° C Each colonna rappresenta il moto media di 32 animali al terzo stadio con i singoli movimenti al minuto in media tra il set. * Tutti medie sono significativamente diversi tra loro, tranne 10 ° C e 15 ° C (p = 0,116) (Diverse lettere indicano una differenza significativa, Student t-test).
Figura 2. Terzo instar larve di controllo rispetto al inattiva (IAV 1) larve a 20 ° C. IAV 1 larve mostra molto meno mobilità rispetto al controllo.
Figura 3. misurazione dell'attività della prima, seconda e terza larve instar su un intervallo di registrazione 20 min a 20 ° C. N = 32 per ogni stadio larvale.
Figura 4. Istogramma visualizzazione numero medio di movimenti che si verificano in ogni minuto dell'intervallo di registrazione 20 min. 32 terzo stadio larve sono stati saggiati a 20 ° C. La linea rossa rappresenta il numero di mosse per minuto media per l'intero intervallo di 20 min.
Figura 5. Diagramma che indica la Drosophila Activity Monitor set-up e la sua connettività con l'unità di interfaccia psiu e un computer desktop. L'interno dell'incubatrice è raffigurato, ma durante la registrazione l'incubatrice viene messo fuori servizio.
| Descrizione | Parametro |
| Registra i dati ogni voltauna larva attraversa un fascio, e conta aggiuntivi vengono registrati se la larva si muove mentre all'interno di un unico fascio. | Conti |
| Data Records solo quando una mosca riposiziona tra fasci separati, non registra il movimento all'interno di una trave. | Moves |
| Registra la posizione animali durante ogni secondo per un intervallo di registrazione. Questi dati rivela la preferenza di posizione in funzione del tempo trascorso per ciascun sensore nel corso di un test. | Abitare |
| Questa impostazione analizza la posizione generale degli animali all'interno del tubo, che indica quale sensore l'animale è innescare durante il movimento. | Posizione |
| Questa impostazione determina la frequenza con cui i dati raccolti durante un periodo di tempo stabilito vengono salvate sul computer desktop. | Registrazione a intervalli |
Tabella 1. Descrizione di misuparametri misura- (Conti, Partenze, Dwell e posizioni).
Video 1. DAM provetta sistema prima di inserimento nel dispositivo di comando. L'umidità è fornito dalla condensazione da respiro. Questo livello è sufficiente a mantenere locomozione larvale per tutto il periodo di studio senza provocare l'animale di galleggiare o nuotare. Clicca qui per vedere il video.
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Discussion
Attività di larve di Drosophila è influenzata da una varietà di fattori, tra genotipo 8, 13 anni e la temperatura ambiente 2. Sebbene potenti metodi videografici capaci di analisi molto dettagliate sono state sviluppate da parte di coloro che studiano locomozione 5, questo livello di dettaglio può essere superfluo per coloro che desiderano per determinare i parametri di base di attività. Il metodo qui descritto si avvale di un dispositivo che è disponibile in molti laboratori, è facile da usare, genera risultati altamente riproducibili, ed è gestibile anche per coloro il cui obiettivo non è la ricerca primaria locomozione. I risultati di esempio dimostrano che questo saggio può essere utilizzato per rilevare cambiamenti significativi nella motilità in larve sottoposti a diverse temperature (Figura 1) e di differenti genotipi (Figura 2).
Quando le larve sono stati misurati a temperature comprese tra 5 ° C - 35 ° C, laattività aumentata con la temperatura, ad eccezione di una pausa nella tendenza tra 20 ° C e 25 ° C (Figura 1). E 'stato dimostrato da Ainsley e collaboratori che foraggiare precoce terzo instar larve preferiscono temperature entro +/- 2 ° C della temperatura di 25 ° tipica cultura C. Tuttavia, quando le larve entrare errante metà del III fase instar preferiscono temperature un po 'più fresche 2. Tale risultato è coerente con l'osservazione che l'attività locomotoria per larve terzo instar è superiore a 20 ° C a 25 ° C, suggerendo che una parte degli animali testati erano in fase vagare più attivi a temperature più fredde, e meno a la normale temperatura di coltura di 25 ° C.
Questo metodo offre la semplicità, l'obiettività e il throughput robusto, ma ci sono delle limitazioni. Le applicazioni sopra descritte rappresentano saggi che si verificano nel corso di un lasso di tempo relativamente breve, in parte perché l'attuale assetto non lo fa prOvide larve con una fonte di cibo. Assicurare un'alimentazione adeguata sarebbe necessario per studiare i cambiamenti nell'attività oltre periodi di tempo o di misurare il ritmo circadiano a più lungo termine. I tappi 4% agar possono limitare lo scambio di gas tra la camera e l'ambiente esterno, che potrebbe comportare larve sperimentare condizioni di ipossia. Tuttavia questo non sembra influenzare l'attività entro un periodo di test di 20 min, perché quando sono stati analizzati mosse medi per minuto di larve durante ogni minuto del periodo, larve non sembra mostrare alcuna variazione dell'attività durante il periodo di registrazione (Figura 4) .
Poiché la posizione dispositivo registra continuamente rappresenta un miglioramento nel catturare più movimento rispetto ai metodi non automatizzati citate, tuttavia qualche movimento fa fuoriuscire rilevamento. Molto piccoli movimenti di animali non potrebbero innescare una risposta da questo dispositivo, e le larve possono muoversi in modo circonferenziale entro un infraraggio rosso senza rompere travi limitrofi, con conseguente erroneamente letture basse. Tuttavia, poiché questo tipo di errore sarebbe dovrebbe verificarsi in tutti i gruppi di trattamento, è improbabile che causare risultati fuorvianti. Sebbene terzo stadio larve sono l'obiettivo principale di questa analisi, il dispositivo è in grado di misurare il moto del molto più piccolo primo e secondo instar larve così (Figura 3). Come previsto, il numero di mosse registrati al minuto nei animali più giovani è inferiore a quella dei grandi animali terzo stadio.
Sebbene l'intera gamma di usi per questo dispositivo è ancora dimostrata, ci sono una varietà di altri adattamenti che potrebbero diversificare gli usi di questo apparato per studi che coinvolgono larve. Per esempio, il dispositivo consente una misurazione 'dwell', che rappresenta il tempo trascorso in una determinata regione del tubo. Questo può fornire informazioni preziose quando impiegato in diverse Drosophila larvale taxi unssays. Inserendo l'apparecchiatura su un lato in modo che i tubi sono orientati verticalmente invece che orizzontalmente, si potrebbe misurare geotassi larvali. Per misurare fototassi, un gradiente di luce è stato possibile stabilire nei tubi, verificando se le larve hanno una preferenza per la luce o la sua assenza. Per studiare chemiotassi, una sostanza chimica di prova potrebbe essere collocato su uno dei tappi di agar e la posizione delle larve potrebbe quindi rivelare determinare la loro preferenza per o elusione della sostanza chimica.
Il sistema di monitoraggio consente di analizzare vari parametri di movimento, riassunti nella tabella 1. Selezionando tutti i parametri durante la configurazione di pre-test (vedi punto 3.6), lo sperimentatore può scegliere quale parametro di analizzare dopo il test. Tuttavia, se non è selezionata alcuna impostazione, che i dati non sarà disponibile per l'analisi post hoc. Va notato che dopo ogni periodo di tempo selezionato, i dati vengono congelati a conteggi correnti e salvate sul computer host. La raccolta dei dati ripristina per poizero dopo questo periodo e ricomincia, fornendo una serie di punti temporali dell'intervallo di dati. Bisogna uscire manualmente per terminare la registrazione dei dati.
Studi futuri coinvolgono questo metodo si concentreranno sull'uso del parametro di sosta e le sue varie applicazioni. Inoltre può essere possibile sviluppare un protocollo che consenta di studi per avvengono in un periodo di tempo più lungo, come studi circadiani, fornendo cibo e scambiando spine agar per una più materiale permeabile ai gas 14. I livelli di umidità dovrebbero essere controllati e, come condizioni di asciutto inibiscono locomozione 15. Attualmente, questo protocollo fornisce un metodo preciso, semplice e conveniente per valutare i parametri fondamentali di attività larvale sotto una varietà di condizioni sperimentali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
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