Protocol
1. Preparação de larvas
- Para analisar uma larva desejado para locomoção ou posição preferência, crescer larvas sob condições padrão para a idade desejada para ensaiar 10 utilizando alimentos mosca padrão 11.
- Faça um filtro de malha esticando silk-screen grau de nylon da malha ao longo de um funil. Fixe a malha no pescoço funil com elástico. Colocar o funil num copo.
- Para a coleta de larvas para análise, colher uma espátula cheia de alimentos que contenham larvas de forrageamento do frasco de cultura e lavar com água da torneira RT sobre o filtro de malha, coletando larvas indivíduo diretamente da malha com um pincel 10.
2. Preparação de tubos de ensaio de
- Para se preparar para tapar os tubos de ensaio, ferva cuidadosamente um gel de agar 4% e despeje em uma placa de Petri a uma profundidade de 1,5 cm. Isto irá fornecer uma tomada para um ou outro lado do tubo quando animal é fechado. A solução a 4% é suficientemente denso para evitar larvas a partir de penetrating as fichas.
- Certifique-se de que os tubos são limpos e claros antes da inserção de larva. Se não estiverem, isto pode bloquear movimentos de ser gravada.
- Para garantir larvas tem umidade suficiente para o movimento, prepare um frasco contendo uma pequena quantidade de água quente. Inverta a garrafa, cuidadosamente orientar a tomada em direção a uma pia e aperte suavemente para expulsar a água do tubo de coleta.
- Insira a saída da garrafa no tubo de ensaio. Espremer o frasco para fornecer vapor de água dentro do tubo de ensaio até uma fina camada de condensação aparece na parede do tubo. Vídeo 1 mostra uma larva movendo-se em um tubo com uma quantidade apropriada de humidade.
- Para selar a larva no tubo, remover o gel de 1,5 centímetros de espessura de agar de placa de Petri e colocar sobre uma superfície de rede para permitir o fluxo de ar sob o ágar de modo que um tampão de agar pode ser inserido dentro do tubo. Pressionar uma das extremidades do tubo de ensaio para o gel duas vezes, para inserir dois tampões de gel em uma extremidade.
- Com um paintbRush, colocar uma larva no interior do tubo, aproximadamente, 1,5 polegadas de profundidade e selar o tubo ao pressionar a extremidade mais próxima da larva no gel de agar. A pressão resultante irá forçar para fora o segundo bujão de gel de agar a partir da extremidade oposta e selar o animal dentro do tubo.
- Colocar os tubos no dispositivo MB5 multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM), e ajustar as posições das câmaras de ar de modo a que os animais não pode mover-se para além do alcance dos sensores.
- Para garantir que os tubos de ensaio não deslizar para fora da grelha de leitura de infravermelho do dispositivo durante o transporte, mantenha o tubo no lugar fixando um anel de massa de vidraceiro em torno de cada tubo onde contacta o dispositivo de gravação.
3. Medição Atividade
- Atividade recorde em uma incubadora para evitar leituras imprecisas que possam ocorrer devido a sombras, luzes fluorescentes ou a variações de temperatura no laboratório. Ver Figura 5 para uma disposição sugerida do sistema.
- Situado numa incubadora a 20 ° C (ver Figura 1). Para evitar falsos gravações devido a interferência de fontes de luz incandescentes durante a gravação, desligar as luzes fluorescentes incubadora e usar uma fonte de luz LED separado durante a gravação na incubadora. Realizar um julgamento sem quaisquer animais para assegurar que as condições de luz não aberrante acionar sensores. Não deve haver dados de movimento gravados após este teste.
- Permitir que as larvas se adapte à as definições incubadora a 20 ° C durante 5 minutos antes do início do ensaio.
- Para definir o sistema de DAM para intervalos de gravação desejados (por exemplo, 1 min), garantir DAM software de gravação do sistema é baixado para sediar computador 12 e abra o arquivo DAM sistema antes de conectar a câmara de gravação para a interface PSIU.
- Para definir a freqüência de gravação desejada na qual os dados serão salvos, selecione Preferências e, em seguida, clique em acima ou abaixo da opção de intervalo de leitura para selecionar diferentes intervalos de tempo em que os dadosvai ser armazenado. Por exemplo, seleccionar os intervalos de tempo de leitura 1 segundo a 1 hora.
- Para selecionar parâmetro variável para gravação de dados, escolha preferências e selecione as caixas correspondentes em tipo de dados de saída (contagens, movimentos, posições e habitar, ver Tabela 1). Cada parâmetro proporciona uma única análise da actividade das larvas no interior do tubo.
- Para iniciar a gravação, conecte o monitor a Unidade de Alimentação Interface (PSIU) usando um cabo de telefone CAB6. Conecte o PSIU a uma tomada eléctrica. Uma luz verde indica conexão apropriada.
- Conecte o PSIU através de um cabo Universal Serial Bus (USB) a um Macintosh ou PC com Windows para a gravação de dados. Abra o programa DAM SystemMB1v6x no computador para iniciar automaticamente a gravação de dados.
- Após o tempo de coleta desejado estiver completo, selecione Sair e, em seguida Sair agora na tela da atividade DAM; dados serão salvos automaticamente sob DAM de dados do sistema. Tome este arquivo de dados (por exemplo, monitorar 1) e arraste em uma pasta separada. Isto irá armazenar os dados em bruto a partir do software DAM de modo que eles podem ser posteriormente processados.
4. Preparação de dados para Processing (DAM FileScan)
- Para processar os dados brutos em um formato compreensível abrir o aplicativo DAM FileScan e escolha Selecionar pasta de dados de entrada. Em seguida, escolha a pasta de dados eo arquivo desejado e selecione a opção de digitalização. Por fim, selecione o comprimento bin para o período de leitura desejada. Isto irá organizar os dados brutos em parâmetros definidos pelo operador eo programa irá reportar os dados coletados nesse intervalo particular.
- Selecione o tipo de dados de saída para analisar a definição de movimento desejado (monitor de contagem, movimentos, habitar). De acordo com o menu leituras adicionais, select sum em bin (isto é, se o comprimento do compartimento é maior do que o intervalo de leitura de sistema seleccionado).
- Nomeie o arquivo de forma apropriada e salve. O arquivo será armazenado no mesmo local que a pasta a partir do passo 3.9.
- A fim de recolher movimentos médios, processar os dados brutos gerados a partir do passo 4. Para gerar uma tabela em um programa de planilha, abra o arquivo que foi salvo anteriormente (passo 4.3), e quando a janela Assistente de importação de texto exibida, selecione acabamento para abrir os arquivos de dados em um formato de planilha.
Nota: Dependendo do tipo de dados analisados, a planilha será lido de forma diferente. Tipicamente para medir movimentos do monitor ou contagens, o período de tempo de estudo serão gravados numericamente, enquanto cada tubo leitura individual receberão uma carta designada. Ao visualizar os dados na planilha, colunas KZ representam os slots para tubos de ensaio 16/01, respectivamente. As linhas representam os pontos de dados coletados. - Por exemplo, se move foram recolhidos durante 20 min em intervalos de 1 minuto, em média, as linhas 20 para calcular um número médio de movimentos / minuto e outras medições.
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Representative Results
A Figura 1 mostra os resultados de um estudo de resposta à temperatura de controlo de larvas de terceiro instar, W 1118, utilizando o dispositivo de monitorização, para detectar diferenças na locomoção das larvas em sete diferentes temperaturas. As larvas foram lavadas e colocadas no dispositivo de actividade DAM como descrito acima, e colocado numa incubadora à temperatura desejada. O aparelho foi então deixados a aclimatar ao ambiente durante 5 min antes da gravação começou. Cada larva foi analisada individualmente para locomoção ao longo de um período de 20 min e o número médio de movimentos por minuto foi calculada para cada animal e em média para cada conjunto de 32 animais. Os dados foram analisados e gráficos usando um programa de planilha. As larvas apresentaram aumento significativamente a atividade como temperatura aumentou correspondentemente 5-35 ° C em incrementos de 5 graus, com exceção de uma ruptura nesta tendência, a 20 ° C e 25 ° C.
Para verificar se as diferenças couser detectado LD entre um controlo e um mutante anteriormente descrita como hipoactivo, larvas inactivo (IAV 1) foram testados. Os dados foram analisados como se move / minuto para cada um dos 32 animais e uma média foi então calculada. Como mostrado na Figura 2, a análise indica que as larvas inactivo foram significativamente menos do que um móvel de controlo. Enquanto que são muito menores do que as larvas de terceiro instar, actividade de primeira e segunda larvas também foi mensurável, conforme mostrado na Figura 3. Actividade de larvas de terceiro instar, em cada minuto de a 20 minutos de ensaio foi demonstrado que permanecem relativamente consistente ao longo do período ( A Figura 4).
Figura 1. w 1118 locomoção das larvas foi registrada a temperaturas que variam de 5 ° C -. 35 ° C Each coluna representa o movimento média de 32 animais terceiro instar com jogadas individuais por minuto em média, entre o conjunto. * Todas as médias são significativamente diferentes umas das outras, excepto a 10 ° C e 15 ° C (p = 0,116) (Letras diferentes indicam uma diferença significativa, o teste t de Student).
Figura larvas controle 2. Terceiro instar comparação com inativos (IAV 1) larvas a 20 ° C. IAV 1 larvas exposição significativamente menor mobilidade em relação ao controle.
Figura 3. Medição da actividade de primeira, segunda e terceira instar ao longo de um intervalo de gravação 20 min a 20 ° C. N = 32 para cada fase larval.
Figura 4. Histograma visualizadas número médio de movimentos que ocorrem em cada minuto do intervalo de gravação 20 min. 32 larvas de terceiro instar foram ensaiados a 20 ° C. A linha vermelha representa o número de movimentos por minuto em média para todo o intervalo de 20 min.
Figura 5. Diagrama ilustrando a Drosophila Activity Monitor set-up e sua conectividade com a unidade de interface PSIU e um computador desktop. O interior da incubadora é retratado, mas durante a gravação da incubadora deve ser fechada.
| Descrição | Parâmetro |
| Fichas de dados de cada vezuma larva atravessa uma viga, e conta adicionais são registrados se a larva se move enquanto dentro de um único feixe. | Counts |
| Registra dados somente quando uma mosca reposiciona entre feixes separados, ele não registra movimento dentro de um raio. | Moves |
| Registra a posição animais em cada segundo ao longo de um intervalo de gravação. Estes dados revelam a posição preferencial como uma função de tempo gasto em cada sensor ao longo do curso de um ensaio. | Habitar |
| Essa configuração analisa a posição geral do animal dentro do tubo, o que indica que o sensor está acionando o animal durante o movimento. | Posição |
| Essa configuração determina a freqüência com que os dados recolhidos durante um conjunto período de tempo é salvo no computador de mesa. | Gravação com Intervalo |
Tabela 1. Descrição de measuparâmetros dição (Counts, Move, Dwell e Posições).
Vídeo 1. DAM tubo de ensaio do sistema antes da inserção no dispositivo de operação. A humidade é fornecida por condensação de respiração. Este nível é suficiente para manter a locomoção das larvas ao longo do período de estudo, sem causar o animal flutuar ou nadar. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
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Discussion
Actividade de larvas de Drosophila é influenciada por uma variedade de factores, incluindo o genótipo 8, 13 anos de idade e 2 temperatura ambiente. Embora os métodos videográficos poderosos, capazes de análise altamente detalhadas foram desenvolvidas por aqueles que estudam locomoção 5, este nível de detalhe pode ser supérflua para aqueles que desejam para determinar os parâmetros básicos da atividade. O método descrito aqui utiliza um dispositivo que está disponível em muitos laboratórios, é fácil de operar, gera resultados altamente reprodutíveis, e é controlável, mesmo para aqueles cujo foco de pesquisa primária não é a locomoção. Os exemplos de resultados demonstram que este ensaio pode ser utilizado para detectar alterações significativas na motilidade em larvas submetidas a diferentes temperaturas (Figura 1) e de diferentes genótipos (Figura 2).
Quando as larvas foram medidos a temperaturas compreendidas entre 5 ° C - 35 ° C, a suaactividade aumentou com a temperatura, excepto para uma pausa na tendência entre 20 ° C e 25 ° C (Figura 1). Foi demonstrado por Ainsley e colaboradores que A alimentar larvas de terceiro instar precoce preferem temperaturas dentro de +/- 2 ° C da temperatura típica de 25 ° C cultura. No entanto, quando as larvas entrar vagando meados do terceiro fase instar eles preferem temperaturas um pouco mais frias 2. Esta constatação é consistente com a observação de que a actividade locomotora para larvas de terceira instar é maior a 20 ° C do que a 25 ° C, sugerindo que uma parte dos animais ensaiados estavam na fase errante e mais activo a temperaturas mais frias, e por isso a menos a temperatura de cultura normal, de 25 ° C.
Este método oferece simplicidade, objetividade e throughput robusto, mas há limitações. As aplicações descritas acima representam ensaios que ocorrem ao longo de um período de tempo relativamente curto, em parte porque o atual set-up não prlarvas ovide com uma fonte de alimento. Garantir uma nutrição adequada seria necessário estudar mudanças na atividade durante longos períodos de tempo ou de medir o ritmo circadiano, a longo prazo. Os tampões de agar de 4% podem restringir a troca de gases entre a câmara e o ambiente exterior, o que poderia resultar em que as larvas experimentar condições hipóxicas. No entanto, este não parece afetar a atividade dentro de um período de ensaio de 20 minutos, porque quando foram analisados movimentos médios por minuto de larvas durante cada minuto do período, as larvas não parecem mostrar qualquer mudança na atividade durante o período de gravação (Figura 4) .
Devido a posição do dispositivo continuamente registos que representa uma melhoria de mais captura de movimento em comparação com os métodos não automatizados citados, no entanto, algum movimento faz escapar à detecção. Muito pequenos movimentos de animais pode não desencadear uma resposta a partir deste dispositivo, e as larvas podem mover-se de um modo circunferencial no prazo de uma infrafeixe vermelho sem quebrar vigas vizinhos, resultando em leituras baixas de forma imprecisa. No entanto, uma vez que este tipo de erro seria esperado para ocorrer em todos os grupos de tratamento, é improvável para causar resultados enganosos. Embora as larvas de terceiro instar são o foco principal desta análise, o dispositivo é capaz de medir o movimento do muito menor larvas de primeiro e segundo instar, bem como (Figura 3). Como esperado, o número de movimentos registados por minuto nos animais mais novos é menor do que a dos animais de terceiro instar maiores.
Embora a gama de utilizações para este dispositivo tem ainda de ser demonstrado, há uma variedade de outras adaptações que poderia diversificar as utilizações deste aparelho para estudos envolvendo larvas. Por exemplo, o dispositivo permite uma medida 'de permanência ", que representa o tempo gasto, numa região determinada do tubo. Isso pode fornecer informações valiosas quando empregado em vários Drosophila larval táxis umassays. Ao colocar o aparelho no seu lado de modo que os tubos são orientados verticalmente em vez de horizontalmente, pode-se medir geotaxis larvares. Para medir fototaxia, um gradiente de luz poderia ser estabelecido nos tubos, testando se larvas têm uma preferência para a luz ou a sua ausência. Para estudar a quimiotaxia, um produto químico de teste pode ser colocado em um dos tampões de agar e a posição das larvas pode então revelar determinar a sua preferência para ou evitar o produto químico.
O sistema de monitor permite a análise de diversos parâmetros de movimento, resumidos na tabela 1. Ao selecionar todos os parâmetros durante a instalação do pré-teste (veja o passo 3.6), o experimentador pode escolher qual parâmetro para a análise após o ensaio. No entanto, se qualquer configuração não estiver selecionada, que os dados não estarão disponíveis para a análise post hoc. Deve notar-se que, depois de cada período de tempo seleccionado, os dados são congeladas a contagens actuais e guardado no computador hospedeiro. A coleta de dados redefine depois parazero após este período e começa novamente, proporcionando uma série de pontos de dados de tempo de intervalo. É preciso parar manualmente para terminar a gravação de dados.
Os estudos futuros envolvendo este método vai focar sobre a utilização do parâmetro de permanência e as suas várias aplicações. Além disso, pode ser possível desenvolver um protocolo que permita estudos para ocorrer ao longo de um período mais longo de tempo, tais como estudos circadianos, por fornecimento de alimentos e a troca de tampões de agar para um material mais permeável ao gás 14. Níveis de umidade que precisam ser controlados, bem como, como condições de seca inibir locomoção 15. Atualmente, este protocolo fornece um método preciso, simples, de baixo custo para avaliar os parâmetros básicos da atividade larval sob uma variedade de condições experimentais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
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