Protocol
1. Water Collection en Filtration
- Verzamel zoetwater monsters uit verschillende plaatsen (Figuur 1). Ga monsters door een reeks filters: 1 um filter, 0,2 urn filter, en 30 kDa cutoff tangentiële filter systematisch afzonderlijke eukaryote, bacteriële en virale deeltjes, respectievelijk.
Opmerking: Alleen de zuivering en analyse van de teruggewonnen op de filters 0,2 urn (vrijlevende bacteriën) wordt beschreven in dit rapport, maar soortgelijke aanpak kan worden gebruikt voor andere deeltjes teruggewonnen uit de filters.
2. Bacteriële Concentratie, DNA-extractie en zuivering
- Verwijder de 0,2 pm membraanfilter (s) vanaf het waterfiltratie (schematisch diagram, figuur 2). Vouw de 0,2 um disc filter in de helft en plaats deze in een 50 ml buis met de open kant naar boven. Voeg 5 ml van 1x fosfaat gebufferde oplossing (PBS) en 0,01% Tween, pH 7.4 inde buis. Indien meer dan één filter gebruikt tijdens het proces gebruiken een verschillende buis per filter. Store tube (s) met filter bij 4 ° C totdat verwerkt. Anders, ga verder met stap 2.2.
- Verwijder de 0,2 pm membraan filter van de 50 ml buis met een steriel pincet. Plaats op een petrischaal filter (s) (laat de PBS-buffer in de buis).
- Met een steriel pincet en een steriele schaar, knip de filter in kleine stroken (1 cm x 1 cm). Ontsmet tang en schaar door het weken in 70% isopropanol, vegen met een DNA-oppervlak ontsmettend en spoelen met ultrapuur water van type 1 tussen de verschillende monsters.
- Plaats het filter in reepjes gesneden terug in dezelfde buis van 50 ml. Voeg 10 ml 1x PBS en 0,01% Tween, pH 7,4 om het filter zodat er in totaal 15 ml buffer in de 50 ml buis.
- Voeg 6 schoon wolfraam kralen (3 mm diameter) aan elke 50 ml tube, hebben betrekking op de buis met Parafilm, en vortex krachtig gedurende 20 min (gebruik 50 ml buisjes vortex adapter). Als multIPLE filters zijn uit één monster, de overdracht en het zwembad alle homogenisaat verwerkt in een schone 50 ml buis. Centrifugeer de buizen bij 3300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet en monster bacteriële cellen (~ 1 ml hoeveelheden) in 1,7 ml microcentrifuge buizen. Merk op dat er 5 reactievaatjes per monster.
- Spin down de microcentrifugebuizen bij 10.000 xg gedurende 10 min, en verwijder het grootste deel van de bovenstaande vloeistof naar beneden tot ~ 200 ul merk.
- Bewaar de monsters bij -80 ° C, of naar het bacterieel DNA extraheren met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Tijdens bacterieel DNA-extractie gebruik ofwel PBS of water als een negatieve extractie controle, en E. coli als een positieve controle extractie.
- Omdat DNA van meerdere buizen worden uitgepakt, bundelen parallelle sub-monsters uit hetzelfde monster in een 2 ml buis. Vervolgens een O / N precipitatie met een oplossing bestaande uit 0,1volume van 3 M natriumacetaat, 2 volumes 100% ethanol en 5 ui 5 ug / ul lineaire acrylamide. Meng goed en bewaar monsters bij -80 ° C.
- Centrifugeer bij maximale snelheid (17000 xg) gedurende 30 min bij 4 ° C. Was pellet met 1 ml ijskoude 70% ethanol, drogen in een bio kast niet meer dan 5 minuten en resuspendeer DNA pellet in 34 ui 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
Opmerking: lineaire acrylamide helpt DNA pellet visualiseren na de O / N precipitatie. - Bepaal DNA kwantiteit en kwaliteit met een hoge gevoeligheid fluorescerende nucleïnezuur kwantificatie assay en een microvolume spectrofotometer respectievelijk de instructies van de fabrikant (zie Tabel Materials).
Opmerking: Indien meerdere monsters worden bereid in de tijd kan een ultragevoelige fluorescerende nucleïnezuur assay voor het kwantificeren dsDNA en plaat-gebaseerde fluorometer / spectrofotometer worden gebruikt.
3. DNA Bibliotheek Voorbereiding
- Enzymatisch fragment één nanogram van bacterieel DNA met een transposon-gebaseerde werkwijze (tagmentation). Voeg adapter en index sequenties op gefragmenteerd DNA volgens de instructies van de fabrikant. Onder tagmented monsters 12 cycli van PCR zoals is aangegeven in de instructies van de fabrikant, waarna de sequentie indexen zijn opgenomen.
4. Geautomatiseerde Gel Grootte Selectie
- Skip standaard post-PCR clean-up stap in de instructies van de fabrikant beschreven (zie tabel van Materialen). Maat selecteren post-PCR monsters direct behulp van een geautomatiseerd gel gebaseerde grootte selectie platform.
- Voeg 3,5 gl laadbuffer aan elk monster.
- Volgens het protocol van de fabrikant, laadt de monsters op de elektroforese werkstation, het opgeven van een grootte-selectie doelstelling van 500-800 bp, in een 300 ul extractionenvolume, met behulp van een pre-cast 1,5% agarose cassette.
- Concentreer de ruwe uitvoer materiaal (300 ul) tot 25 pi via ethanolprecipitatie.
Opmerking: U kunt ook gebruik maken van de elektroforese werkstation om de concentratie te automatiseren voor grotere aantallen monsters via filter plaat en vacuümspruitstuk.- Neerslag ruwe elutievolume toepassing van 0,1 volumina van 3 M natriumacetaat, 2 volumes 100% ethanol en 5 ui 5 ug / ul lineaire acrylamide. Meng goed, plaats monsters bij -80 ° CO / N. Centrifugeer de monsters bij 17.000 xg gedurende 30 min.
- Gooi supernatanten en ga verder met DNA pellet te wassen met 1 ml ijskoude 70% ethanol.
- Centrifugeer monsters weer bij 17.000 xg gedurende 30 min, gooi supernatant, drogen en tenslotte resuspendeer DNA pellet in 25 ui 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
- (Optioneel) Gebruik 1 ui van DNA-bibliotheken grootte geselecteerd met de geautomatiseerde gel grootte selectie platform om een vijf makenvoudige verdunning met Tris-EDTA-buffer, pH 8,0. Analyseer bibliotheken met een chip gebaseerde capillaire elektroforese instrument dsDNA kwaliteit analyse volgens instructies van de fabrikant.
5. Bibliotheek Normalisatie en Sequencing
- Ga verder met monsters met behulp van de bibliotheek normalisering kralen (inbegrepen in de transposon-gebaseerde voorbereiding bibliotheek kit) zoals beschreven in het klaarmaken van de fabrikant te normaliseren.
- U kunt ook meten dsDNA bibliotheken met een hoge gevoeligheid fluorescerende nucleïnezuur kwantificatie test, gevolgd door het poolen bij equimolaire verhoudingen tot een uiteindelijke dsDNA concentratie van 2 nM bereiken. Ga naar bibliotheken met 10 ui gepoolde bibliotheken en 10 pl 0,2 N NaOH denatureren, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verdun gedenatureerd bibliotheken met hybridisatie buffer (geleverd bij de transposon gebaseerde preparaat kit) tot een eindvolume van 1 ml en de concentratie van 11:05.
- Load monsters in een next-generation sequencing platform door het volgen van standaard sequencing protocollen van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA-concentratie, en Quality Assessment
Bacterieel DNA-concentraties varieerden 0,01-0,11 ng / ml per watermonster van de verschillende waterscheiding sites (Tabel 1). DNA geïsoleerd uit bacteriële fractie had A 260/280 en 260/230 A verhoudingen van 1,4-1,8 en 0,3-1,6, respectievelijk. Hoewel sommige van de A 260/230 ratio relatief laag werd geen duidelijke inhibitie waargenomen in de bereide bibliotheek en andere afgeleide toepassingen. Deze toepassingen onder PCR en qPCR testen gericht 16S rRNA en CPN 60 en daaropvolgende amplicon sequencing (gegevens niet getoond).
Ranger Technology
DNA-bibliotheken bereid met een transposon gebaseerde methode en gel op grootte geselecteerd met een high-throughput geautomatiseerd platform leverde een strakke reeks DNA-fragmenten van 500-800 bp (figuur 3). Dit alternatief protocol leverde concentraties variërend 0,3-3,4 ng / pl (Tabel 1). Met behulp van een gemiddelde van 650 bp van DNA-fragment grootte, gemiddelde concentratie voor deze bibliotheek was 3,81 nM van het uitgangsmateriaal. Bibliotheken werden consequent grootte geselecteerd in alle DNA-bibliotheken bereid uit meerdere waterscheiding locaties.
DNA Sequencing QC Parameters
DNA sequentiebepaling van de bibliotheek op de Illumina MiSeq genereerde een cluster dichtheid van 1,198 K / mm2. Het percentage van de cluster passeren filters was 84,2% met een geschatte opbrengst van 9,2 Gb. Bovendien, 7,4 Gb of 82,8% van de leest had een kwaliteit score ≥30. Het gebruik van een geautomatiseerde gel grootte selectie platform consequent resulteerde in geschikte opbrengsten en geminimaliseerd de clustering van ongewenste fragmenten onder 200 bp.
<br /> Figuur 1. Water monsters werden verzameld uit de stedelijke (A) en landbouw (B) beïnvloed stroomgebieden.
Figuur 2. Schematische weergave van de methoden die worden gebruikt om transposon-gebaseerde DNA-bibliotheken van zoetwater monsters te genereren. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 3. elektroferogrammen van de DNA-bibliotheken gegenereerd uit zoetwater monsters: (A) na PCR DNA-bibliotheken voor grootteselectie en (B) DNA bibliotheken grootte geselecteerd met het geautomatiseerdegel grootte selectie platform (doelbereik: 500-800 bp). Alle monsters werden vijfvoudig verdund met TE-buffer.
| Milieumonster | Bacteriële DNA concentratie (Ng / ml) * | Een 260/280 | Een 260/230 | DNA-concentratie (ng / ul) voordat grootte selectie, volume: 25 pi | DNA-concentratie (ng / ul) na grootte selectie, volume: 25 pi |
| 1 | 0.11 (0.16) | 1.8 | 1.4 | 27 | 1.2 |
| 2 | 0.11 (0.20) | 1.8 | 1.3 | 27.4 | 3.3 |
| 3 | 0.10 (0.37) | 1.8 | 1.6 | 19.5 | 3.4 |
| 4 | <td> 0,04 (0,04)1.5 | 0.5 | 24.4 | 1.6 | |
| 5 | 0.11 (0.13) | 1.7 | 1.0 | 26.1 | 1.1 |
| 6 | 0.05 (0.03) | 1.5 | 0.7 | 15.2 | 0.4 |
| 7 | 0,01 (0,01) | 1.4 | 0.3 | 15.1 | 0.3 |
| 8 | 0.03 (0.05) | 1.6 | 0.7 | 17 | 0.9 |
| * De waarden geven dsDNA concentratie met een hoge gevoeligheid fluorescerende nucleïnezuur kwantificatie assay. Getal tussen haakjes staat voor concentratie met behulp van een microvolume spectrofotometer. | |||||
Tabel 1. kwaliteit en kwantiteit beoordeling van DNA geëxtraheerd uit milieu zoetwater monsters en bibliotheken transposon gebaseerde vóór en nageautomatiseerde gel grootte selectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De aanwezigheid van de adapter dimeren en clustering van kleine insert maten voorkeur worden gesequenced in de huidige platforms vertegenwoordigen een afname van de bruikbare opbrengst en onderbenutting van de apparatuur capaciteit 15. Het gebruik van kralen slaan methoden gekoppeld met een transposon gebaseerde benadering bibliotheken te bereiden, kan leiden tot DNA afschuiving in vergelijking met andere werkwijzen voor extractie 4,5. Niettemin zijn alle extractie- en bibliotheek bereiding mogelijk biases voeren om de verdeling van sequentiebepaling leest 8,16. Experimentele waarnemingen behulp van een automatische nucleïnezuurextractie platform, gecombineerd met een ligatie gebaseerde methode, niet lijken de overmaat adapter dimeren van shotgun bibliotheken verwijderen (gegevens niet getoond). Deze studie maakte gebruik van een aangepast protocol om bibliotheken van milieu monsters op grootte selecteren DNA-fragmenten te bereiden binnen een zeer specifiek bereik, waardoor de overdracht van adapter dimeren of kleine minimaliserenDNA-fragmenten. Het gebruik van een geautomatiseerde gel maatbepaling platform gegenereerd reproduceerbare sporen van DNA-bibliotheken binnen een bepaald bereik van 500-800 bp (figuur 3). Terwijl een groter aantal ruwe leest (~ 1.500.000) werden verkregen met standaardbehandeling (paramagnetische beads 0.5x verhouding) dan andere opschoning (dwz 2 keer met 0,5x ratio) en het gemodificeerde protocol beschreven, slechts 55% van die leest per monster waren groter dan 225 bp. Het percentage leest per monster met het gemodificeerde protocol gegenereerd ten minste 75% van leest groter dan 225 bp. In de standaardbehandeling, het grote aantal leest aangegeven een oververtegenwoordiging van korte leest de bibliotheek. Fragment grootte geselecteerd met paramagnetische kralen (standaardbehandeling) gemeld variabel vergelijking met gel grootteselectie 17 nadert. Deze gewijzigde protocol gegenereerd informatiever leest dan paramagnetische kralen. Het gebruik van gel selectie bibliotheken bouwen eenlso wees op een reductie in de incidentie van chimeren van ~ 5% tot 0,02% 9.
Kritieke stappen in het huidige protocol omvatten overwegingen voor normalisering van de input-DNA, hoeveelheid DNA in de bibliotheken, en de chemie van de PCR master mix. Afhankelijk van de startingang DNA-concentratie, kan het tijdrovend te meten en verdun het DNA tot een hoeveelheid van 1 ng vereist door het transposon gebaseerde methode naar en dus snellere automatiseerbare-bead benaderingen ook gebruikt voor het invoeren van DNA normaliseren kan worden beschouwd in de eerste steekproef voorbereiding 18. Volgende tagmentation en incorporatie van indexen, monsters waren direct grootte geselecteerd met de elektroforese werkstation in deze studie beschreven. Een kritische stap in deze procedure is de hoeveelheid DNA naar het systeem geladen. De minimale monster DNA concentratie optische detectie afhankelijk van de aard van het monster (amplicon versus shotgun sequencing). Intrinsieke herstel opbrengsten zijn geweestgetoond op te houden met een low-input monsters en het herstel efficiëntie> 75%. De laagste hoeveelheid DNA die kunnen worden gedetecteerd door geautomatiseerde gel grootte selectiesysteem beschreven is 1,5 ng totaal DNA (Nesbitt, M. en Slodoban, J., 2014, ongepubliceerde gegevens). Toch is optische detectie van het monster niet verplicht om de grootte selectie uit te voeren, zoals dual kleurstof markers worden gebruikt om waar te bepalen hoe groot selecteer een bepaald doel. Voordat bibliotheken bereid uit milieu-monsters in het platform geladen waren, werd DNA-concentratie gekwantificeerd met behulp van een fluorometer. Een relatief beperkt aantal DNA-concentraties werd gedetecteerd in post-PCR monsters (Tabel 1). Hoewel deze monsters bevatten een mengsel van zouten, dimeren, DNA polymerase, geamplificeerd DNA milieu- en geheime reagentia 19, deze concentraties en die minstens 252 maal hoger dan de gerapporteerde laagste hoeveelheid DNA detecteerbaar met de elektroforese werkstation. Normaal gesproken, de grootte selectie van DNA fraggen zou in een bufferoplossing in plaats van de PCR master mix worden uitgevoerd. Hoewel informatie over PCR Master Mix in dit protocol was geheim van de fabrikant werden inleidende proeven migratie van dubbele kleurstof markers in het mengsel spoor (gegevens niet getoond). Een buffer van hoge ionensterkte in de PCR master mix de elektroforetische mobiliteit van het monster veranderen en daardoor deze variabele moet worden ondergebracht. De geautomatiseerde gel selectie platform in deze studie beschreven blootstelt een optie om aan te geven wanneer een monster is in de hoge ionische sterkte. Als deze optie wordt gebruikt, worden vervolgens veranderde elektroforetische mobiliteit bochten en uitgestelde band volgen parameters gebruikt. Daarom is het mogelijk dat de chemie van de PCR mix invloed op de laadbuffer en markers zal hebben, en beïnvloedt migratie van DNA-fragmenten in de gel.
Er zijn een aantal systemen commercieel verkrijgbaar voor automatische of semi-automatische gel selectiescherm. Dezeinstrumenten ook scheiding, terugwinning en documentatie in minder dan 1 uur. Toch zijn er beperkingen als het gaat om aantal monsters dat deze systemen kan omgaan, en de kosten in verband met verbruiksgoederen 17,20. In dit verband, de hier beschreven techniek behandelt aspecten van zowel agarosegel grootteselectie en analyses. Maximaal 96 monsters kunnen worden geselecteerd via een enkele run, terwijl maximaal 192 monsters kunnen worden gekarakteriseerd met hoge resolutie elektroforese. Bovendien kan het instrument ook de generieke vloeistof handelingen gebruikers verwachten van een geautomatiseerde werkplek te voltooien.
Ruwe elutievolume van dit protocol varieert 100-400 pl, afhankelijk van het doelbereik (25 bp tot 40 kb). Hoewel dit aspect van het instrument kan worden opgevat als een beperking moet worden opgemerkt dat DNA bibliotheken geëlueerd met een volume van 300 pi een gemiddelde concentratie van 301 pM zouden hebben (gegevens niet getoond). Deze resulterende waarde vertegenwoordigt een 26-maal hoger dan de vereiste uiteindelijke concentratie voor het rangschikken in een MiSeq platform (~ 11:05). In de onderhavige studie, ethanolprecipitatie vertegenwoordigt extra stap in de tijd toegepast in de bibliotheek bereiding. Momenteel kan het elutievolume bovendien verminderd met behulp van een on-deck vacuumfiltratie stap die commercieel filterplaat en een vacuüm spruitstuk dat past op het dek (upgrade) gebruikt. Met behulp van deze opstelling wordt het ruwe elutievolume overgebracht naar het filter plaat, geconcentreerd en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 25 ul (Slodoban, J., 2014, persoonlijke communicatie). Voor deze studie werd DNA precipitatie uitgevoerd om de werkstroom overeenstemming met de input benodigde volume voor normalisatie monster stap zoals beschreven in de transposon gebaseerde kit houden.
Deze gewijzigde techniek kan van toepassing zijn op DNA of cDNA-bibliotheken bereid uit andere milieu monsters zoals zeewater, afvalwaterzuiveringsinstallatie, sediment, bodem, of microbiële matten zijn. De auto-Gedekt gel grootte selectie platform hier gemeld kan worden aangebracht met minimale aanpassingen die niet alleen voor Illumina sequencing platforms, maar ook voor andere next-generation sequencing platforms, waaronder Roche 454, Life Technologies, en de Stille Oceaan BioSciences. Speciale overwegingen deze technologie aan te passen aan andere platforms omvatten laadhouder capaciteit (51 pl), lijmen referenties of markeringen en percentage agarose gel cassette (afhankelijk doel fractie). Deze high-throughput geautomatiseerde gel grootte selectie techniek is een onderscheidende vorm van zuivering en is geschikt voor lage kosten elektroforetische karakteriseringen. Andere toepassingen die kunnen profiteren van deze technologie zijn onder andere RNA-Seq projecten, lange fragment sequencing (inclusief functionele metagenomica), gensynthese, stuurman paar bibliotheek bouw, de novo en complexe genoom sequencing, restrictiedigest analyse en genotypering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jared R. Slobodan en Matthew J. Nesbitt zowel aandelen houden van Coastal Genomics, een particulier British Columbia corporatie het aanbieden van de Ranger Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. This system has been discontinued. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation with Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Includes loading buffer and cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf refrigerated centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. This product has been discontinued. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq system | Illumina | SY-410-1003 |
References
- Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
- Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
- Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
- Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
- Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
- Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320 (2013).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18 (2011).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18 (2009).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
- Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
- Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
- Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
- Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501 (2014).
