Introduction
Transgena musmodeller har varit avgörande för att utvärdera patofysiologin av Alzheimers sjukdom (AD), liksom potentialen för terapeutiska ingrepp. Kognitiva uppgifter, såsom Morris vattenlabyrint (MWM), används ofta med dessa modeller för att identifiera de molekylära korrelat till minne underskott och för att bedöma effekten av prekliniska droger. Det är dock viktigt att det dynamiska omfånget av den kognitiva uppgiften vara tillräckligt bred för att upptäcka subtila behandlingseffekter. Med musmodeller av AD, kognitiva brister är vanligtvis åldersberoende, och möss visar progressiva nedgång i prestanda (t.ex. 1). Användning av en känslig kognitiv uppgift kan tillåta detektion av subtila skillnader tidigare i djurets liv, och därigenom minska kostnaderna i samband med åldrande djur. Till exempel, minska antalet utbildnings prövning i hippocampus beroende Barnes maze 15-5 ökade svårigheten av uppgiften, vilket resulterar i detection underskott i 3xTg modellen vid en tidigare ålder än tidigare rapporterade 2. Tidigare upptäckt av underskott erbjuder inte bara en betydande tids- och kostnadsbesparingar, det ökar också sannolikheten för att de molekylära förändringar som ligger bakom kognitiva brister kan identifieras.
En faktor som påverkar känsligheten hos kognitiva uppgifter är den genetiska bakgrunden stam av musmodellen. Till exempel, BALB / c-möss uppvisar överlägsen prestanda i inlärnings- och minnesuppgifter jämfört med andra stammar, såsom C57BL / 6 3. F1 FVB / N x 129S6 bakgrund används för två av de mest används modeller av AD, den Tg2576 och RTG (TauP301L) 4510 modeller. Denna stam uppvisar överlägsen inlärningsförmåga i MWM förhållande till andra stammar, inklusive B6 / SJL-möss 4. På grund av denna överlägsna inlärningsförmåga, kan användningen av en ensam sond efter omfattande utbildning mask gruppskillnader till följd av överutbildning. Dessutom har sensitivity sondförsök kan vara åldersberoende. Vi har tidigare visat att tidigare sond prövningar efter begränsad dolda plattform utbildning, är mer känsliga för skillnader i unga Tg2576 jämfört med unga transgen negativa kull kontroller än är sond försök införas efter mer omfattande utbildning 5. Däremot sondförsök efter omfattande utbildning är mer känsliga i äldre (20-25 månader) Tg2576 möss jämfört med äldre syskon än är tidigare sondförsök 5. Genom interspersing sondförsök hela utbildning, är sannolikheten för att en känslig rättegång kommer att identifieras ökat, särskilt om längd tester utförs och känsligheten hos en viss sond rättegång är åldersberoende. Figur 1 visar den överlägsna prestandan hos F1 FVB / N x 129S6 möss enligt protokollet optimerad för denna stam jämfört med möss av B6 / SJL bakgrund utbildas enligt ett protokoll med mer omfattande utbildning.
Den MWM äri allmänhet tänkt att ge tillförlitliga åtgärder som är reproducerbar över både tid och laboratorier 6. Till exempel var det primära protokoll som ursprungligen användes av vår Minnesota laboratorium 1,7 framgångsrikt med mindre modifieringar på West Virginia University 8. På samma sätt har motsvarande nivåer av nedskrivnings observerats i RTG (TauP301L) 4510 möss i förhållande till kontrollkullsyskon om inhysta under patogenfria eller konventionella betingelser 9. Emellertid kan testmiljön påverkar känsligheten hos MWM uppgiften. Faktorer som rumsbelysning, luftintag, temperaturgradienter och ljud bidrar till miljö signaler 4 som i slutändan kan påverka prestanda. När vår Minnesota laboratorium och vivarium flyttades till en ny byggnad, upp till en minskning av vild-typ prestanda 38% observerades, att avsevärt minska det dynamiska omfånget av uppgiften och förmågan att upptäcka transgen relaterade underskott. Denna förändring i performance inträffade trots utforma provningsrummet vara av motsvarande storlek och konfiguration, och med samma tillämpade visuella referenser. En "re-optimering" av det ursprungliga protokollet krävdes för att öka det dynamiska omfånget av MWM uppgift i den nya testmiljön.
Här ursprungliga protokoll skräddarsys för användning med F1 FVB / N x 129S6 bakgrund 5 beskrivs. Eftersom vissa studier tyder stress associerad med dålig MWM prestanda 10 och pre-hantering kan lindra denna stressinducerad underskott i prestanda 11, var en pre-hanteringsprotokoll utformade för att acklimatisera mössen till införande och avlägsnande av poolen före MWM testning . Efter pre-hantering, möss genomgå synlig plattform utbildning, där en upphöjd plattform är märkt med en flagga. Synlig plattform utbildning används för att identifiera möss med prestandaproblem i samband med motoriska avvikelser. Använda uteslutningskriterier som beskrivs i protocol sektion, prestations inkompetent möss avlägsnas från efterföljande undersökningar av dolda plattform utbildning och sondförsök. Nedskrivningar i dolda plattform utbildning och sondförsök tolkas som kognitiva brister eftersom sensorimotorisk prestanda räknas ut av data. Efter fullbordan av synligt plattforms utbildning, möss börjar gömda plattformen utbildning där plattformen är nedsänkt i vatten och förblir i samma position i förhållande till externa signaler. Försök där plattformen avlägsnas (sondförsök) varvas hela dolda plattform utbildning för att bedöma inverkan av ytterligare utbildning. Eftersom sondförsök förekommer i början av varje dag, innan ytterligare dolda plattform utbildning, sondförsök mäta förmågan hos djuret att komma ihåg placeringen av plattformen efter en 20 timmar dröjsmål betraktas som ett mått på referensminnet 12. Slutligen, hur denna ursprungliga protokollet åter optimeras när förändringar i testmiljöstörs reglerprestanda beskrivs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer genomfördes i enlighet med de normer för Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och godkänts av West Virginia University s IACUC.
1. Pre-hantering
- Ställa in Pool
- Prop före hantering poolen så det höjs till en bekväm höjd.
- Placera 2 liter vatten (21 ° C) i pre-hanterings poolen till en nivå av ca 1 cm.
Obs: Lägg inte till färg.
- Procedur
- Bring mössen från vivarium till testrummet.
- Kontrollera ämnet identifiering (ämnesnummer, svans tatuering, öronclipsen, osv.).
- Mark musens svans med en permanent markör för att skilja möss i bur som har genomgått före hantering testning från dem som återstår att testas. Markera alla möss i en bur med samma färg.
- Placera en mus i överförings bägare under approximately 5 sek. Sedan försiktigt hälla musen ur bägaren i pre-hanteringspool.
- Med användning av en timer, tillåter musen för att stanna kvar i poolen för 20 sek.
- Efter 20 sekunder, försiktigt placera skopan (utan att vinkla det) framför musen. Tillåter korthet musen för att utforska scoop, och om det behövs, uppmuntra musen för att få på de senaste nyheterna genom att försiktigt dra skopan under musen medan långsamt lyft. Var noga med att inte skrämma möss med skopan.
- När musen är i scoop, transportera det tillbaka till anläggningen buren.
- Upprepa dessa förfaranden för varje mus i buren en gång per dag under 10 dagar. Med jämna mellanrum (t.ex. efter varje djur), plocka upp fekal Boli och sängkläder från poolen med hjälp av ett nät.
- Skölj överförings bägaren med vatten med jämna mellanrum (t.ex. efter slutförandet av en bur av möss).
- När detta är gjort, skölj överförings bägaren med vatten flera gånger, dumpa ut vatten frånpoolen, och skölj poolen approximativt två gånger med vatten.
2. Synlig Plattform Träning
- Ställ in mus Performance mjukvara t.ex. Viewer (se tabell av material).
- Kalibrera videon att passa dimensionerna av labyrinten under "Configuration" - "Filter och objekt" -fliken.
- Ställ filter så att programmet kan skilja en mus från bakgrunden.
- Justera "känslighet" under "Bakgrund filter" område så att spårningsprogram identifierar djuret.
- Klicka på "acceptera" alternativet när mjukvara identifierar djuret. Välj "Redigera" för att blackout områden utanför labyrinten området.
- Välj lämplig "djur filter" och "min. djurets storlek ".
- Skapa Run Ark <ol>
- Skapa en körning ark listar varje mus, varje potentiell plats, och ett utrymme för anteckningar som innehåller information om avvikande beteende.
- Förutbestämma platser för den synliga plattformstestet som är samma för varje grupp av möss. Sålunda, för det första försöket, i förväg bestämma att plattformen kommer att placeras på den sida som är motsatt där musen placeras i labyrinten, på höger sida nära väggen. För det andra försöket, för-avgöra att plattformen kommer att placeras på en annan plats längs den bakre väggen för varje mus, och att detta kommer att fortsätta för var och en av de sex försöken.
- Häng gardiner runt i rummet så att eventuella ledljud skyms.
- Placera badkaret så det matchar konfigurationen i mjukvara genom att säkerställa en labyrint matchar med konfigurationsinstallationen på "Configuration" - fliken "Zon Definition". Obs: Det hELPS att säkerställa badkaret är på rätt plats före fylla den med vatten som badkaret är inte lätt flyttas en gång fylld.
- Fyll badkaret med kranvatten, och med hjälp av en termometer, säkerställa att vattentemperaturen är omkring 21 ° C. Se till att vattnet håller sig inom en grad av denna temperatur under provning i kallare vatten kan påverka prestanda, särskilt när man använder åldrade möss 8.
Obs: Lägg inte till färg. - Med hjälp av förutbestämda platser, placera plattformen, som har en monterad flagga som når en höjd av 13 cm och är 4,5 cm x 4,5 cm med en djärv "S" formade tecken präglat på den, i den första platsen i badkaret så att det är ungefär 1 tum ovanför vattenytan.
- Ta den första mus från buren, kontrollera ämnet identifiering, markera svansen med hjälp av en permanent markör för rätt färg, och plats i bägaren.
- Försiktigt placera mouse i badkaret, starta timern och se till att spårningsprogram spårar djuret. Låt musen upp till 2 minuter för att lokalisera plattformen. När musen lokaliserar plattformen, tillåta musen 20 sek på plattformen.
- Om djuret finner plattformen och fortsätter att hoppa eller falla av, skopa musen och placera musen på plattformen. Om musen fortsätter att hoppa eller falla av plattformen, håller musen på plattformen, så musen får reda på att kvar på plattformen leder fly från badkaret.
Obs: Musen bör förbli på en plattform för en sammanlagd tid av 20 sek; sålunda, om musen hoppar av efter 5 sekund, är den mängd tid som är kvar på plattformen 15 sekunder och återställs inte till 20 sek. - Om djuret inte hitta plattformen i 2-minutersperiod, skopa musen och placera den på plattformen under 20 sekunder.
- Efter 20 sekunder på plattformen, ta bort musen från plattformen som görs i förväg hantering utbildning och placera musen i the uppvärmd bur fodrade med hushållspapper och värmdes till ~ 31 ° C med en värmedyna och värmelampa i 30 sekunder. Utför regelbunden utvärdering av kroppstemperaturen med en rektal termometer för att säkerställa att vissa stammar av möss eller möss vid en viss ålder är inte differentiellt mottagliga för hypotermi induceras av exponering för vatten.
- Efter 2 min till innehavet bur med värmelampa, överföra musen för att innehavet bur med bara en värmedyna, men ingen värme lampa, för att återhämta sig mellan försöken. Slutligen, placera alla möss från en enda hem bur i samma anläggning bur under testningen.
- Rengör labyrint av skräp med en netto efter varje mus har genomfört en rättegång, för att störa lukt ledtrådar.
Obs: Plattformen kommer att förbli på samma plats för varje mus under en enda försök och kommer att varaflyttats till andra förutbestämda platser för efterföljande försök. Detta görs för att säkerställa att möss 1) lär det finns en plattform för att fly från, 2) simma direkt till den synliga plattformen, vilket visar intakt visuell kompetens, och 3) har inga motoriken.
Obs: Användningen av en hand timer kan också vara fördelaktigt att säkerställa riktigheten av mjukvara.
3. Morris Water Maze Hidden Plattform Utbildning
- Set Upp rummet
- Häng upp gardiner i rummet för att dölja ledljud i laboratoriet.
- Placera ledtrådar strategiskt på gardinerna. Se till att signaler är stora och innehåller kontrasterande färger (ex .: svartvitt) för bättre synlighet. Häng ledtrådar på distans och höjd där de är synliga för möss inifrån badkaret. Obs: De signaler är statiska och inte flytta under testningen.
- Ställ in mus Performance mjukvara
- Kalibrera videon att passa dimensionerna av labyrinten under "Configuration" - "Filter och objekt" -fliken.
- Ställ in filter så att programmet kan skilja mössen från bakgrunden.
- Använd samma förfarande som beskrivs i det synliga plattformen test (steg 2.1.2.1-2.1.2.3) för att ställa upp filter för Morris vattenlabyrint dold plattform utbildning.
- Skapa fyra lika kvadranter inne i labyrinten
- Klickaden "Ellipse" alternativ under fliken "Zon Definition" först, och skapa en cirkel som matchar labyrinten på skärmen. Obs! På den här fliken är den faktiska labyrinten inrätta visas, så det ger möjlighet att matcha datorkonfiguration med själva labyrinten installationen.
- Klicka på "rektangel" och skapa fyra lika kvadrater. Placera dessa rutor på skärmen för att skapa fyra lika kvadranter inom den nyskapade cirkeln.
- Skapa plattformarna i labyrinten.
- Välj "Ellipse" alternativet, och skapa en cirkel storleken på den plattform som ska användas. Obs: Placera plattformen i labyrinten i förväg kan vara till nytta för att skapa en ellips den exakta storleken på plattformen.
- Placera den nyskapade plattformen plats i mitten av målet kvadranten. (Det rekommenderas att nämna det här objektet "mål" för att skilja rätt plattformar från resten). Kritiska steg: I rutan bara below "Grid", välj "stopp" alternativ under "trigger" för målplattform. Detta kommer att orsaka programmet att sluta när musen når plattformen.
- Skapa tre andra identiska plattforms områden, och placera dem i de exakta platser i andra kvadranter. Välj inte "stopp" i "trigger" alternativet.
- Skapa Run Bladen
- Skapa en körning ark listar varje mus, varje prövning, en plats att skriva ner tiden för att nå plattformen, och ett utrymme att notera avvikande beteende (tabell 1).
- Förhands bestämma frisättningspunkten för varje mus i en pseudoslump sätt. Använda pseudoslumpmässigt urval, så att avståndet till plattformen är lika varje dag, var och en av de fyra platser används lika, och vinkeln från början till plattform (dvs.., Från vänster eller höger) balanseras inom och mellan dagar.
Anm: placeringen av plattformen på flyktark för att säkerställa placeringen av plattformen rör sig inte från den ursprungliga positionen. Se till att plattformen är i mitten av en av de fyra zoner som har skapats på spårningsprogram.
Obs: Om längd tester genomförs i olika åldrar, flytta plattformen till en ny plats på varje ålder.
- Ställa in Maze
- Justera antingen vattnet labyrint eller kameran så att det är en match mellan labyrinten och konfigurationsinstallationen på "Configuration" - "Zon Definition" -fliken.
- Märk fyra osedda kvadranter av labyrinten (N, S, E, W). Kontrollera att dessa matchar med konfigurationen i spårningsprogram för att säkerställa möss släpps från de korrekta startpunkter.
Kritiska steg: Placera dessa etiketter utanför labyrinten och ut med tanke på en simning djur med tanke på att ledtrådar inom labyrinten utgör en icke-rumslig, icke-hippocampus beroende uppgift. - Fyll labyrinten med kranen water (ca 21 ° C), så att plattformen är ungefär 5 mm under ytan av vattnet.
- Placera plattformen i den förutbestämda platsen.
Obs! Placeringen av plattformen kommer att förbli densamma för alla möss testas i alla dagar och prövningar. - Använd giftfri vit tempera färg för att göra vattnet ogenomskinlig. Gör detta för att säkerställa att den övre delen av plattformen är osynlig från djurens ögonhöjd medan simning.
- Procedur
- Ta musen från buren, markera svansen med hjälp av en permanent markör för rätt färg, och placera i bägaren.
- Häll försiktigt musen i labyrinten, så att den går in mot väggen. Notera: Varje mus kommer att placeras i samma startpunkt för en unik prövning.
- Vid den initiala frisättningen av musen, börjar timern och stå i ett område där testaren är inte lätt synliga genom mössen. Se till att djur spårningsprogram är korrekt spåra djuret. När djuret når plattformen, låt den ligga kvar på plattformen under 15 sek.
Anmärkning: Detta gör det möjligt för djuret att orientera till dess rumsliga läge i rummet. - Efter 15 sekunder på plattformen, ta bort djuret från labyrinten och tillbaka musen till den uppvärmda buren.
- Om musen hittar plattformen och fortsätter att hoppa eller falla av innan 15 sekunder, skopa musen och placera den tillbaka på en plattform för resten av 15 sekunder så att musen lär sig att associera plattform med flykten.
- Om musen inte hitta plattformen inom 60 sekunder, försiktigt skopa musen och placera den på plattformen. Låt det förbli på plattformen under 15 sekunder, sedan bort djuret med skopan och föra den tillbaka till den uppvärmda buren.
- Rengör labyrint av skräp med ett nät för att störa lukt ledtrådar.
- Upprepa dessa förfaranden för de återstående mössen i gruppen. Således, för att testa dagar 4 till 9, genomföra fyra försök med dolda plattform tåging per dag med ca 20 min mellan varje försök.
- Ändra startplats pseduorandomly för varje försök. Således, under försök 1, släppa alla möss från samma startposition, sedan upprepa proceduren från en annan utgångsläge för de följande försöken. Varje dag, varierar frisättningspunkterna för att säkerställa djur inte utvecklar en icke-rumslig, icke-hippocampus beroende motorisk strategi. Till exempel, om möss frigörs från N, S, E och W punkter på dag ett, inte släppa dem i samma ordning följande dag.
- Under dold plattform utbildning, använder djuret mjukvara för att mäta latens för att nå plattformen, våglängden hos djuret, och andelen tid eller avstånd djuret tillbringar i varje labyrint kvadrant. Skaffa dessa mätningar från "Water labyrint" -fliken under "Experiment listan" och kan exporteras direkt till ett Excel-ark.
Obs: Användningen av en hand timer säkerställer riktigheten av spårningsprogramvara.
4. Sond Trials
- Ställ in mus Performance mjukvara
- Använd samma förfarande som i Morris vattenlabyrint gömda plattformen förfarande (stegen 3.2.1-3.2.4.3) med ett undantag. Kritisk steg: För prob prövningar se "stopp" alternativ för "trigger" är avstängd under sondförsök. Detta kommer att förhindra programmet från att stoppa när en mus korsar plattformsområdet.
- Skapa Run Bladen
- Skapa en körning ark listar varje mus, varje prövning, och ett utrymme att notera avvikande beteende. Förhands bestämma utsläppet under sond prövningar så att de alternerar mellan de två sidorna mittemot plattformen. Således, för-bestämma frisättningspunkterna så att möss inte frigörs från de två sidorna som är närmast plattformen.
- Procedur
- Genomföra sondförsök liknar dolda plattform utbildning, med utomning att ingen plattform är i labyrinten.
- Släpp en mus från en förutbestämd utsläppspunkt. Under sonden rättegången, ta bort plattformen och musen har 60 sekunder att simma i labyrinten.
- Under provningen, genomföra 4 sondförsök. Ändra utsläppet av mössen mellan sonden prövningar. Sålunda ändrar frisättningspunkten av den aktuella sond prov från den för den tidigare sond försöket.
- Under sondförsök, använd djurspårningsprogramvara för att spåra våglängden för det djuret, den procentandel av tiden som djuret tillbringar i varje kvadrant av labyrinten och antalet gånger ett djur simmar över det tidigare platformed området. Skaffa dessa mätningar från "Dataanalys" -fliken och "Water labyrint" -fliken under "Experimental listan", och exportera direkt till ett Excel-ark.
Obs: Användningen av en hand timer kan också vara fördelaktigt att säkerställa riktigheten av mjukvara. - Genomföra en sond rättegång föregömda plattformen utbildning på dagarna 6, 7, 8 och 10. (Figur 2). Efter dessa sond försök utföra 4 försök med dolda plattform utbildning varje dag. Således utför en sond första, omedelbart följt av dold plattform utbildning för alla möss med användning av samma förfaranden som beskrivs i avsnitt 3. Däremot inte utföra ytterligare dold plattform utbildning efter sonden rättegången på dag 10.
5. Analyser
- Synlig Plattform Träning
- Genomföra upprepade mätningar ANOVA separat för (a) våglängd, (b) latens för att hitta plattformen, och (c) simma hastighet, med transgen (eller någon annan variabel, såsom behandling) som mellan motiv variabel och dagar eller utbildningsblock som den inom individer variabel. Obs! För mer komplexa konstruktioner, kan ett samråd med en statistiker vara användbar. Se 8,13 för information om gruppstorlekar tillräckliga för att driva denna uppgift med vanligt förekommande modeller av Alzheimers7; s-sjukdom.
- Prestanda Inkompetens
- Identifiera prestanda inkompetent möss, inklusive möss som visar visuell eller motor inkompetens, eller djur som inte förvärvar de processuella delar av testet, och ta bort dessa möss från efterföljande statistiska analyser av dold plattform och sondprestanda.
- Beräkna genomsnittliga latens och simma hastighet för den sista dagen i synligt plattform utbildning för varje mus. Ta bort möss med hjälp 2 standardavvikelser över gruppen innebär, eftersom detta kan vara ett tecken på motor eller synskador.
- Identifiera och ta bort möss underlåter att orientera eller följa flykt scoop, eller möss som uppvisar avvikande beteende, såsom korkskruven simning eller flytande.
- Identifiera prestanda inkompetent möss, inklusive möss som visar visuell eller motor inkompetens, eller djur som inte förvärvar de processuella delar av testet, och ta bort dessa möss från efterföljande statistiska analyser av dold plattform och sondprestanda.
- Morris vattenlabyrint gömda plattformen Träning
- Genomför upprepade mätningar ANOVA på (a) banlängd, till (b) latens hitta den gömda plattformen, (c) simma hastighet, och (d) procent tid eller procentAvståndet i kvadranten med transgen som mellan motiv variabel och försök som inom individer variabel.
- Probe Trials
- Simma hastighet
- Genomföra upprepade åtgärder ANOVA på simma hastighet över sondförsök med transgen som mellan motiv variabel och försök som inom individer variabel.
- Plattform passage Index
- Använda provkonfigurationen sond för varje mus, är plattformsövergången Index (PCI) beräknas med hjälp av följande formel: PCI = antal gånger musen korsar målplatsen - genomsnittliga korsningar av motsvarande plats i de övriga 3 kvadranter.
Anmärkning: Detta utförs för att bestämma om mus använder en rumslig sökstrategi, såsom indikeras av fler korsningar över utbildade plattformen plats, eller en icke-rumslig strategi thigmotaxic simning, såsom indikeras av ungefär lika stora överfarter över alla fyra platser. - Uppförande upprepadeåtgärder ANOVA på PCI med transgen som mellan motiv variabel och försök som inom individer variabel.
- Använda provkonfigurationen sond för varje mus, är plattformsövergången Index (PCI) beräknas med hjälp av följande formel: PCI = antal gånger musen korsar målplatsen - genomsnittliga korsningar av motsvarande plats i de övriga 3 kvadranter.
- Procent tid eller procent avståndet i kvadrant
- Beräkna tiden procent eller distansera varje mus tillbringar i de fyra kvadranter av labyrinten. Genomföra upprepade åtgärder ANOVA på procent av tiden, eller distans, med transgen som mellan motiv variabel och försök som inom individer variabel. Använda tiden procent för att bestämma huruvida en spatial sökstrategi används; resultaten av cirka 25% av tiden i målet kvadranten indikerar möss presterar på chans nivå och inte använder en rumslig sökstrategi.
- O / N glömmer
- Jämför latensen av perrongområde korsning på sonden rättegången latensen att hitta plattformen på den sista rättegången mot den föregående dag. Obs: Om latensen av plattformen korsningen på sonden rättegången är betydligt längre än latensen att hitta platform under den sista rättegången mot dold plattform på den föregående dagen, då O / N glömma av plattformen platsen sker.
- Simma hastighet
- Post hoc-analys
- Följ betydande RMANOVAs med post hoc jämförelser av transgen vid varje försök.
6. Exempel på Re-optimering för en ny Testmiljö
- Pre-hantering. Genomför före hantering i huset rummet. Placera burar utan lock på en transportvagn för hela sessionen.
Obs: Mål för modifiering av förfarandet före hantering är mer gradvis införa handler manipulationer och exponering för transportanordningar (bägare och skopa) och för att öka tids möss i buren utan microisolator lock och utanför deras bur i en öppet fält och ljusare ljusförhållanden.- Dag 1 och 2
- Låt möss att acklimatisera sig till händer vara i buren, följt av mild beröring, Följt av att lyftas för inspektion tatuering och märkning av svansen. Från och med den dag 2 av pre-hantering, placera kompletterande bomaterial i buren för att ge ytterligare material för bobyggande och husrum medan lock har tagits bort 9.
- Dag 3 och 4
- Placera transport bägaren, skopa, och sjunka av den synliga plattformen i pre hantering rutan och låta möss att prospektera efter 2 försök på 2 minuter per prov.
- Använd inte vatten i detta protokoll under pre-hantering. Snarare se boxen innehåller tillräckligt rena sängkläder för att täcka golvet och parfymerade med en liten mängd av kvinnliga och manliga smutsig kull om båda könen testas. Ändra strö varje dag.
- Dag 5
- Placera möss i pre hantering box som innehåller lätt smutsad skräp och den synliga plattform flagga för 3 försök, under 20 sekunder vardera. Använd bägaren och skopan att transportera mössen till och från boxen.
- Synlig Plattform Träning
- Inställd temperatur vatten vid 27 ° C (som rutinmässigt används för Minnesota testmiljön).
- Återgå mössen till buren vid förvärvet av cued plattform.
- Låt möss upp till 60 sekunder för att få den synliga plattformen.
- Genomföra utbildningar som består av 3 försök per dag under 5 dagar.
- Dolda Plattform Utbildning
- Ändra visuella referenser. Med undantag för en stor gardin att skymma föraren, antingen eliminera eller göra smalare andra gardiner runt poolen så att man får ett mer öppet rum. Placera ytterligare objekt om rummet (t.ex. exponerade hyllor, svart tyg affisch med en vit symbol, en svartvit badboll, stora svarta skorstenar, anteckningsböcker, och en svart uppstoppade djur), vilket resulterar i en balanserad men mer varierad visuell Cue inställd än tidigare använts.
- Börja dold plattform utbildning 72 timmar efter avslutad synlig plattform training, med ett intervall på ungefär 30 minuter mellan försöken.
- Genomföra utbildningar som består av 2 försök under 8 dagar.
- Probe Trials
- Utför sondförsök 72 timmar efter dolda träningsförsök 8, 12, och 16.Include en 3-dagars intervall mellan försöken 8-9 och 12-13 i utbildning.
- Placera sonden varaktighetstid för 30 sek.
- Dag 1 och 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har använt Morris vattenlabyrint att studera effekterna av beta-amyloid (Tg2576 möss) och mutant P301L tau (RTG (TauP301L) 4510 möss) på rumsliga referensminnet (t.ex. 1,5,7,8). Figur 3 är det representativt resultat redovisas i vår studie för att undersöka effekten av vuxna debut P301L tau uttryck på inlärning och minne 8, användning av testmiljö A. För att bedöma motoriska och visuella förmåga, möss jämfördes över synlig plattform utbildningsblock, där varje träningsblocket bestod av 3 försök. Väglängden i synligt plattform utbildning skilde sig inte mellan kontroller och TauP301L möss (Figur 3A), vilket tyder på transgen positiva och negativa möss uppvisar jämförbar simning och båda grupperna kan se visuell (flagga) märkning plattformen. Inga möss identifierades som prestations inkompetent baserat på uteslutningskriterierna. Därefter prestanda i dolt plattform utbildning blocket jämfördes, där varjeblocket består av 1 dag (4 prövningar) utbildning. Såsom mössen lärt placeringen av plattformen, den banlängd och tid för att finna plattformen minskat. Men väglängden var signifikant längre i TauP301L möss jämfört med kontroller vid varje träningsblock (figur 3B), vilket tyder på spatial inlärning försämrades i TauP301L möss. Fyra sond prövningar, där plattformen togs bort, har varvat hela dold plattform utbildning och ägde rum i början av dagen, före starten av dolda plattform utbildning. Således är dessa sondförsök mätt rumsliga referensminnet. Jämföra över dessa fyra sond studier Reglage förbättrats avsevärt med kompletterande utbildning (Figur 3C), vilket framgår av ökad tid i målet kvadranten. Däremot gjorde TauP301L möss inte förbättras med kompletterande utbildning. Således, de största skillnaderna mellan de två grupperna i denna ålder inträffade vid sond rättegång 4. Dessa data visar att P301L tau uttryckförknippas med både spatial inlärning och rumsliga referensminnesbrister. Medan vattnet labyrint uppgift kan vara relativt stabil mot vissa processuella skillnader, F1 FVB / N x 129S6 bakgrund stam kan vara särskilt känsliga för vissa förändringar i miljön. Den första protokoll som beskrivs också framgångsrikt används i miljö B (t ex., 1,7). Men vildtyp sond resultatet var betydligt lägre när det första protokollet användes i en tredje plats, miljö C. Den förnyade optimerat protokoll förbättrats avsevärt vildtyp sond prestanda (Figur 4).
Figur 1:. Optimering av protokoll för bakgrunds Strain Wild-typ 7-8 månader gamla möss tränades med hjälp av samma signaler och testmiljö. F1 FVB / N x 129S6 (N = 24) och B6 / SJL (N = 16) möss först fått 18 och 24 synlig platform träningsförsök respektive levereras vid 6 och 8 försök per dag respektive. Båda stammarna fått 4 dolda plattform träningsförsök per dag. För F1 FVB / N x 129S6 möss, har sondförsök utfördes 20 timmar efter 8, 12, 16, och 24 träningsförsök. För B6 / SJL-möss, har sondförsök utfördes 20 timmar efter 12, 24 och 36 träningsförsök.
Figur 2:. Tidslinje Möss erhöll synlig plattform utbildning för 3 dagar, 6 försök per dag, följt av gömda plattformen utbildning för 6 dagar, 4 försök per dag. Fyra sondförsök genomfördes 20 timmar efter 8, 12, 16, och 24 dolda träningsförsök.
Figur 3: representativa resultat för Morris Water Maze TauP301L möss som bär den humana P.301L tau-genen undersöktes på cirka 6,5 månaders ålder efter tre månaders P301L tau uttryck (n = 41 tauP301L och n = 46 kontroller med en ungefär lika många män och kvinnor i varje grupp). (A) våglängd i synligt plattform utbildning skilde sig inte mellan kontroller och TauP301L möss (p s> 0,05). (B) Under dold plattform utbildning, TauP301L möss visade betydligt längre pathlengths i alla utbildningsblock (Transgene: F (1, 83) = 41,96, p <0,0001, Transgene × Block: F (5, 415) = 0,6141, p = 0,69 ). (C) Kontroller förbättrats över de fyra sondförsök, medan TauP301L möss inte (Transgene: F (1, 83) = 29,1, p <0,0001; Transgene × Trial: F (3, 270) = 4,91, p = 0,008). Varje utbildning blocket bestod av 3 prövningar för synlig plattform utbildning eller 4 prövningar för hidden plattform utbildning. Tukey post-hoc-analyser: * p <0,05, ** p <0,01; *** p <0,001. Delar av Figur 3 Utdrag ur Hunsberger et al., Effect storlek minnes underskott i möss med vuxen-debut P301L tau uttryck, Behav Brain Res, vol. 272, sid. 181-95. Copyright 2014 med tillstånd från Elsevier.
Figur 4: Probe Scores påverkas väsentligt av Testmiljö och utbildning protokoll Tre grupper av tau negativa F1 FVB / N x 129S6 möss tränade med olika kombinationer av utbildningsprotokoll och testmiljö genererade betydligt olika sond poäng efter 8, 12 och 16 utbildning. försök (grupp: F (2, 42) = 14,89, p <0,0001; gruppen X Trial: F (4, 84) = 1,10, p = 0,36). Möss utbildad utnyttjar protokoll 1 och same uppsättning tillämpade signaler visas betydligt lägre sond poäng under Miljö C jämfört med miljö B (Miljö: F (1, 25) = 28,58, p <0,0001, Miljö x Trial: F (2, 50) = 1,93, p = 0,16) . Möss tränade under Miljö C visas betydligt högre sond poäng när modifierade ledtrådar och åter optimerade protokoll 2 användes jämfört med möss utbildade utnyttja de ursprungliga signaler och protokoll 1 (Protokoll: F (1, 30) = 15,32, p <0,001; protokollet x Trial: F (2, 60) = 0,91, p = 0,41) ** p <0,001; *** p <0,0001..
| Dag 1 | Morris Water Maze - Kohort: | Datum: _________ | ||||||
| Plattform i SE kvadranten | Tester: &# 160; Starttid: Sluttid: Vattentemp: | 1m max försökstiden / 15s på plattformen / * placeras på plattformen | ||||||
| Grupp 1 | ||||||||
| Försök 1 | ||||||||
| Animal ID | Märkning | Bur # | Slut tid | Släpp punkt | Plattform läge | Hitta plattform? | Tid | Anmärkningar (dvs. udda beteende) |
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| 20 minuters ITI | ||||||||
| Försök 2 | ||||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| 20 minuters ITI | ||||||||
| Trial 3 | ||||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| 20 minuters ITI | ||||||||
| Trial 4 | ||||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| </ Td> | S | SE | ||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
Tabell 1:. Gömda plattformen Kör Blad Ett exempel kör ark, i vilket plattformen är belägen i sydöstra (SE) kvadranten tillhandahålls. Försöksledaren ska skriva musens ID-nummer, eventuella identifieringsmärken på svansen eller öron, och buren gruppering. Släpppunkten anges på bladet och bör vara pseudoslumpmässigt bestämdes såsom beskrivits i steg 3.3.2. Registrera huruvida musen finner plattformen och tiden för att finna plattformen. Udda beteende, inklusive flytande eller thigmotaxis bör noteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den MWM uppgift används ofta för att bedöma spatial inlärning och minne. Däremot kan den robusthet av denna uppgift att påverkas av många faktorer och kräver optimering för både bakgrunds stam och testmiljö. Såsom visas i fig 4, samma utbildning protokoll och tillämpad visuella referenser som används i två olika test rum (motsvarande storlek och layout) gav signifikant olika sondprestanda. Eftersom många funktioner i provningsrummet kan bidra till ledljud 4, var det spekulerats i att de två rummen var signifikant annorlunda på något okänt sätt som gjorde testet svårare. Modifiera extra labyrint ledtrådar, valde vi för att effektivt öka antalet visuella referenser. Dessutom, genom att minimera användningen av gardiner, eventuella hörsel- eller olfaktoriska signaler som kan finnas kan ha ändrats. Ljusnivån av de två test rummen var ekvivalenta, men buren ljusnivån i den nya vivarium var lägre, vilket resulterari en högre ljusnivå skillnad när man går hemifrån bur till provningsrummet. Det har föreslagits att BALB / c-möss kan utföra MWM uppgift att tillhandahålla ljusnivåer är tillräckligt låga 14. Men försök att förbättra prestanda genom att sänka testa rum ljusnivåer var misslyckade (opublicerade observationer). Hittills är det inte känt vad faktor (s) har bidragit till nedgången i prestanda i den nya testmiljön, men den modifierade pre-hantering, ledtrådar och utbildning protokoll har resulterat i en betydande ökning av sond poäng.
Om möjligt, är det rekommenderas att testa en grupp av vild-typ eller kontrollmöss av samma bakgrund stam och ålder som den planerade experiment för att bedöma graden av lärande och optimal sondplacering för den speciella testmiljö. Helst är den första sonden placerad vid ungefär hälften av mössen visar en sannolik positiv sökning partiskhet (% -Tiden i target≥35) och den sista sonden närde flesta kontrollmöss visar en positiv sökning fördomar och har nått prestanda platå. Denna strategi har använts för att bestämma sondplacering för överlägsen artister (F1 FVB / N x 129S6) och en bakgrund som lärt sig mer långsamt (blandad C57BL / 6 x FVB / N X 129S6), där ungefär hälften av mössen hade målgrupp kvadrant occupancies av ≥35 efter 8 försök eller 18 prövningar respektive med en grupp innebära cirka 35% -Tid för den första sonden. Senare prober bör vara högre än det första om den är inställd på detta sätt, helst med åtminstone en 15-punkters skillnad jämfört med baslinjen 25% -tid. Om man jämför sond poäng som är måttligt låg (~ 35% -Tiden), se till att detta utgör en betydande bias för målet och därmed en giltig skillnad, genom att jämföra målet till icke-mål kvadranter 4,5. Dessutom bör den minsta gruppen medelvärdet inte vara väsentligt lägre än 25% -tid i mål-kvadranten, som kan anses baslinjen eller chans prestanda. Jämföra target till icke-mål beläggning kan hjälpa till att identifiera om det finns rum fördomar, t.ex. möss spenderar mer tid i motsatt kvadranten än någon av de närliggande kvadranter skulle vara en oväntad sökmönster.
Några rekommendationer medan ledande testning inkluderar att begränsa antalet personer som testar varje kohort av djur till 1 individ att minska variationen i hantering och testning av stilar mellan praktiker och utföra tester vid ungefär samma tidpunkt varje dag. Dessutom har det föreslagits att möss som erhöll 2 studier per dag lär nästan lika snabbt som de som får 4 försök per dag 15. Det är viktigt att djur från olika stammar / bakgrunder / behandlingsgrupperna vara representerade i varje testgrupp om mer än en kohort måste köras under en dag. Slutligen måste försiktighet iakttas för att säkerställa att mössen inte bli hypotermi, som hypotermi kan påverka prestanda och är sex och bakgrund stam beroende 16. Även the interprovintervall som används här (20 min) skall vara tillräcklig för att förhindra hypotermi, andra metoder innefattar justering av vattnets temperatur, placera mössen i en uppvärmd anläggning bur mellan försöken, eller någon kombination av de två efter behov. Emellertid bör det noteras att vattentemperaturen kan påverka prestanda i båda riktningarna. Till exempel, proöstrus råttor prestera bättre i varma förhållanden (33 ° C), medan brunst råttor prestera bättre under kalla förhållanden (19 ° C) 17. Sålunda måste man vara noga med att kontrollera för vattentemperaturer över experiment. Bör hypotermi vara en angelägenhet för ett speciellt djur, kan försöksledaren lämna torka det djuret med en pappershandduk i händelse av att de misslyckas med att exploatera efter simma eller ge någon indikation på hypotermisk beteende. Regelbunden utvärdering av kroppstemperaturen kan säkerställa att villkoren är tillräckliga för att förhindra hypotermi.
En annan faktor procedur avser synlig plattform training. Yngre möss eller en annan stam kan behöva färre synliga plattform träningsförsök. En föreslagen riktlinje är att träna tills kontrollgruppen har nått golvet prestanda under de sista 3-6 träningsförsök i rad, vilket ger den experimentella gruppen visar motsvarande prestanda. Om den experimentella designen inkluderar både unga och gamla möss, ställa den synliga plattform träningstid för gruppen, som kräver flest träningsförsök att nå golvet prestanda 5. Dessutom kan det synliga plattformen vara effektiv mot acklimatisera möss hantering och provningsförfarande och kan undanröja behovet av pre-hantering om mössen är inte mycket unga när första testas eller mänsklig hantering är inte överdrivet obehaglig till stammen som testas.
Breda fördelarna med Morris vattenlabyrinten inkluderar dess relativa okänslighet för motivationsfaktorer jämfört med livsmedelsbaserade uppgifter, dess giltighet som ett mått på hippocampus beroende spottadeIAL navigering och referensminnet, och mellan arter effekt 15. En potentiell begränsning av tekniken är att, eftersom detta protokoll är skräddarsydd för en specifik bakgrundsstam, kan det inte vara effektiv med andra djur eller andra bakgrunds musstammar. Dessutom, som en del av protokollet, görs försök att skapa och strategiskt placera identifierbara ledtrådar hela mazing rummet. Det är dock oklart vad exakt höjd är optimalt när du placerar signaler runt i rummet. Sålunda ledtrådar som är stora och kan skiljas från varandra är nödvändig för effektiv träning.
Sammanfattningsvis kan optimera MWM uppgift för användning med en viss bakgrund stam och testmiljö avsevärt öka det dynamiska omfånget av uppgiften, vilket resulterar i avsevärd tids- och kostnadsbesparingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of General Medical Sciences (Reed / Engler-Chiurazzi - U54GM104942), det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (Ashe - R01NS33249, R01NS63249 och R01NS79374), Cobre (Engler-Chiurazzi - P20GM109098), den Alzheimers Association (Reed - NIRG-12-242.187), en WVU fakulteten Research senaten Grant (Reed), en WVU PSCOR bidrag (Reed) och interna medel från WVU College of Medicine Dean kansli (Engler-Chiurazzi). Innehållet är ensamt ansvar författarnas egna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH eller Alzheimers Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viewer Tracking software | Biobserve | This particular software is not a requirement - there are other tracking systems available | |
| Pre-handling pool | Dimensions approximately 1 foot wide x 2 feet long x 1.5 feet deep | ||
| Plastic beaker | 1 L | ||
| Scoop | |||
| Small net | |||
| Stopwatch | |||
| Non-toxic white tempera paint | Any color paint can be used; however, most tracking software programs require that the paint contrast with the color of the animal. | ||
| Visible platform | Color should contrast that of maze | ||
| Curtain rod | |||
| Curtains | |||
| Circular tub | Usually white in color; approximately 4 feet in diameter | ||
| Hidden platform | Painted same color as the water |
References
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). The Journal of Neuroscience. 25, 10637-10647 (2005).
- Attar, A., et al. A shortened barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8, e80355 (2013).
- Johnson, J. M., Bailey, J. M., Johnson, J. E., Newland, M. C. Performance of BALB/c and C57BL/6 mice under an incremental repeated acquisition of behavioral chains procedure. Behavioural Processes. 84, 705-714 (2010).
- Crawley, J. N. What's wrong with my Mouse Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 1st edition, Wiley-Liss. 94-95 (2000).
- Westerman, M. A., et al. The relationship between abeta and memory in the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of Neuroscience. 22, 1858-1867 (2002).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60-90 (2001).
- Santa Cruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309, 476-481 (2005).
- Hunsberger, H. C., et al. Effect size of memory deficits in mice with adult-onset P301L tau expression. Behavioural Brain Research. 272, 181-195 (2014).
- Yue, M., Hanna, A., Wilson, J., Roder, H., Janus, C. Sex difference in pathology and memory decline in rTg4510 mouse model of tauopathy. Neurobiology of Aging. 32, 590-603 (2011).
- Sandi, C. The role and mechanisms of action of glucocorticoid involvement in memory storage. Neural plasticity. 6, 41-52 (1998).
- Hölscher, C. C. impairs performance in spatial water maze learning tasks. Behavioural Brain Research. 100, 225-235 (1999).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 11, 47-60 (1984).
- Reed, M. N., Liu, P., Kotilinek, L. A., Ashe, K. H. Effect size of reference memory deficits in the morris water maze in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 212, 115-120 (2010).
- Huang, Y., Zhou, W., Zhang, Y. Bright lighting conditions during testing increase thigmotaxis and impair water maze performance in BALB/c mice. Behavioral Brain Research. 226, 26-31 (2012).
- Baker, R. Water maze. , Available from: http://www.watermaze.org (2013).
- Ivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puolivali, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behavioural Brain Research. 141, 207-213 (2003).
- Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
