Introduction
Des modèles de souris transgéniques ont joué un rôle déterminant dans l'évaluation de la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer (MA), ainsi que la possibilité d'interventions thérapeutiques. Les tâches cognitives, telles que l'eau de Morris (MWM), sont couramment utilisés avec ces modèles pour identifier les corrélats moléculaires des déficits de mémoire et d'évaluer l'efficacité des médicaments pré-cliniques. Il est essentiel, cependant, que la plage dynamique de la tâche cognitive être suffisamment large pour détecter des effets subtils de traitement. Avec des modèles de souris de la MA, les déficits cognitifs sont généralement fonction de l'âge, et les souris affichent des baisses progressives de la performance (par exemple, 1). Utilisation d'une tâche cognitive sensible peut permettre la détection de différences subtiles plus tôt dans la vie de l'animal, ce qui réduit les coûts associés au vieillissement des animaux. Par exemple, réduire le nombre d'essais de formation dans les Barnes de l'hippocampe-dépendante labyrinthe de 15 à 5 augmenté la difficulté de la tâche, ce qui entraîne dans la dÉTECTION des déficits dans le modèle 3xTg à un âge plus précoce que précédemment rapporté 2. La détection précoce des déficits offre non seulement beaucoup de temps et des économies de coûts, elle augmente aussi la probabilité que les changements moléculaires qui sous-tendent les déficits cognitifs peuvent être identifiés.
Un facteur qui influe sur la sensibilité de tâches cognitives est la souche de fond génétique du modèle de la souris. Par exemple, des souris BALB / c présentent des performances supérieures dans les tâches d'apprentissage et de mémoire par rapport à d'autres souches, telles que la souris C57BL / 6 3. La F1 FVB / N x 129S6 fond est utilisé pour deux des modèles les plus utilisés de l'AD, Tg2576 et RTG (TauP301L) 4510 modèles. Cette souche présente la capacité d'apprentissage de qualité supérieure dans le MWM par rapport à d'autres souches, y compris B6 / souris SJL 4. En raison de cette capacité d'apprentissage de qualité supérieure, l'utilisation d'une seule sonde après une formation approfondie peut masquer des différences de groupe résultant de sur-entraînement. En outre, la sensibility des essais de sonde peut être liée à l'âge. Nous avons précédemment montré que les essais de sonde précédents, après une formation limitée de plate-forme cachée, sont plus sensibles à des différences de jeune Tg2576 par rapport aux jeunes transgènes négative contrôles même portée que sont les essais de sondes insérées après une formation plus approfondie 5. En revanche, les essais de sonde suivantes formation approfondie sont plus sensibles dans les vieux (20-25 mois) des souris Tg2576 par rapport à la même portée âgés de plus sont antérieures essais de sonde 5. En entremêlant les essais de la sonde à travers la formation, la probabilité qu'un procès sensible sera identifié est augmenté, en particulier si les tests longitudinale est effectuée et la sensibilité d'un essai de sonde particulière dépend de l'âge. La figure 1 montre la performance supérieure de F1 FVB / N x 129S6 souris dans le cadre du protocole optimisé pour cette souche que par rapport à des souris de l'arrière-plan B6 / SJL formés dans le cadre d'un protocole avec une formation plus poussée.
Le MWM estgénéralement pensé à fournir des mesures fiables qui sont reproductibles à travers le temps et les laboratoires 6. Par exemple, le principal protocole utilisé à l'origine par notre laboratoire 1,7 Minnesota a été mis en œuvre avec succès avec des modifications mineures à la West Virginia University 8. De même, des niveaux équivalents de dépréciation ont été observées dans RTG (TauP301L) 4510 souris par rapport au contrôle de la même portée si logé dans des conditions exemptes d'agents pathogènes ou conventionnelles 9. Cependant, l'environnement de test peut influencer la sensibilité de la tâche MWM. Des facteurs tels que l'éclairage de la pièce, bouches d'aération, des gradients de température, et les bruits contribuent tous aux signaux environnementaux 4 qui peuvent finir par influencer la performance. Lorsque notre laboratoire Minnesota et vivarium ont été déplacés vers un nouveau bâtiment, jusqu'à une réduction de 38% de la performance de type sauvage a été observée, ce qui réduit sensiblement la gamme dynamique de la tâche et la capacité de détecter les déficits liés transgènes. Ce changement de performance produite malgré la conception de la salle d'examen pour être de taille et de configuration équivalente, et en utilisant les mêmes repères visuels appliqués. Une «re-optimisation" du protocole original a été nécessaire pour augmenter la plage dynamique de la tâche MWM dans le nouvel environnement de test.
Ici, le protocole original adapté pour une utilisation avec la F1 FVB / N x 129S6 fond 5 est décrite. Parce que certaines études suggèrent le stress est associé à la performance de MWM pauvres 10 et pré-traitement peut atténuer ce déficit induite par le stress de la performance 11, un protocole pré-traitement a été conçu pour acclimater les souris à l'introduction et l'enlèvement de la piscine avant le test MWM . Après pré-traitement, les souris reçoivent une formation de la plate-forme visible, dans lequel une plate-forme surélevée est marqué avec un drapeau. La formation de la plate-forme visible est utilisé pour identifier des souris avec des problèmes de performance liés à des anomalies sensori-motrices. En utilisant des critères d'exclusion décrits dans la protsection ocol, souris de performance incompétent sont retirés examens ultérieurs de formation de la plate-forme et de la sonde essais cachés. Déficiences dans la formation de la plate-forme et de la sonde essais cachés sont interprétées comme des déficits cognitifs, car les performances sensori-moteur est pris en compte sur les données. Après l'achèvement de la formation de la plate-forme visible, les souris commencent caché formation de plate-forme où la plate-forme est immergé dans l'eau et reste dans la même position par rapport à des signaux externes. Essais dans lequel la plate-forme est éliminé (essais de sonde) sont intercalées dans la formation de la plate-forme cachée d'évaluer l'influence de la formation supplémentaire. Puisque les essais de la sonde se produisent au début de chaque jour, avant l'entraînement supplémentaire de plate-forme cachée, des essais de sonde mesurent la capacité de l'animal à se souvenir de l'emplacement de la plate-forme après un délai de 20 heures, considérée comme une mesure de la mémoire de référence 12. Enfin, façons dont ce protocole original a été ré-optimisées lorsque des changements dans l'environnement de testla performance de commande perturbé sont décrits.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les normes du Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC) et approuvés par IACUC de l'Université de Virginie de l'Ouest.
1. Pré-traitement
- Configurer la Piscine
- Prop la piscine pré-traitement de sorte qu'il est élevé à une hauteur confortable.
- Passer 2 L d'eau (21 ° C) dans le bassin de pré-assistance à un niveau d'environ 1 cm.
Note: Ne pas ajouter du colorant.
- Procédure
- Amener les souris du vivarium de la chambre d'essai.
- Vérifier l'identification de l'objet (numéro de l'objet, la queue tatouage, clip oreille, etc.).
- La queue de la souris Mark avec un marqueur permanent de distinguer les souris dans la cage qui ont subi des tests de ceux qui restent à tester pré-traitement. Marquez toutes les souris dans une cage avec la même couleur.
- Placez une souris dans le bécher de transfert pour approximationtement 5 sec. Ensuite, versez doucement la souris sur le bécher dans la piscine de pré-traitement.
- L'utilisation d'une minuterie, la souris permet de rester dans la piscine pendant 20 s.
- Après 20 sec, placez doucement le scoop (sans inclinant) en face de la souris. Permettre brièvement la souris pour explorer le scoop, et, si nécessaire, d'encourager la souris pour obtenir le scoop sur les faisant glisser doucement le scoop sous la souris tout en soulevant lentement. Prenez soin de ne pas effrayer les souris avec le scoop.
- Une fois que la souris est dans le scoop, le transportent vers la cage de maintien.
- Répéter ces procédures pour chaque souris dans la cage une fois par jour pendant 10 jours. A intervalles réguliers (par exemple après chaque animal), ramasser fécale boli et de la literie de la piscine à l'aide d'un filet.
- Rincer le bécher de transfert avec de l'eau à intervalles réguliers (par exemple, après l'achèvement d'une cage de souris).
- Une fois ces étapes terminées, rincer le bécher de transfert avec l'eau plusieurs fois, vider l'eau dela piscine, et rincer la piscine environ deux fois avec de l'eau.
2. Visible formation de plate-forme
- Configuration de la souris contrôle de la performance du logiciel Viewer par exemple (voir le tableau des matériaux).
- Calibrer la vidéo pour correspondre aux dimensions du labyrinthe sous la 'Configuration' - "Filtres et objets" onglet.
- Définir des filtres afin que le logiciel peut différencier une souris à partir de l'arrière-plan.
- Ajuster la «sensibilité» sous la zone de «filtre en arrière-plan" de sorte que le logiciel de suivi identifie l'animal.
- Cliquez sur l'option «accepter» une fois que le logiciel de suivi identifie l'animal. Choisissez l'option "edit" Blackout zones en dehors de la zone de labyrinthe.
- Sélectionnez le "filtre animal" approprié et "min. la taille des animaux ".
- Création des fiches de Run <ol>
- Créer une feuille d'exécution énumérant chaque souris, chaque emplacement potentiel, et un espace pour les notes contenant des informations sur le comportement aberrant.
- Prédéterminer le tournage de test de plate-forme visible qui sont les mêmes pour chaque groupe de souris. Ainsi, pour le premier essai, avant de déterminer que la plate-forme est placée sur le côté opposé à celui où la souris est placée dans le labyrinthe, sur le côté droit à proximité de la paroi. Pour le second procès, avant de déterminer que la plateforme sera placé dans un emplacement différent le long de la paroi arrière de chaque souris et que cela va continuer pour chacun des 6 essais.
- Accrocher des rideaux autour de la salle afin que toutes les repères spatiaux sont obscurcies.
- Placez la baignoire afin qu'il corresponde à la configuration dans le logiciel de suivi en assurant le labyrinthe correspond avec la procédure de configuration sur la "Configuration" - onglet "Zone de Définition". Remarque: Il hPEL pour assurer la baignoire est au bon endroit avant de le remplir avec de l'eau que la baignoire est pas faciles à déplacer une fois rempli.
- Remplissez la baignoire avec de l'eau du robinet, et en utilisant un thermomètre, d'assurer la température de l'eau est d'environ 21 ° C. Assurez-vous que l'eau reste dans un degré de cette température tout au long de l'essai, que de l'eau plus froide peut influer sur les performances en particulier lors de l'utilisation des souris âgées 8.
Note: Ne pas ajouter du colorant. - Utilisation des emplacements prédéterminés, placez la plate-forme, qui a un drapeau monté qui atteint une hauteur de 13 cm et est de 4,5 cm x 4,5 cm avec un "S" gras de caractère en forme de relief sur elle, dans le premier emplacement de la baignoire de sorte qu'il est d'environ 1 pouce au-dessus de la surface de l'eau.
- Prenez la première souris de la cage, vérifier l'identification de l'objet, marquer la queue en utilisant un marqueur permanent de la bonne couleur, et la place dans le bécher.
- Placez délicatement le mouse dans la baignoire, démarrer la minuterie, et veiller à ce que le logiciel de suivi est suivi de l'animal. Laisser la souris jusqu'à 2 min pour localiser la plate-forme. Une fois que la souris localise la plate-forme, laisser la souris 20 sec sur la plate-forme.
- Si l'animal trouve la plate-forme et procède à sauter ou tomber, ramasser la souris et placez la souris sur la plate-forme. Si la souris continue de sauter ou de tomber de la plate-forme, maintenez la souris sur la plate-forme, de sorte que la souris apprend que restant sur la plate-forme conduit à sortir de la baignoire.
Remarque: La souris doit rester sur la plate-forme pour un temps combiné de 20 sec; ainsi, si la souris saute de 5 s après, la quantité de temps restant sur la plate-forme est de 15 secondes et ne se réinitialise pas à 20 sec. - Si l'animal ne parvient pas à trouver la plate-forme dans la période de 2 min, ramasser la souris et le placer sur la plate-forme pendant 20 sec.
- Après 20 sec sur la plate-forme, retirez la souris à partir de la plate-forme fait dans la formation pré-traitement et de placer la souris dans ee cage chauffée bordée avec des serviettes en papier et chauffé à ~ 31 ° C par un coussin chauffant et lampe chauffante pendant 30 sec. Effectuer une évaluation périodique de la température du corps avec un thermomètre rectal pour assurer que certaines souches de souris ou souris à un certain âge ne sont pas différemment sensibles à l'hypothermie induite par l'exposition à l'eau.
- Après 2 min à la cage de retenue avec la lampe de chauffage, transférer la souris vers la cage de maintien avec seulement un coussin chauffant, mais pas de lampe de chaleur, de récupérer entre les essais. Finalement, placer toutes les souris d'une seule cage d'accueil dans la même cage de retenue pendant l'essai.
- Nettoyez le dédale des débris avec un net après chaque souris a complété un essai, de perturber les signaux olfactifs.
Note: La plate-forme restera dans le même emplacement pour chaque souris pendant un seul essai et seradéplacé vers les autres emplacements prédéterminés pour les essais qui ont suivi. Ceci est fait pour s'assurer que les souris 1) apprendre il ya une plate-forme pour échapper à, 2) nager directement à la plate-forme visible, démontrant ainsi la compétence visuelle intacte, et 3) ne pas avoir des déficits moteurs.
Remarque: L'utilisation d'une minuterie à main peut également être bénéfique pour assurer la précision du logiciel de suivi de piste.
3. Formation Morris Maze eau plate-forme cachée
- Set la pièce
- Raccrochez rideaux dans la salle à obscurcir repères spatiaux dans le laboratoire.
- Placez stratégiquement des indices sur les rideaux. Veiller à ce que les indices sont grandes et contiennent des couleurs contrastées (ex .: noir et blanc) pour une meilleure visibilité. Accrochez indices à distance et la hauteur où ils sont visibles à des souris de l'intérieur de la baignoire. Remarque: Les signaux sont statiques et ne se déplacent pas au cours de l'essai.
- Configuration du logiciel de la souris contrôle de la performance
- Calibrer la vidéo pour correspondre aux dimensions du labyrinthe sous la 'Configuration' - "Filtres et objets" onglet.
- Placer les filtres de sorte que le logiciel peut différencier les souris à partir de l'arrière-plan.
- Utilisez les mêmes procédures que celles décrites dans le test de la plate-forme visible (étapes 2.1.2.1-2.1.2.3) de mettre en place des filtres pour labyrinthe aquatique de Morris formation de plate-forme cachée.
- Créez quatre quadrants égaux à l'intérieur du labyrinthe
- Cliquezl'option "Ellipse" sous l'onglet "Zone de Définition" d'abord, et de créer un cercle qui correspond le labyrinthe sur l'écran. Remarque: Dans cet onglet, le labyrinthe réelle mise en place est affichée, il permet donc l'option pour correspondre à la configuration de l'ordinateur avec la configuration réelle du labyrinthe.
- Cliquez sur l'option "Rectangle" et de créer quatre carrés égaux. Placez ces carrés sur l'écran pour créer quatre quadrants égaux dans le cercle nouvellement créé.
- Créer des plates-formes dans le labyrinthe.
- Sélectionnez l'option "Ellipse", et de créer un cercle de la taille de la plate-forme qui sera utilisée. Remarque: Placer la plate-forme dans le labyrinthe avance peut être bénéfique pour créer une ellipse de la taille exacte de la plate-forme.
- Placer l'emplacement de la plate-forme nouvellement créé dans le centre de la cible quadrant. (Il est recommandé de nommer cet objet "cible" pour distinguer les plates-formes correctes du reste). Étape critique: Dans la boîte juste Below "Grille", sélectionnez l'option "stop" sous "déclencheur" pour la plate-forme cible. Cela entraînera le programme pour arrêter une fois la souris atteint la plate-forme.
- Créez trois autres zones de la plate-forme identiques, et les placer dans les emplacements exacts dans les autres quadrants. Ne sélectionnez pas "stop" dans l'option "de déclenchement".
- Création des fiches de Run
- Créer une feuille d'exécution énumérant chaque souris, chaque essai, un espace pour écrire le temps pour atteindre la plate-forme, et un espace pour noter comportement aberrant (tableau 1).
- Pré-déterminer le point de sortie de chaque souris d'une manière pseudo-aléatoire. Utilisez la sélection pseudo-aléatoire de telle sorte que la distance à la plate-forme est égal chaque jour, chacun des 4 emplacements est utilisé également, et l'angle du début à la plate-forme (ie., De gauche ou de droite) est équilibré à l'intérieur et entre les jours.
Remarque: l'emplacement de la plate-forme sur la coursefeuille afin d'assurer la localisation de la plate-forme ne bouge pas de sa position initiale. Assurez-vous que la plate-forme se trouve au centre de l'une des quatre zones qui ont été créés sur le logiciel de suivi.
Remarque: Si le test longitudinale est menée à différents âges, déplacer la plate-forme à un nouvel emplacement à chaque âge.
- Configuration du Maze
- Régler soit le labyrinthe de l'eau ou la caméra de sorte que il ya un match entre le labyrinthe et la procédure de configuration sur la "Configuration" - onglet "Zone de Définition".
- Nommez les quatre quadrants invisibles du labyrinthe (N, S, E, W). Vérifiez que ceux-ci correspondent à la configuration dans le logiciel de suivi pour assurer souris sont libérés à partir des points de départ correctes.
Critical Étape: Placez ces étiquettes à l'extérieur du labyrinthe et hors de la vue d'un animal de natation étant donné que les indices dans le labyrinthe constituent une tâche dépendante non-spatiales, non-hippocampique. - Remplissez le labyrinthe avec robinet Water (environ 21 ° C) de sorte que la plate-forme est d'environ 5 mm sous la surface de l'eau.
- Placer la plate-forme à l'emplacement prédéterminé.
Remarque: L'emplacement de la plate-forme restera le même pour toutes les souris étant testés pour tous les jours et des essais. - Utilisez peinture non toxique tempera blanc pour rendre l'eau opaque. Pour ce faire, veiller à ce que le haut de la plate-forme est invisible de la hauteur des yeux des animaux tout en nageant.
- Procédure
- Prenez la souris de la cage, marquer la queue en utilisant un marqueur permanent de la bonne couleur, et le placer dans le bécher.
- Verser doucement la souris dans le labyrinthe, de sorte qu'il pénètre face au mur. Remarque: Chaque souris sera placé dans la même position de départ pour un procès unique.
- A la version initiale de la souris, commencer la minuterie et se tenir dans une zone où le testeur est pas facilement visibles par les souris. Assurez-vous que le logiciel de suivi de l'animal est correctement suit de l'animal. Une fois que l'animal atteint la plate-forme, lui permettre de rester sur la plate-forme pendant 15 sec.
Remarque: Cette fonction permet à l'animal de l'orient à sa localisation spatiale dans la salle. - Après 15 sec sur la plate-forme, retirer l'animal du labyrinthe et retourner la souris à la cage chauffée.
- Si la souris trouve la plate-forme et procède à sauter ou tomber avant 15 sec, ramasser la souris et le replacer sur la plate-forme pour le reste de la 15 sec alors la souris apprend à associer la plate-forme à l'évasion.
- Si la souris ne localise pas la plate-forme dans les 60 secondes, ramasser doucement la souris et le placer sur la plate-forme. Lui permettre de rester sur la plate-forme pendant 15 secondes, puis retirez l'animal avec la pelle et le ramener à la cage chauffée.
- Nettoyez le dédale des débris avec un filet de perturber les signaux olfactifs.
- Répétez ces procédures pour les souris restants dans le groupe. Ainsi, pour les jours de tests 4 à 9, effectuer quatre essais de caché train plateformeing par jour avec environ 20 min entre chaque essai.
- Modifier l'emplacement pseduorandomly de départ pour chaque essai. Ainsi, au cours du procès 1, libérer toutes les souris de la même position de départ, puis répétez la procédure à partir d'une position de départ différent pour les essais qui ont suivi. Chaque jour, varier les points de rejet d'assurer que les animaux ne développent pas une stratégie dépend non spatiale, non-hippocampique motrice. Par exemple, si les souris sont libérés à partir de N, S, E, W et des points dès le premier jour, ne les libère pas dans le même ordre du jour suivant.
- Pendant la formation de plate-forme cachée, utilisez le logiciel de suivi des animaux pour mesurer la latence pour atteindre la plate-forme, la longueur du trajet de l'animal, et le pourcentage de temps ou de distance l'animal passe dans chaque quadrant de labyrinthe. Obtenir ces mesures à partir de l'onglet "labyrinthe d'eau" sous "Liste d'essai« et peut être exporté directement vers un tableur Excel.
Remarque: L'utilisation d'une minuterie de la main assure la précision de l'alignementlogiciel.
4. Essais de sonde
- Configuration du logiciel de la souris contrôle de la performance
- Utilisez les mêmes procédures que dans le labyrinthe aquatique de Morris caché procédure de plate-forme (étapes 3.2.1-3.2.4.3) à une exception près. Étape critique: Pour les essais de sonde, assurer l'option "stop" pour "déclencheur" est désactivé pendant les essais de la sonde. Cela permettra d'éviter l'émission à partir de l'arrêt lorsque la souris traverse la zone de plate-forme.
- Création des fiches de Run
- Créer une feuille d'exécution énumérant chaque souris, chaque essai, et un espace pour noter comportement aberrant. Pré-déterminer le point de presse au cours des essais de sonde tels qu'ils alternent entre les deux côtés opposés de la plate-forme. Ainsi, avant de déterminer les points de rejet tels que les souris ne sont pas libérés des deux côtés qui sont adjacents à la plate-forme.
- Procédure
- Mener sonde essais similaires à la formation de la plate-forme cachée, à l 'exceptiontion qu'aucune plate-forme est dans le labyrinthe.
- Relâchez la souris à partir d'un point de presse prédéterminée. Pendant le procès de la sonde, retirez la plate-forme et de la souris a 60 secondes pour nager dans le labyrinthe.
- Lors des tests, effectuer 4 essais de la sonde. Modifier le point de la souris entre les essais de sonde de libération. Ainsi, changer le point de l'essai de la sonde de courant de sortie de celui de l'essai de la sonde précédente.
- Pendant les essais de sonde, utilisez le logiciel de suivi des animaux pour suivre la longueur du trajet de l'animal, le pourcentage de temps l'animal passe dans chaque quadrant du labyrinthe, et le nombre de fois un animal nage sur la zone précédemment platformed. Obtenir ces mesures à partir de l'onglet "Analyse des données" et l'onglet "labyrinthe d'eau» sous «liste expérimentale", et l'exportation directement à une feuille de calcul Excel.
Remarque: L'utilisation d'une minuterie à main peut également être bénéfique pour assurer la précision du logiciel de suivi de piste. - Procéder à un essai de la sonde avantcaché la formation de la plate-forme aux jours 6, 7, 8 et 10. (Figure 2). Après ces essais de sonde, effectuer 4 essais de la plate-forme cachée de formation chaque jour. Ainsi, effectuer une première sonde, immédiatement suivie par la formation caché de plate-forme pour toutes les souris en utilisant les mêmes procédures que celles décrites dans la section 3. En revanche, ne pas effectuer une formation supplémentaire de la plate-forme cachée après le procès de la sonde au jour 10.
5. Analyses
- Visible formation de plate-forme
- Effectuer des mesures répétées ANOVA séparément pour (a) la longueur de trajet, (b) la latence pour trouver la plate-forme, et (c) la vitesse de nage, avec transgène (ou une autre variable, comme le traitement) comme entre-objet variable et jours ou blocs de formation, la variable intra-sujet. Remarque: Pour les modèles plus complexes, une consultation avec un statisticien peut être utile. Voir 8,13 pour des informations sur la taille des groupes suffisante pour alimenter correctement cette tâche avec les modèles couramment utilisés de la maladie d'AlzheimerLa maladie de; 7.
- Performance incompétence
- Identifier les souris de performance incompétent, y compris les souris qui démontrent l'incompétence visuel ou moteur, ou des animaux qui ne acquièrent les composants de procédure du test, et de supprimer ces souris à partir d'analyses statistiques ultérieures de la plate-forme cachée et la performance de la sonde.
- Calculer la latence moyenne et nager vitesse pour le dernier jour de la formation de la plate-forme visible pour chaque souris. Retirer les souris avec des moyens 2 écarts types au-dessus de la moyenne du groupe, comme cela peut être le signe de moteur ou de déficiences visuelles.
- Identifier et éliminer les souris à défaut d'orienter ou de suivre le scoop d'échappement, ou des souris présentant un comportement aberrant, comme la natation tire-bouchon ou flottant.
- Identifier les souris de performance incompétent, y compris les souris qui démontrent l'incompétence visuel ou moteur, ou des animaux qui ne acquièrent les composants de procédure du test, et de supprimer ces souris à partir d'analyses statistiques ultérieures de la plate-forme cachée et la performance de la sonde.
- Formation labyrinthe aquatique de Morris plate-forme cachée
- Mener des analyses de variance à mesures répétées sur (a) la longueur de trajet, (b) la latence pour découvrir la plateforme cachée, (c) la vitesse de nage, et (d) le temps de pour cent ou pour centla distance dans le quadrant avec transgène comme variable et des essais inter-sujets comme la variable intra-sujet.
- Essais de la sonde
- La vitesse de natation
- Mener des analyses de variance à mesures répétées sur la vitesse de nage dans les essais de la sonde avec transgène comme variable et des essais inter-sujets comme la variable intra-sujet.
- Plateforme indice de passage
- En utilisant la configuration d'essai de la sonde pour chaque souris, l'indice plateforme de passage (PCI) est calculé en utilisant la formule suivante: PCI = nombre de fois que la souris traverse l'emplacement cible - passages moyennes de l'emplacement équivalent dans les 3 autres quadrants.
Note: Ceci est effectué pour déterminer si la souris utilise une stratégie de recherche spatiale, comme indiqué par plusieurs passages sur l'emplacement de la plate-forme de formation, ou une stratégie de non-spatiale de thigmotaxic natation, comme indiqué par les passages à peu près égales sur les quatre emplacements. - Conduite répétéeMesures ANOVAs sur PCI avec transgène comme variable et des essais inter-sujets comme la variable intra-sujet.
- En utilisant la configuration d'essai de la sonde pour chaque souris, l'indice plateforme de passage (PCI) est calculé en utilisant la formule suivante: PCI = nombre de fois que la souris traverse l'emplacement cible - passages moyennes de l'emplacement équivalent dans les 3 autres quadrants.
- Le pourcentage de temps ou la distance dans le quadrant pour cent
- Calculer le temps de pour cent ou de la distance chaque souris passe dans les quatre quadrants du labyrinthe. Mener des mesures répétées ANOVA sur le pour cent du temps, ou la distance, avec transgène comme variable et des essais inter-sujets comme la variable intra-sujet. Utilisez le temps de pour cent à déterminer si une stratégie de recherche spatiale est utilisée; conclusions de temps d'environ 25% dans le quadrant cible indiquent souris sont performants au niveau de la chance et ne pas utiliser une stratégie de recherche spatiale.
- O / N oublier
- Comparer le temps de latence de la zone de la plate-forme de passage sur le procès de la sonde à la latence de localiser la plate-forme sur la dernière épreuve de la journée précédente. Remarque: Si le temps de latence de la traversée de la plate-forme sur le procès de la sonde est significativement plus long que le temps de latence pour trouver la platform lors de la dernière épreuve de la plate-forme cachée de la veille, puis O / N oubli de l'emplacement de la plate-forme est en cours.
- La vitesse de natation
- Analyse post-hoc
- Suivez RMANOVAs significatives avec les comparaisons post hoc de transgène à chaque procès.
6. Exemple de Re-optimisation pour un nouvel environnement de test
- Pré-traitement. Mener pré-traitement dans la chambre de logement. Placez les cages sans couvercle sur un chariot de transport pour toute la session.
Remarque: Objectifs pour la modification de la procédure de pré-traitement sont à introduire plus progressivement manipulations de gestionnaire et de l'exposition aux appareils de transport (bêcher et ramasser) et d'augmenter les souris de temps sont dans la cage de la maison sans couvercles de microisolation et à l'extérieur de leur cage dans un champ ouvert et des conditions de lumière brillantes.- Jours 1 et 2
- Autoriser les souris à acclimater à la main étant dans la cage, suivis par le toucher doux, Suivie par être levée pour l'inspection de tatouage et le marquage de la queue. À partir du jour 2 de pré-traitement, placer le matériau de nidification supplémentaire dans la cage de fournir du matériel supplémentaire pour la construction du nid et des abris tandis couvercles ont été enlevés 9.
- Jours 3 et 4
- Placer le bécher de transport, scoop, et le drapeau de la plate-forme visible dans la boîte de pré-traitement et permettent d'explorer souris pour 2 essais à 2 min par essai.
- Ne pas utiliser de l'eau dans ce protocole lors de la pré-traitement. Plutôt, assurer la boîte contient suffisamment de litière propre pour couvrir le sol et est parfumé avec une petite quantité de litière souillée féminin et masculin, si les deux sexes sont actuellement testées. Changer la litière chaque jour.
- Jour 5
- La place souris dans la boîte pré-traitement contenant la litière peu sale et le drapeau de la plate-forme visible pendant 3 essais, pendant 20 secondes chacune. Utiliser le bécher et le godet pour le transport des souris et à partir de la boîte.
- Visible formation de plate-forme
- Réglez la température de l'eau à 27 ° C (couramment utilisé pour l'environnement de test Minnesota).
- Retourner les souris à la cage de la maison à l'acquisition de la plate-forme indicé.
- Autoriser les souris jusqu'à 60 secondes d'acquérir la plate-forme visible.
- Organiser des séances de formation composé de 3 essais par jour pendant 5 jours.
- Invisible formation de plate-forme
- Modifier des repères visuels. Sauf pour un grand rideau pour obscurcir le gestionnaire, soit d'éliminer ou de rendre plus étroites les autres rideaux autour de la piscine de manière à avoir une chambre plus ouvert. Placer des objets supplémentaires dans la chambre (par exemple, étagères exposé, affiche de tissu noir avec un symbole blanc, un ballon de plage en noir et blanc, de grandes cheminées noires, portables, et un animal en peluche noir), résultant en une cue- visuelle équilibrée mais plus varié définir que précédemment utilisé.
- Commencez caché la formation de la plate-forme 72 heures après l'achèvement de la plate-forme visible training, avec un intervalle d'environ 30 minutes entre les essais.
- Organiser des séances de formation composé de 2 essais pendant 8 jours.
- Essais de la sonde
- Effectuer des essais de sonde 72 heures après des essais de formation cachés 8, 12, et 16.Include un intervalle de 3 jours entre les essais 8-9, et 12-13 de la formation.
- Réglez le temps de la durée de la sonde pendant 30 sec.
- Jours 1 et 2
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Representative Results
Nous avons utilisé le labyrinthe d'eau de Morris pour étudier les effets de la bêta-amyloïde (souris Tg2576) et mutant P301L tau (RTG (TauP301L) 4510 souris) sur la mémoire de référence spatiale (par exemple, 1,5,7,8). Figure 3 est le résultat représentant signalé dans notre étude sur l'effet de l'âge adulte P301L tau expression sur l'apprentissage et la mémoire 8, en utilisant des tests Environnement A. Pour évaluer moteur et visuels capacités, les souris ont été comparés entre les blocs de formation de la plate-forme visible, où chaque bloc de formation se composait de 3 essais. Longueur de parcours dans la formation de la plate-forme visible ne différait pas entre les contrôles et les souris TauP301L (Figure 3A), suggérant transgène positif et négatif souris présentent piscine comparables et les deux groupes peut voir le repère visuel (drapeau) marquant la plate-forme. Aucune souris ont été identifiés comme étant incapable performance sur la base des critères d'exclusion. Ensuite, la performance dans cachée bloc de la formation de la plate-forme a été comparée, où chaquebloc est constitué de 1 jour (4 essais) de la formation. Comme les souris ont appris la localisation de la plate-forme, la longueur de trajet et de temps pour trouver la plate-forme ont diminué. Cependant, longueur de trajet était significativement plus longue chez les souris TauP301L par rapport aux témoins à chaque bloc de formation (figure 3B), ce qui suggère l'apprentissage spatial a été altérée chez les souris TauP301L. Quatre essais de sonde, dans lequel la plate-forme a été enlevé, ont été intercalées dans la formation de la plate-forme cachée et ont eu lieu au début de la journée, avant le début de la formation de plate-forme cachée. Ainsi, ces essais de sonde mesurées mémoire de référence spatiale. La comparaison entre ces quatre essais de sonde, des contrôles nettement améliorée avec une formation supplémentaire (figure 3C), comme indiqué par l'augmentation du temps dans le quadrant cible. En revanche, les souris TauP301L n'a pas amélioré avec une formation supplémentaire. Ainsi, les plus grandes différences entre les deux groupes à cet âge se sont produites au procès de la sonde 4. Ces données indiquent que l'expression de la protéine tau P301Lest associé à la fois l'apprentissage spatial et spatiales déficits de la mémoire de référence. Bien que la tâche de labyrinthe d'eau peut être relativement stables à des différences de procédure, la F1 FVB / N x 129S6 souche de fond peut être particulièrement sensible à certains changements environnementaux. Le premier protocole décrit a également été utilisé avec succès dans l'environnement B (par ex., 1,7). Cependant, les performances de la sonde de type sauvage était significativement plus faible lorsque le premier protocole a été utilisé dans un troisième emplacement, Environnement C. Le protocole de re-optimisé amélioré significativement les performances de la sonde de type sauvage (figure 4).
Figure 1:. Optimisation du protocole pour l'arrière-souche de type sauvage des souris âgées de 7-8 mois ont été formés en utilisant les mêmes indices et de l'environnement de test. F1 FVB / N x 129S6 (N = 24) et B6 / SJL (N = 16) des souris d'abord reçu 18 et 24 pla visibleessais de formation tform respectivement livrés à 6 et 8 essais par jour, respectivement. Les deux souches ont reçu 4 cachés essais de formation de la plate-forme par jour. Pour F1 FVB / N x 129S6 souris, des essais de sonde ont été effectuées 20 heures suivant 8, 12, 16, et 24 essais de formation. Pour les souris / SJL B6, essais de sonde ont été réalisées 20 h après 12, 24, et 36 essais de formation.
Figure 2:. Chronologie souris ont reçu une formation de la plate-forme visible pendant 3 jours, 6 essais par jour, suivie d'une formation de plate-forme cachée pendant 6 jours, 4 essais par jour. Quatre essais de sonde ont été réalisées 20 heures après 8, 12, 16, et 24 essais de formation cachés.
Figure 3: Les résultats représentatifs pour les souris labyrinthe aquatique de Morris TauP301L portant le P humaine.Gène tau 301L ont été examinés à environ 6,5 mois d'âge après trois mois d'expression P301L tau (n = 41 et n = tauP301L 46 contrôles avec un nombre à peu près égal d'hommes et de femmes dans chaque groupe). (A) dans la formation de trajet optique plate-forme visible ne différait pas entre les contrôles et les souris TauP301L (p s> 0,05). (B) Au cours de la formation de plate-forme cachée, souris TauP301L démontré significativement plus longues longueurs de trajet à travers tous les blocs de formation (Transgene: F (1, 83) = 41,96, p <0,0001; Transgene × Bloc: F (5, 415) = 0,6141, p = 0,69 ). (C) améliorer les contrôles sur les quatre essais de sonde, alors que les souris TauP301L ne l'ont pas (Transgene: F (1, 83) = 29,1, p <0,0001; Transgene première instance ×: F (3, 270) = 4,91, p = 0,008). Chaque bloc de la formation composée de 3 essais pour la formation de la plate-forme visible ou 4 essais pour hidden formation de la plate-forme. Tukey analyses post-hoc: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001. Des portions de la figure 3 tiré à part de Hunsberger et al., La taille Effet de déficits de la mémoire chez des souris avec P301L tau expression de l'adulte, Behav Brain Res, Vol. 272, pp. 181-95. Droit d'auteur 2014, avec la permission de Elsevier.
Figure 4: Partitions sonde sont sensiblement affectés par Environnement de test et le Protocole formation de trois groupes de tau F1 négative FVB / N x 129S6 souris formé en utilisant diverses combinaisons de protocole de la formation et de l'environnement de test générés significativement différents scores de sonde suivantes sont 8, 12, et 16 la formation. essais (groupe: F (2, 42) = 14,89, p <0,0001; Groupe d'essai x: F (4, 84) = 1,10, p = 0,36). Souris formés en utilisant le protocole 1 et le same série de signaux appliqués affichés scores de sonde significativement plus faibles dans l'environnement C par rapport à l'environnement B (Environnement: F (1, 25) = 28,58, p <0,0001; Environnement x Trial: F (2, 50) = 1,93, p = 0,16) . Souris formés dans le cadre de l'environnement C affiche scores significativement plus élevés de la sonde lorsqu'elle est modifiée indices et le Protocole de ré-optimisé 2 ont été utilisés par rapport à des souris formés en utilisant les indices originaux et Protocole 1 (Protocole: F (1, 30) = 15,32, p <0,001; Protocole x procès: F (2, 60) = 0,91, p = 0,41) ** p <0,001; *** p <0,0001..
| Jour 1 | Labyrinthe aquatique de Morris - Cohorte: | Date: _________ | ||||||
| Plate-forme dans le quadrant SE | Tester: &# 160; Heure de début: Heure de fin: Température de l'eau: | 1m temps d'essai max / 15s sur la plate-forme / * placées sur la plate-forme | ||||||
| Groupe 1 | ||||||||
| Essai 1 | ||||||||
| ID animale | Marquage | Cage # | Fin temps | Libération point | Plate-forme emplacement | Trouver plate-forme? | Temps | Notes (ie comportement étrange) |
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| 20 minutes ITI | ||||||||
| Essai 2 | ||||||||
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| 20 minutes ITI | ||||||||
| Essai 3 | ||||||||
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| 20 minutes ITI | ||||||||
| Trial 4 | ||||||||
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Tableau 1:. Plate-forme cachée Run Feuille Une feuille de course exemple dans lequel la plate-forme est située dans le sud-est (SE) quadrant est fourni. L'expérimentateur doit écrire le numéro d'identification de la souris, toute marque distinctive sur la queue ou les oreilles, et le regroupement de la cage. Le point de presse est indiqué sur la feuille et devrait être pseudo-aléatoirement déterminée comme décrit dans l'étape 3.3.2. Enregistrez si la souris trouve la plate-forme et le temps de trouver la plate-forme. Comportement étrange, y compris flottant ou thigmotaxis, devrait noté.
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Discussion
La tâche MWM est largement utilisé pour évaluer l'apprentissage spatial et la mémoire. Cependant, la robustesse de cette tâche peut être influencée par de nombreux facteurs et nécessite une optimisation à la fois la souche de fond et de l'environnement de test. Comme le montre la figure 4, le même protocole de formation et appliqué repères visuels utilisés dans les deux chambres de tests différents (taille et l'agencement équivalent) a donné des performances de la sonde sensiblement différente. Depuis de nombreuses caractéristiques de la salle d'examen pourraient contribuer à des indices spatiale 4, il a été spéculé que les deux chambres étaient significativement différente d'une certaine façon inconnue qui a effectué l'épreuve plus difficile. En modifiant les indices extra-labyrinthe, nous avons opté pour augmenter efficacement le nombre de repères visuels. En outre, en réduisant au minimum l'utilisation de rideaux, des signaux auditifs ou olfactifs qui pourraient exister peuvent avoir été altérées. Le niveau de luminosité de deux salles de test sont équivalentes, mais le niveau de lumière la maison de la cage dans le nouveau vivarium était plus faible, ce qui entraînedans un écart de niveau de lumière plus élevée lors du passage de la maison cage pour salle de test. Il a été suggéré que les souris BALB / c sont en mesure d'effectuer la tâche MWM fournir les niveaux de lumière sont suffisamment faible 14. Cependant, les tentatives pour améliorer les performances en abaissant les niveaux de lumière des salles d'essais ont été infructueux (observations non publiées). À ce jour, on ne sait pas quel facteur (s) a contribué à la baisse de la performance dans le nouvel environnement de test, mais le pré-traitement modifié, indices, et le protocole de formation ont abouti à une augmentation significative des scores de la sonde.
Si possible, il est conseillé de tester un groupe de type sauvage ou souris de contrôle de la même souche de fond et l'âge que l'expérience prévue pour évaluer le taux de l'apprentissage et le placement de la sonde optimale pour l'environnement de test particulier. Idéalement, la première sonde est placée lorsque environ la moitié de la souris sont affiche un biais probable positifs de recherche (% de -temps dans target≥35) et la dernière sonde lorsquela plupart des souris témoins montrent un biais positif et de recherche ont atteint le plateau de la performance. Cette stratégie a été utilisée pour déterminer le placement de sonde pour un rendement supérieur (F1 FVB / N x 129S6) et un fond qui a appris plus lentement (mixte C57BL / 6 x FVB / N x 129S6), où environ la moitié des souris avait établissements de quadrant cibles de ≥35 après 8 essais ou 18 essais respectivement avec un groupe moyen d'environ 35% -temps pour la première sonde. Sondes suivantes devraient être plus élevés que la première si elle est définie dans ce mode, idéalement avec au moins une différence de 15 points par rapport au niveau de référence de 25% -temps. Si l'on compare les scores de sonde qui sont modérément faible (~ 35% de -time), veiller à ce que cela représente un biais important pour la cible et donc une différence valide, en comparant la cible à la non-cible quadrants 4,5. En outre, la moyenne de groupe minimum ne doit pas être sensiblement inférieur à 25% -Le temps dans le quadrant de la cible, ce qui serait considéré comme la ligne de base ou la performance du hasard. Targ comparantet l'occupation non-cible peut aider à identifier si il ya des préjugés dans la chambre, par exemple, les souris passent plus de temps dans le quadrant opposé à l'un des quadrants adjacents serait un motif de recherche inattendue.
Certaines recommandations tout en effectuant des tests incluent la limitation du nombre de personnes diagnostiquées chaque cohorte d'animaux à 1 individu à réduire la variabilité dans la manipulation et de tester styles entre expérimentateurs, et d'effectuer des essais à la même heure chaque jour. En outre, il a été suggéré que les souris recevant 2 essais par jour à savoir presque aussi rapidement que ceux qui reçoivent quatre essais par jour 15. Il est essentiel que les animaux provenant de différentes souches / backgrounds / groupes de traitement être représentés dans chaque groupe de test si plus d'une cohorte doit être exécuté pendant une journée. Enfin, il faut prendre soin d'assurer les souris ne deviennent pas d'hypothermie, comme l'hypothermie peut affecter les performances et le sexe et la souche de fond dépendante 16. Bien que ee intervalle entre les essais utilisé ici (20 min) doit être suffisante pour éviter l'hypothermie, d'autres méthodes incluent le réglage de la température de l'eau, en plaçant la souris dans une cage de maintien chauffée entre les essais, ou une combinaison des deux, comme nécessaire. Toutefois, il convient de noter que la température de l'eau peut influencer la performance dans les deux directions. Par exemple, les rats proestrus réussissent mieux dans des conditions chaudes (33 ° C), tandis que les rats oestraux réussissent mieux dans des conditions froides (19 ° C) 17. Ainsi, il faut prendre soin de contrôler les températures de l'eau à travers des expériences. Si l'hypothermie être une préoccupation pour un animal particulier, l'expérimentateur pourrait main sèche cet animal avec une serviette en papier dans le cas où ils ne parviennent pas à toiletter post-baignade ou donner une indication du comportement d'hypothermie. Évaluation périodique de la température du corps peut assurer les conditions sont suffisantes pour empêcher l'hypothermie.
Une autre considération procédurale concerne visible plateforme training. Jeunes souris ou une autre souche peuvent avoir besoin de moins d'essais de formation de la plate-forme visibles. Une directive proposée est de former jusqu'à ce que le groupe de contrôle a atteint étage de la performance au cours des derniers 3-6 essais consécutifs de formation, fournissant le groupe expérimental affiche des performances équivalentes. Si la conception expérimentale comprend souris à la fois jeunes et vieux, de définir la durée de la formation de la plate-forme visible pour le groupe, qui exige le plus grand nombre d'essais de formation pour atteindre étage de performances 5. En outre, la plate-forme visible peut être efficace vers l'acclimatation des souris à la procédure de manipulation et d'essai et peut éviter la nécessité de pré-traitement si la souris ne sont pas très jeune quand d'abord testé ou de la manipulation humaine ne soit pas trop agressif pour la souche testée.
Avantages généraux de l'labyrinthe d'eau de Morris comprennent son insensibilité relative aux facteurs de motivation par rapport aux tâches à base d'aliments, sa validité comme une mesure de l'hippocampe-dépendante naissainNavigation ial et de la mémoire de référence, et son efficacité 15 inter-espèces. Une limitation potentielle de la technique est que, parce que ce protocole est adapté pour une souche de fond spécifique, il peut ne pas être efficace avec d'autres animaux ou d'autres souches de souris de fond. En outre, dans le cadre du protocole, des tentatives sont faites pour créer et placer stratégiquement repères identifiables dans toute la pièce mazing. Cependant, on ne sait pas quelle hauteur exacte est optimale lorsque vous placez des indices autour de la salle. Ainsi, les indices qui sont grandes et se distinguent les uns des autres sont nécessaires pour une formation efficace.
En résumé, l'optimisation de la tâche MWM pour une utilisation avec une souche de fond particulier et de tester l'environnement peut considérablement augmenter la plage dynamique de la tâche, ce qui entraîne beaucoup de temps et des économies de coûts.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Institut national des sciences médicales générales (Reed / Engler-Chiurazzi - U54GM104942), l'Institut national de Neurological Disorders and Stroke (Ashe - R01NS33249, R01NS63249 et R01NS79374), Cobre (Engler-Chiurazzi - P20GM109098), le Association Alzheimer (Reed - NIRG-12-242187), un WVU recherche Faculté Sénat Grant (Reed), une subvention WVU PSCOR (Reed), et des fonds internes du Collège WVU du Bureau de médecine Dean (Engler-Chiurazzi). Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Association NIH ou d'Alzheimer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viewer Tracking software | Biobserve | This particular software is not a requirement - there are other tracking systems available | |
| Pre-handling pool | Dimensions approximately 1 foot wide x 2 feet long x 1.5 feet deep | ||
| Plastic beaker | 1 L | ||
| Scoop | |||
| Small net | |||
| Stopwatch | |||
| Non-toxic white tempera paint | Any color paint can be used; however, most tracking software programs require that the paint contrast with the color of the animal. | ||
| Visible platform | Color should contrast that of maze | ||
| Curtain rod | |||
| Curtains | |||
| Circular tub | Usually white in color; approximately 4 feet in diameter | ||
| Hidden platform | Painted same color as the water |
References
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