Étiquetage et à médiation virale transplantation de Medial ganglionnaire Eminence (MGE) Cellules pour Published: April 23, 2015 doi: 10.3791/52740

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Daniel Vogt¹, Pei-Rung Wu¹, Shawn F. Sorrells², Christine Arnold², Arturo Alvarez-Buylla², John L. R. Rubenstein¹

¹Department of Psychiatry, University of California San Francisco, ²Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco

Summary

GABAergiques progéniteurs des interneurones corticaux dispersent, développer et synaptique intégrer dans un cortex hôte après la transplantation. Ces cellules peuvent être facilement transduites avant la transplantation pour les études in vivo de précurseurs GABAergiques génétiquement modifiés. Ici, nous montrons les techniques de marquage viraux pour cibler des sous-groupes de interneurones spécifiques utilisant des lignes existantes et les journalistes Cre Cre-dépendantes.

Abstract

GABAergiques interneurones corticaux, provenant de la médiane embryonnaire et éminences ganglionnaires caudale (MGE et CGE), sont fonctionnellement et morphologiquement diversifié. Incursions ont été réalisés dans la compréhension des rôles des différents sous-groupes de interneurones corticaux, cependant, il ya encore de nombreux mécanismes pour être élaborés qui peuvent contribuer au développement et à la maturation des différents types de cellules GABAergiques. De plus, la signalisation GABAergique modifié peut contribuer à des phénotypes de l'autisme, la schizophrénie et l'épilepsie. Lignes Cre-pilote spécifique ont commencé à morceler les fonctions de sous-groupes de interneurones uniques. Malgré les progrès réalisés dans des modèles de souris, il est souvent difficile d'étudier efficacement des interneurones GABAergiques progéniteurs corticale avec des approches moléculaires in vivo. Une technique importante utilisée pour étudier la programmation autonome des cellules de ces cellules est une transplantation de cellules dans le cortex MGE hôtes. Ces cellules transplantées migrent largement, différencier, une intégrer fonctionnellement. En outre, les cellules peuvent être efficacement MGE transduites avec des lentivirus immédiatement avant la transplantation, ce qui permet une multitude d'approches moléculaires. Ici, nous en détail un protocole de transduire efficacement des cellules MGE avant la transplantation pour l'analyse in vivo, en utilisant des lignes disponibles Cre-conducteur et des vecteurs d'expression Cre-dépendantes. Cette approche est avantageuse car elle combine la manipulation génétique précise de la capacité de ces cellules à se disperser après la transplantation, ce qui permet une plus grande résolution spécifique de type cellulaire in vivo.

Introduction

GABAergiques interneurones corticaux comprennent ~ 20-30% de neurones dans le néocortex des mammifères, tandis que le reste correspond aux neurones excitateurs principaux glutamatergiques. Interneurones sont très diverses dans les propriétés électrophysiologiques, axone et la morphologie des dendrites et synaptique ciblage ^1, et les déséquilibres dans le ton excitateur / inhibitrice sont émis l'hypothèse à la base des phénotypes de troubles neuropsychiatriques / neurologiques, y compris l'autisme, la schizophrénie et l'épilepsie ^2. L'objectif global du protocole décrit ici est de fournir un moyen de modifier efficacement génétiquement GABAergiques progéniteurs des interneurones corticaux avant la transplantation in vivo analyses.

Interneurones corticaux GABAergiques sont nés dans les éminences ganglionnaires médial et caudal (MGE et CGE, respectivement) ^3,4 ainsi que l'aire préoptique ^5. Progéniteurs des interneurones corticaux subissent longue distance la migration tangentielle suiviepar la migration radiale pour atteindre leurs objectifs finaux. À l'arrivée à leur destination, ces interneurones corticaux doivent intégrer correctement dans le réseau neuronal existant, et chaque sous-groupe de interneurone uniques contribueront à circuit cortical de manière spécifique. Quatre sous-groupes principaux peuvent être distingués par marqueurs moléculaires: la somatostatine MGE dérivés (SST) ⁺ et parvalbumine (PV) ⁺ sous-groupes, et le peptide dérivé CGE-intestinal vasoactif (VIP) ⁺ et ⁺ Reelin; SST ^{- 6} sous-groupes. Différents sous-groupes des interneurones corticaux sont nés au cours des moments différents au cours du développement embryonnaire dans la CGE et MGE ^{7, 8.} Ceux-ci et d'autres marqueurs corticales d'interneurones GABAergiques ont été utilisées pour générer des lignées Cre-pilote spécifique pour bon nombre de ces sous-groupes ^9-11.

La transplantation de progéniteurs de MGE a émergé comme une thérapie à base de cellules potentiel pour traiter les troubles qui peuvent être causés par des déséquilibresdans l'excitation / inhibition ^12-24. Ces avantages thérapeutiques peuvent être dues en partie à la capacité unique de progéniteurs de MGE (pour disperser, de se différencier et de se intégrer dans un cerveau de l'hôte), ou potentiellement parce que beaucoup de péri-somatiques PV inhibitrice ⁺ cellules sont dérivées de la MGE. MGE cellules peuvent également être rapidement et efficacement transduction avec lentivirus avant la transplantation ^15, permettant aux cellules qui sont génétiquement modifiées in vitro pour être étudiées in vivo. La justification de l'élaboration de cette approche était de surmonter les obstacles à l'étude GABAergique développement des interneurones corticaux et la maturation. En particulier, MGE transplantation a permis aux chercheurs d'étudier le développement de cellules mutantes in vivo, lorsque la souris mutante aurait autrement mort à un point de contrôle d'avance. En outre, par l'introduction de gènes d'intérêt avant la transplantation, les effets de gènes spécifiques d'un phénotype mutant ont pu être évalués dans un effmanière isant.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la transduction de cellules MGE avec lentivirus avant la transplantation. En outre, nous montrons comment cette technique peut être adaptée pour exprimer un gène d'intérêt dans les sous-groupes des interneurones spécifiques dans un groupe hétérogène de précurseurs des interneurones corticaux, en utilisant une combinaison de lentivirus d'expression Cre-dépendantes et des lignées de souris Cre-pilote disponibles. En outre, ce protocole introduit des techniques et une plateforme pour les chercheurs à modifier génétiquement des interneurones GABAergiques précurseurs corticale pour les études in vivo d'une manière unique. Un avantage de cette technique par rapport à d'autres approches actuelles est que les cellules transplantées MGE se disperser à distance du site d'injection. Aussi, contrairement à injections virales focaux, après que les cellules de MGE dispersent leur morphologie est plus facile à évaluer. Cette approche peut être utilisée pour étudier l'effet de l'introduction de gènes d'intérêt dans le type sauvage ou cellules mutantes, l'introduction d'un type de cellule spécifiquereporter pour évaluer la morphologie, ou potentiellement pour étudier l'effet d'allèles pathologiques in vivo.

Protocol

Déclaration éthique: Les procédures suivantes ont été approuvées par notre protocole de l'institution et animale. Assurez-vous d'obtenir l'approbation pour toutes les procédures impliquant des chirurgies de survie avant de commencer les expériences et de vérifier tous les protocoles sont à jour.

1. Préparation lentivirus (étape optionnelle)

1. Fractionner trois plaques de 10 cm de cellules HEK293T pour chaque lentivirus à faire, en présence de 10 ml de DMEM / FBS à 10%, et de croître à ~ 60-70% de confluence. Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2.
2. Transfecter les plasmides suivants d'ADN (10 pg au total) dans chaque plaque en utilisant ne importe quel réactif de transfection: 6,4 ug CAG-Flex-GFP vecteur lentiviral (séquence de vecteur d'ADN fournis dans le tableau 1), 1,2 ug pMD2.G (encode VSV-g), 1,2 pg pRSV-Rev, et 1,2 ug pMDLg / pRRE. Les trois vecteurs lentiviraux d'emballage sont disponibles dans le commerce (tableau
   Remarque: Cette approche particulière utilise 3e génération lentivirvecteurs al mais vecteurs de 2ème génération et plasmides associés fonctionnera également.
3. Préparer un conteneur de déchets contenant une solution d'eau de Javel à 10% dans un BSL2 certifié hotte pour inactiver des solutions ou des dispositifs qui ont communiqué ou qui contiennent des lentivirus. Ensuite, supprimer complètement les médias 4-6 heures après transfection dans la solution d'eau de Javel, le remplacer par le même volume de nouveaux médias, et permettent aux cellules de se développer.
4. Après quatre jours, recueillir des médias dans 50 ml tubes et centrifuger coniques à 1 000 g pendant 15 min à agglomérer toute débris cellulaires. Ensuite, filtrer le surnageant à travers une membrane de 0,45 um. Tout filtre liaison faible en protéines, comme le PVDF, fonctionne bien. Attention: place à la fois des déchets solides et liquides virale dans la solution d'eau de Javel.
5. Charge 30 ml filtrés surnageant dans des tubes ultracentrifugation et dans une ultracentrifugation. Centrifuger à 100 000 x g pendant 2,5 heures à 4 ° C. Ouvrez les tubes à centrifuger dans une hotte de BSL2 et retirez surnageant dans 10% Bleach. Ajouter ~ 100 pi de PBS à la pellet, ce qui donne des titres de 1x10 ^ infectieux 8.7 unités / ml. Aliquoter la journée et magasin suivant à -80 ºC. Des aliquotes de lentivirus sont stables à -80 ° C pendant au moins six mois.
6. Considération importante: de nombreuses institutions ont désormais cores viraux. Acquérir virus concentré avec un titre minimum de 1x10 ⁷ infectieuses unités / ml, pour des résultats optimaux.

2. souris donneuses pour MGE Dissection

1. Tout d'abord, mettre en place un accouplement chronométré entre une ligne exprimant Cre d'intérêt et d'un type sauvage (WT) ou une souris qui exprimera un journaliste après recombinaison Cre-médiation.
   Remarque: De nombreuses lignes Cre-pilote sont transgéniques et sont maintenus et élevés dans l'état hémizygote. Ainsi, seule la moitié des embryons contient le transgène Cre. L'ADN peut être rapidement préparé à partir des embryons pour une courte PCR pour détecter l'allèle Cre. Les Cre ⁺ embryons peuvent ensuite être récoltées de sorte que seul le tissu MGE du génotype désiré est utilisé. AlternatiVely, un journaliste Cre dépendant peut être utilisé, pour sélectionner les embryons pour MGE dissection et la transplantation.
2. Calculer jours qui correspondra à E13.5. Si les animaux ont été jumelés la veille, le jour de la fiche est de 0,5. Ordre souris chronométré enceintes ou une femelle WT avec chiots P1 pour le temps ayant postnatal (P) une souris sur le jour où le tissu du donneur sera E13.5. Sinon, mettre en place ces accouplements dans la maison une semaine avant appariement des animaux donneurs.
   Remarque: La première stratégie de générer à la fois et E13.5 embryons P1 / chiots pour le même jour est souvent difficile de faire de manière fiable.

3. Préparation des médias, outils et équipements.

1. Préparer les réactifs et des outils pour la préparation de cellules MGE (tableau 2).
   1. Préparer une surface propre et placez pinces propres, des ciseaux et un couteau soit microchirurgicale ou une pince fine (pour la dissection des tissus précise) sur la surface.
   2. Préparer la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS), fou dissection, et le milieu de Eagle modifié de Dulbecco de (DMEM) avec 10% surem bovin fœtal (FBS), par transduction.
   3. Préincuber 20-30 ml de DMEM / 10% de FBS dans une culture tissulaire C incubateur à 37 ° C pendant environ 1 heure. Le couvercle doit être desserré pour permettre l'échange de gaz et pH équilibration des médias.
      Remarque: Le pré-incubation des médias peut être préparé juste avant de commencer la dissection.

4. Préparation des cellules MGE

1. Sacrifiez la souris enceinte selon un protocole animale approuvé et enlever les embryons dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant glacée HBSS.
2. Retirer le cerveau de chaque embryon en utilisant un microscope à dissection (faire un à la fois, en laissant le reste des embryons dans glacée HBSS), puis passez à découper le tissu MGE.
   Remarque: détaillée ci-dessous, et à la figure 1, sont des étapes clés montrant comment retirer le MGE. En outre, la figure 2 est un film montrant l'ensemble de la dissectionprocédure.
   1. Positionner le cerveau avec le côté ventral vers le haut (figures 1A, A '). Remarque: il est également normal d'avoir la face dorsale vers le haut. Couper le cerveau en deux le long du plan sagittal pour générer deux pièces. Un exemple hemisected cerveau est représenté (figures 1B, B '), notez que dorsale (le cortex sus-jacente) et ventrale du couvercle du cerveau et entourer le tissu éminence ganglionnaire (GE).
   2. Ensuite, avec une main dominante, détenir soit des pinces très fines ou un stabknife (tableau 2), tandis que l'hémisphère immobiliser avec des pinces détenues par une main non-dominante. (Face interne de l'hémisphère doit être orientée vers le haut). Dépliez la dorsale et ventrale tissus avec une pince et un coup de couteau à révéler le tissu sous-jacente GE (figure 1C et schématisé à la figure 1C).
      Remarque: la suppression des médias de dissection le plat de Pétri, il peut être plus facile à stabiliser le tissu tout en performing la dissection MGE.
   3. Faire des coupes droites avec le stabknife ou pinces fines pour séparer la CGE, LGE et les tissus du septum (voir l'exemple des réductions indiquées par les pointillés rouges, les figures 1D et D '). Ces coupes peuvent être faites dans ne importe quel ordre.
      Remarque: Imaginez le MGE comme une «boîte» qui est coupé sur le tissu environnant. Cela contribue à rendre reproductible réductions similaires pour chaque dissection, réduisant ainsi la variabilité dans les dissections de tissus.
   4. Enfin, tourner la MGE sur le côté et couper le bas (ce qui était l'aspect latéral du cerveau). Cela supprime la zone du manteau de la MGE (jeter dans les figures 1E et 1E ') du reste de la MGE. Le dernier élément de MGE zone contient principalement ventriculaire et des parties de la zone sous-ventriculaire MGE, qui contient la quasi totalité des cellules progénitrices MGE. Procéder à ce tissu.
3. Considération importante: L'addition de gel de silicone sur le fond d'une boîte de Pétri can servir une excellente surface de dissection, car il protège les conseils délicates de pince et fournit une surface douce pour les tissus épinglant avec une pince.

4,3 stratégies supplémentaires pour MGE dissection.

1. Couper la peau de l'embryon en utilisant des pinces comme des ciseaux pour enlever rapidement le cerveau. Comme l'embryon fixe sur le côté, maintenir le tissu à la base de la tête avec les pinces utilisées pour ancrer le tissu. Premièrement, couper antérieure ventrale du cerveau et postérieure ventrale au cerveau, puis connectez les deux coupes le long du côté de l'embryon. Ensuite, prenez le lambeau de peau et tirez sur la partie supérieure du cerveau. Le cerveau peut alors être rapidement disséquée à partir du tissu restant.
2. En variante, l'ancre de la face postérieure de l'ensemble du cerveau du cortex. Pendant ce temps, saisir chaque hémisphère à l'aspect le plus caudale dorsale du cortex et déchirer le cortex loin du tissu ancré dans une direction antérieure. De cette manière, les deux cOrtices peuvent être retirés et les éminences ganglionnaires bilatérales sont révélés, encore attaché au reste du tissu préserver l'anatomie médio-latérale.
3. Passer au coup-couteau pour faire des coupes précises autour de la MGE sur chaque hémisphère. Utilisez soit un ensemble propre distincte de forceps pour recueillir le MGE ou d'une pipette avec une grande pointe (ie., P1000).
   Remarque: Gardez le tissu prélevé loin de tout autre matériel disséqué, comme certains médias est inévitablement transféré lorsque le MGE est recueilli.
4. Recueillir le MGE et mettre le tissu dans un tube de 1,5 ml de collecte contenant DMEM / 10% de FBS, (un volume de 500 ul est suffisante pour recueillir les MGES). Répétez l'opération pour l'autre hémisphère et le lieu dans le même tube de collecte. Garder les échantillons sur la glace jusqu'à ce que tous les tissus sont recueillis.

5. étiquetage Lentiviral et la transplantation

1. Déplacer les tubes de tissu MGE dans un BSL2 certifié capot et retirez le support.
   Note:Tissus MGE est assez grand pour être visible à l'œil et se déposent au fond du tube permettant pour les médias froids pour être retiré facilement et en douceur.
2. Ajouter ~ 500 ul de milieu DMEM / FBS 10%, qui a été pré-incubés dans une culture incubateur à 37 ° C de tissu. Ensuite, ajouter le polybrène à faciliter la transduction de chaque tube à une concentration finale de 8 pg / ml. Triturer le tissu MGE pour créer une suspension de cellule unique, en utilisant une pointe de pipette P1000. Enfin, ajouter ~ 15-20 ul de concentré lentivirus à chaque tube.
3. Considération importante: Une trituration de 10-12 fois est suffisante pour briser le tissu MGE à partir d'un seul embryon, mais plus triturations peut être nécessaire si plusieurs MGES sont regroupées. Essayez différentes conditions de trituration pour déterminer ce qui fonctionne le mieux.
4. Fermez soigneusement chaque tube, mélanger par inversion, que son lieu tous les tubes dans un incubateur à 37 ° C. Incuber les cellules à lentivirus pendant au moins 30 minutes et jusqu'à une heure. Des temps plus longs ont entraîné dela viabilité des cellules froissé. Inverser les tubes toutes les 10 min jusqu'à ce que le temps est écoulé.
5. Après incubation avec lentivirus, enlever les tubes de l'incubateur et centrifuger à ~ 700 g pendant 3 min pour sédimenter les cellules. Dans la hotte de BSL2, éliminer le surnageant et jeter dans l'eau de Javel à 10%. Ensuite, ajouter 1 ml de DMEM / FBS à 10% et on triture le culot 2-3 fois pour laver, puis centrifuger de nouveau à la même vitesse pour sédimenter les cellules. Répétez cette étape de lavage 2-3 plusieurs fois pour éliminer le virus excès.
   Remarque: Effectuer les étapes de centrifugation à 4 ° C, cependant, la viabilité réduite n'a pas été observé lorsque les tours courts sont effectués à température ambiante.
6. Après le lavage final, éliminer autant que possible les médias et de mettre chaque tube sur la glace. En raison de médias résiduelle sur les parois du tube, 3.2 ~ ul de milieu finira recouvrant le culot cellulaire au moment de la procédure de transplantation a commencé.

6. transplantation et validation

1. Acquérir accueil chiots de P1 et de préparer la procédurezone par pulvérisation vers le bas avec 70% d'éthanol. Pour maintenir la stérilité au cours de la procédure, il est recommandé d'effectuer ces procédures dans une salle dédiée de la procédure de nettoyage. En outre, utilisent soit des outils chirurgicaux autoclaves stérilisent surfaces que les chiots seront en contact avec l'utilisation de 70% d'éthanol. Un exemple d'équipements représentatifs nécessaire pour effectuer les transplantations et une aire de procédure représentatif est montré à la figure 3.

Remarque: Si cette procédure est une injection de petits volumes, et non une procédure chirurgicale qui exigerait une incision, d'une plaie ouverte ou sutures, il est toujours recommandé qu'une nouvelle micropipette est utilisé pour chaque souris à injecter. Les micropipettes sont stérilisés à la chaleur lorsqu'elle est tirée et biseautée sur une surface qui a été pulvérisé avec de l'éthanol 70% étant stockée dans un récipient fermé.

1. Générer micropipettes à avoir un diamètre à la pointe entre 40 à 80 um. Suite à ces dimensions sera un rendement optimalrésultats. Chaleur stériliser les micropipettes lorsqu'il est tiré et biseautée sur une surface et pulvériser avec 70% d'éthanol avant de stocker les micropipettes dans un récipient hermétique.
   Remarque: vous pouvez, si l'accès aux appareils nécessaires pour créer ces aiguilles (tableau 2) est de limiter, utiliser tout autre dispositif d'injection. Toutefois, ceux-ci peuvent ne pas être aussi bien placés que les micropipettes en raison de différents diamètres.
2. Dresser huile minérale dans une seringue de 1 ml, et avec une aiguille 30 G 1/2, remplir la pipette en verre complètement avec de l'huile minérale. Ensuite, montez le piston sur le dispositif stéréotaxique, puis fixez la pipette en verre à l'appareil de stéréotaxie et la charge sur le piston. Utilisation de l'unité hydraulique, déplacer le piston à mi-chemin dans la pipette en verre, enlever l'huile minérale qui se déverse avec un chiffon propre une serviette en papier propre.
   1. En variante à l'aide d'une seringue, immerger l'extrémité arrière de la pipette dans l'huile minérale et rempli par action capillaire. Pour éviter que des bulles d'air dans le pipette, de maintenir une pression positive sur la seringue jusqu'à complètement hors de la pipette en verre.
      Note: D'autres dispositifs peuvent être utilisés pour transplanter avec succès des cellules de MGE ^14. Tout dispositif qui peut fournir un volume inférieur ou proche de 100 œuvres nl ainsi pour cette procédure.
3. Ensuite, utilisez une serviette en papier stérile, ou toute matière absorbante, avec le coin tordu en une pointe fine pour enlever délicatement les supports en excès au-dessus du culot cellulaire MGE. Cette étape se concentre la densité de cellules de sorte que les volumes d'injection plus petits peuvent être obtenus. Ensuite, utilisez un volume faible (P2 est préférable) pipette de tirer lentement le culot cellulaire et triturer 1-2 fois avant de passer la suspension cellulaire sur une surface hydrophobe. Le volume devrait être un peu moins de 1 pl. Déplacez la pointe de l'aiguille dans la suspension de cellules et en utilisant la commande hydraulique, dresser la suspension cellulaire dans la pipette.
4. Anesthésier un chiot de P1 par l'hypothermie (envelopper dans un gant de latex et de mettre sur la glace pendant ~ 2-4 min).Vérifier l'efficacité de l'anesthésie avec un stimulus nociceptif. Pincer la peau entre les orteils avec des pinces fines: le chiot doit être répondre si pincé. Ensuite, placez le chiot sur un moule qui est sous le dispositif d'injection, puis tendre la peau en tirant la peau sur la tête et la fixer avec la bande de laboratoire standard.
   Remarque: Bien que l'hypothermie est très efficace sur des souris néonatales et les résultats en faible taux de mortalité, des procédures doivent être faits rapidement, que les chiots vont commencer à se redresser en moins de 10 min. En outre, 4 min sur la glace est une limite supérieure de ce qui peut être toléré. Essayez seulement d'induire une hypothermie, une fois si un temps plus long est nécessaire pour les injections. Toutefois, si un chiot récupère début, laissez d'abord le chiot de se rétablir complètement avant de provoquer à nouveau l'hypothermie. En outre, seulement induire une hypothermie une fois de plus pour effectuer des injections. Chiots récupérer dans 5-10 min d'hypothermie. Cela peut être facilité en plaçant les chiots avec la litière et maman ou en plaçant le chiot sur une surfac chaudee pour récupérer.
5. En utilisant un dispositif stéréotaxique, positionner la pointe de la pipette de verre sur la surface sur la tête du chiot, perpendiculaire à la surface de la tête. Lorsque la pipette est en contact avec la tête, considérer cela comme «0». Ensuite, pousser la pipette à travers la surface de la peau et le crâne dans le cortex, puis insérer et retirer la pipette ~ 2 fois avant de se arrêter. Pour optimiser le ciblage des cellules dans le néocortex, les injections sont effectuées lorsque la micropipette est à une profondeur de 0,1 mm. Toutefois, cela devrait être optimisée par l'utilisateur (voir note ci-dessous).
   Note: Bien que cette profondeur cible de manière fiable les couches plus profondes du néocortex avec les dispositifs décrits ci-dessus, quelques profondeurs devraient être testés déterminées empiriquement. En outre, une gamme de profondeurs position différente rostro-caudale et médio-latérale doit être testé pour déterminer quelle profondeur est optimale à chaque site. En outre, la ponction initiale doit être rapide, que la pénétration lente dans le néocortex diminue la capacité de cleanly pénétrer le tissu. Essayez différentes vitesses lors du premier démarrage de cette procédure pour trouver ce qui fonctionne le mieux. En outre, pour les coordonnées d'essai, il n'y a pas de véritable substitut à l'aide de cellules marquées, comme colorants ne sont pas fiables pour indiquer la position.
6. Une fois que l'aiguille est en position, faire tourner le dispositif hydraulique pour faire avancer le piston dans la pipette en verre, en poussant un volume déterminé de suspension de cellules dans le cortex. Injecter 50-70 nls par site. Répétez cette procédure à 3-6 sites différents à différents niveaux de rostrales-caudale si l'objectif est d'obtenir une large distribution de cellules dans tout le néocortex.
   Remarque: Les volumes de 100 nl ou plus peuvent provoquer des lésions et conduire à de grosses touffes de cellules injectées qui ne migrer efficacement sur le site d'injection. Ainsi, les volumes d'injection plus petits (~ 70 nl ou moins) sont optimales, sur plusieurs sites, si le temps le permet.
7. Lorsque les injections sont terminée, retirez le chiot de la scène et marquer (tep écrêtage est un moyen fiable pour identifier le pups plus tard). Une fois que le chiot a récupéré et est capable de se déplacer sur son propre (cela se produit en quelques minutes de les retirer de la scène), le remettre avec la maman et de la litière.
   Remarque: Puisque ce est une procédure minimalement invasive il ne existe aucune procédure post-chirurgicales fois le chiot se déplace librement et réchauffé. Cependant, les chiots doivent être vérifiées non seulement après la procédure, mais aussi le lendemain pour se assurer qu'ils ne présentent aucun signe de détérioration de la santé.
8. Avant de commencer la procédure sur le prochain chiot, arroser la zone avec 70% d'éthanol pour maintenir une zone de travail stérile. Laissez les petits injectés pour développer et évaluer ensuite le tissu au stade de développement approprié (s).

Representative Results

Comme les cellules de MGE ont la capacité unique de migrer et intégrer lorsqu'elles sont transplantées dans un néocortex hôte ^16, ils fournissent un excellent système modèle pour la manipulation génétique avant que des études in vivo. Ici, nous montrons comment on peut isoler les tissus MGE partir d'embryons de E13.5 (figures 1 et 2), qui peut ensuite être transduites avec lentivirus in vitro ou d'une manière rapide avant la transplantation pour les études in vivo. Étiquetage MGE via lentivirus a été effectuée avant d'utiliser un activateur de conduite GFP dans les neurones GABAergiques ^15. Toutefois, la capacité d'exprimer des gènes dans les sous-groupes à partir d'une population hétérogène avant la transplantation peut grandement faciliter les études sur la dispersion et l'intégration de ces cellules. Ici, nous avons cherché à développer un moyen de cibler l'expression d'une protéine fluorescente pour un sous-groupe de interneurone spécifique, celles qui expriment la somatostatine (SST) ^+.

Nous Fipremier sous-cloné un journaliste disponible dans le commerce Cre dépendant GFP (informations vectorielles, tableau 2) dans un squelette lentiviral. Le vecteur a été généré par sous-clonage de la première cassette contenant GFP flanqué par des sites loxP du vecteur AAV et ligature dans un vecteur lentiviral squelette ¹⁵ en utilisant les sites de restriction Xbal et PflMI, (cette cassette ne contenait que quelques-uns du promoteur CAG). Ensuite, le reste du promoteur CAG a été excisé à partir d'un vecteur d'expression de mammifère pCAGGS avec les sites Spel et Xbal et ligaturé dans le site Xbal du vecteur lentiviral pour générer pLenti-CAG-Flex-GFP. 5 'site Spel de l'insert est gratuit à Xbal et donc détruit le site 5', tandis que le site 3 'Xbal a été conservée. Le vecteur résultant (schéma de la figure 4A, vecteur séquence tableau 1) a été testée in vitro en premier la présence ou l'absence de Cre (schéma de dosage in vitro, la figure 4B). MGE les neurones primaires de Ai14 ^{Flox / + E13.5 embryons ont été cultivés et transduites avec une combinaison de lentivirus. Peu ou pas de GFP +} ou ⁺ tdTomato cellules ont été observées avec seulement la transduction du CAG-Flex-GFP lentivirus (figures 4C, 4E et 4F). TdTomato fluorescence était présent dans les cellules MGE transduites avec un lentivirus CMV-Cre, indicatif d'expression Cre (figures 4D, 4G et 4J). Enfin, la co-transduction des cellules MGE a entraîné dans de nombreux tdTomato ⁺ cellules qui expriment également GFP, indiquant que le CAG-Flex-GFP lentivirus travaillait comme prévu (figures 4E, 4H et 4K). Certaines cellules GFP ⁺ rares ont été observés qui ne étaient pas tdTomato ^+, susceptibles d'être dus à la journaliste transduction incorporant à côté d'un promoteur fort, qui représentait <2% de toutes les cellules GFP ^+.

contenu "> cellules MGE transplantés dans un type sauvage néocortex d'accueil se dispersent, mature et se intégrer dans le néocortex hôte ¹⁶ E13.5 SST-IRES-Cre ^+;. Ai14 ^{Flox / + MGE} cellules ont été transplantées dans neocortices WT au P1 (schéma, figure 5A) et leur répartition examinés à 7 et 35 jours après la transplantation (DPT). Dans les deux âges, tdTomato cellules ⁺ étaient disséminés à travers le néocortex (figures 5B et 5C). Les images des figures 5B et 5C sont des greffes représentatifs utilisant le MGE . des cellules d'un embryon unique de tester comment efficacement les cellules MGE pourrait être étiqueté avec le protocole décrit ici, les cellules MGE de SST-IRES-Cre ^+; Ai14 ^{Flox / +} embryons ont été transduites avec le lentivirus CAG-Flex-GFP et transplantées dans le même manière. Pour ces expériences, 15 ul de ~ concelentivirus ntrated (~ 1x10 ⁷ unités infectieuses / ml) a été utilisé avec les combinés de MGES un embryon pour chaque greffe. Les cellules ont ensuite été transplantées dans un cortex hôte P1 WT et analysés au 7 DPT (figures 5D-5F). Des cellules transplantées (tdTomato ^+), environ 20% étaient GFP ^+, indiquant transduction avec le CAG-Flex-GFP lentivirus (figure 5G). Ces données suggèrent que la quantité et le titre de lentivirus décrits ci-dessus, ~ 20% des cellules transplantées MGE peut être marqué. La quantité de virus peut soit être diminuée ou augmentée, ou potentiellement d'autres variables telles que la durée d'incubation virale peut être modifié, pour atteindre clairsemée ou dense marquage cellulaire.

En utilisant des tissus MGE partir d'une ligne journaliste souris Cre dépendant conjointement avec le lentivirus CAG-Flex-GFP peut limiter le nombre de marqueurs supplémentaires qui peuvent être examinées pour détecter par immunofluorescence. Par conséquent, SST-IRES-Cre ^{+ <} / Sup> tissus E13.5 MGE a été recueilli et transduction avec CAG-Flex-GFP lentivirus afin de visualiser les cellules transplantées MGE exprimant Cre (sera GFP ^+). Ces cellules ont été transplantées dans P1 WT cortex et évalués à 35 DTC (voir la conception expérimentale, la figure 6A), un moment où les marqueurs de interneurones matures sont exprimées de temps. A 35 DPT, ~ 85% des cellules GFP ⁺ co-exprimé SST, mais seulement ~ 4% exprimé PV (figures 6B-6H). Ces chiffres sont cohérents avec l'analyse de la lignée de la lignée de souris SST-IRES-Cre, qui a également destin mappe ~ 5-10% de PV ^{+ 9} cellules (Vogt et Rubenstein, résultats non publiés). Ces données suggèrent que l'étiquetage virale de MGE est efficace et peut être une approche applicable à l'introduction d'un journaliste ou potentiellement un gène d'intérêt avant l'analyse in vivo.

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Figure 1. Procédure représentant pour la dissection de E13.5 MGE tissus. Exemple dissection du tissu MGE soit pour des cultures primaires ou transplantations. (AE) Images de E13.5 dissections du cerveau, et des schémas pour mettre en évidence des structures (A'-E ») et des étapes importantes dans la procédure. (A, A ') représentant E13.5 cerveau vu de la face ventrale. La ligne rouge représente la première coupe faite, qui hemisect le cerveau en deux morceaux. (B, B ') Vue d'une hémisection de cerveau. La face interne est visible, avec face latérale vers le bas. Tissu du cortex dorsal (de couleur bleue) recouvre les éminences ganglionnaires. En outre, le tissu ventrale qui sera éliminée est représentée en orange. (C, C ') Voir et illustration des éminences ganglionnaires exposés après tissus recouvrant a été décollée. (D, D') Même vue de ganglionnaire exposée emi nences comme dans (C, C '), mais avec des sites de coupe détaillées indiquées en rouge pointillés. Après MGE est découpée selon les lignes désignées dans (D, D '), le tissu est tourné sur le côté (E, E') et la face externe est rognée et jetée. Étapes représentatives dans la dissection et l'isolement de tissu MGE. Abréviations: (CGE) de l'éminence ganglionnaire caudale, (LGE) éminence ganglionnaire latérale, (MGE) médial ganglionice éminence. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Film montrant une dissection E13.5 MGE. Film illustre le retrait d'un cerveau de E13.5 suivie par dépliage ultérieur et l'enlèvement du tissu de recouvrement. Le MGE est étiqueté et les coupes faites pour enlever les tissus environnants sont spectacle dans un ordre par étapes.. MGEdissect movie.mov "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

Figure 3. Zone Représentant de procédure et l'exemple de l'aiguille d'injection pour transplantations néonatales. (A, A ') Images montrant un exemple de configuration pour effectuer des transplantations dans des souris néonatales. Microscope (1) est positionnée au-dessus d'une phase contenant un moule qui peut contenir une souris néonatale (5) et un dispositif stéréotaxique (2). (A ') une image agrandie de (A) représentant la zone du dispositif stéréotaxique qui contient l'aiguille d'injection de verre (6) avec un piston inséré (7). Le piston est commandé par un moteur hydraulique fine (4) et se déplace de l'huile minérale au sein de l'aiguille de verre qui sert de médiateur vers l'intérieur et vers l'extérieur à se écouler à partir de l'aiguille. (B) Exemple d'une aiguille d'injection en verre avec une pointe biseautée. Pour la règle dans (B), chaque grande démarcation = 100 um. (C) la liste de l'inventaire des éléments figurant dans (A, A '). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Les tests in vitro démontrent l'expression de la GFP d'un lentivirus CAG-Flex-GFP en présence de Cre. (A) Schéma de la façon dont le lentiviral CAG-Flex-GFP vecteur fonctionne en présence de Cre. (B) Schema MGE expérience de culture de cellules primaires pour évaluer si le lentiviral CAG-Flex-GFP exprimerait GFP dans les cellules avec une expression Cre. Brièvement, les cellules de MGE un journaliste Cre dépendant, Ai14 (tdTomato exprime dans la présence de Cre), ont été cultivées in vitro et transduites avec Cre et / ou Flex-GFP lentivirus. (CK) images immunofluorescence de E13.5 MGE cultures primaires qui ont été transduites avec un CMV-Cre, CAG-Flex-GFP ou les deux. Les cultures ont été imagées pour l'expression de tdTomato natif, GFP et DAPI. La barre d'échelle dans (K) = 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. images représentatifs de transplantés et transduites, SST-IRES-Cre ^+; Ai14 ^{Flox / +} MGE cellules. (A) Schéma de conception expérimentale de transplanter des cellules soit de MGE seul ou après lentiviral transduction dans un type sauvage (WT), accueil (DTC) jours après la transplantation. Brièvement, E13.5 SST-IRES-Cre ^+;. Ai14 ^{Flox / +} MGE cellules ont été transplantées soit ou transduites avec le lentivirus CAG-Flex-GFP avant la transplantation dans neocortices WT et évalués à 7 DPT (B, C) ​​images immunofluorescence de neocortices à 7 ou 35 DPT montrant cellules MGE transplanté représentatifs (tdTomato ^+). (DF) images immunofluorescence de cellules MGE transduites avec le lentivirus CAG-Flex-GFP évalué à 7 DPT. (G) Quantification de la proportion de tdTomato cellules ⁺ que exprimer GFP au 7 DPT. Barres d'échelle dans (C) et (F) = 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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La récolte des cellules Figure 6. Des images représentatives de l'ACG-Flex-GFP lentivirus transduction, SST-IRES-Cre ⁺ MGE Les greffes qui co-express interneurones marqueurs du sous-groupe MGE dérivés. (A) Schéma de E13.5 SST-IRES-Cre ⁺ MGE et la transduction avec un lentivirus CAG-Flex-GFP et la transplantation dans le néocortex des armées P1 WT avant l'évaluation à 35 DPT. Images représentatives de la néocortex des armées transplantés montrant l'expression de la GFP, à partir du vecteur Flex (B, E), co-colorées pour soit la somatostatine (SST) (C) ou parvalbumine (PV) (F). (D, G) a fusionné co-images colorées avec du DAPI. (H) La quantification de la proportion de cellules GFP qui co-expriment SST ou PV. Les données représentent ± SEM, (n) = bar 3. Echelle dans (G) = 100 um./52740fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. fichier FASTA du vecteur pLentiviral CAG Flex-GFP-ADN.

Réactifs et d'équipements pour la préparation de cellules MGE et la transduction							Catalogue #	Société
1)	Eagle modifié de Dulbecco, avec taux élevé de glucose						12491-015	Life Technologies
2)	Inactivé par la chaleur sérum fœtal bovin						10437-077	Life Technologies
3)	Hanks une solution saline équilibrée (HBSS), pas de calcium ou de magnésium						14170-112	Life Technologies
4)	1,5 ml microtubes (ou autretubes de prélèvement avec couvercles)						3810X	Eppendorf international
5)	Polybrene						sc-134220	SantaCruz biotechnologie
6)	Coup de couteau droite 22,5 ° (en option)						REF 72-2201	Les spécialités chirurgicales société
7)	Boîte de Pétri (10 cm), pour les dissections de tissus						FB0875713	Fisher Scientific
8)	2 pinces à pointe fine, comme Dumont # 5						11254-20	Outils scientifiques Beaux-
9)	37 ° C la culture de tissu incubateur avec 5% de CO 2 entrée						C150	Liant
10)	Table centrifugeuse qui peut tourner 1,5 ml microtubes
11)	De préférence de pipette P1000 qui peut être utilisé pour la trituration de la cellule
12)	du niveau de biosécurité 2 de la hotte
Réactifs et équipements pour in vitro MGE cultures primaires							Catalogue #	Société
1)	Lab-TekII chamberslides avec couvercle, 8 bien						154941	Thermo Fisher
2)	Poly-L-lysine 0,1% poids / volume						P8920	Sigma Aldrich
3)	Souris laminine, de 0,5 à 2 mg / ml						23017-015	Life Technologies
4)	Milieu Neurobasal						21103-049	Life Technologies
5)	B27 sérique de supplément gratuit						17504044	Life Technologies
6)	Glutamax, Banque de 100x						35050-061	Life Technologies
7)	Pénicilline-streptomycine, Banque de 100x						15070-063	Life Technologies
8)	Glucose, (préparer une solution à 25% dans l'eau)						G5400	Sigma Aldrich
Réactifs et équipements pour MGE transplantation de cellules							Catalogue #	Société
1)	1 ml seringue						REF 309602	BD, Becton Dickinson and Company
2)	30 1/2 aiguille G						305106	BD, Becton Dickinson and Company
3)	PréCision alésage de livrer 5 pi (livré avec plongeur)						5-000-1005	Société scientifique Drummond
4)	Parafilm						PM-999	Polysciences, Inc.
5) **	Microscope stéréo avec boomstand						MZ6	Leica
6) **	Numérique seulement pour l'instrument de souris						51725D	Société Stoelting
7) **	Huile mono-axe micromanipulateur bien hydraulique						MO-10	Narishige
8)	Diamant Beveler rotatif enduit						n / a	faites maison
9)	Needle pipettete extracteur						730	Instruments Kopf
10)	L'huile minérale						n / a	Ne importe quel magasin de drogue ou de la pharmacie
11)	Toute pipette et conseils qui peuvent reliaby mesure 1 pi volume
	** Il se agit des modèles particuliers que nous utilisons, mais beaucoup d'autres configurations devraient travailler
Optional Réactifs (pour faire des lentivirus)							Catalogue #	Société
1)	25 mm, 0,45 um filtre						09-719B	Fisher Scientific
2)	Tubes de centrifugeuse ultra-claires (25 x 89 mm)						344058	Beckman Coulter
3)	Lipofectamine 2000		(1,5 ml taille)				11668019	Invitrogen
Autres fournitures disponibles dans le commerce							Catalogue #	Société
1)	pMDLg / pRRE plasmide codant gag / pol						12251	Addgene
2)	pRSV-Rev plasmide codant pour Rev						12253	Addgene
3)	pMD2.G plasmide codant VSVG						12259	Addgene
4)	pAAV-Flex-GFP						28304	Addgene

Tableau 2. Liste des stocks de réactifs et d'outils. Un inventaire des réactifs disponibles dans le commerce, y compris les médias, les outils de dissection, d'équipements représentatifs de transplantation et d'ADN vecteurs. (Na) Non disponible ou applicable.

Discussion

L'utilisation de précurseurs des interneurones GABAergiques corticale des éminences ganglionnaires embryonnaires (GES) pour les thérapies à base de cellules est prometteuse pour de nombreuses affections ^{12 -1 4.} Techniques moléculaires précises sont nécessaires pour suivre et exprimer des gènes d'intérêt dans les sous-groupes des interneurones spécifiques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour le marquage des cellules embryonnaires MGE avec lentivirus avant la transplantation et montrons comment cette technique peut être utilisée pour exprimer des gènes d'intérêt dans les sous-groupes spécifiques de interneurones corticaux pour l'analyse in vivo.

Le protocole décrit ici peut être utilisé de manière fiable, cependant, pour la reproductibilité optimale, il est indispensable de respecter quelques étapes critiques. Tout d'abord, pour la transduction virale pour être efficace, la température et au pH physiologiques sont nécessaires. Si ces paramètres sont remplies, les cellules peuvent être transduites MGE dans ~ 30 minutes. Deuxièmement, assurez-vous d'avoir un MGE culot dense avant de continuerpour faire une transplantation. Ce est important parce que seul un volume limité peut être injecté dans le cerveau de souris néonatale à chaque site sans subir de dommages, et les cellules va migrer loin du site d'injection, de sorte que leur densité au moment de la transplantation est moins préoccupante que pourrait être attendu. Enfin, exécuter des conditions d'essai avec des cellules qui expriment une MGE rapporteur fluorescent pour déterminer ce que l'injection des profondeurs sont optimales. Bien que ce protocole utilisé MGE cellules, les cellules EGC pourraient également être utilisés de la même manière. Un inconvénient est qu'il n'y a pas beaucoup de lignes Cre-pilote qui limitent l'expression à l'ensemble du CGE ou sous-groupes particuliers d'interneurones CGE dérivés. Cependant, le peptide intestinal vasoactif (VIP) ⁹ est une Cre-ligne fiable qui pourrait être utilisé pour séparer ce sous-groupe de cellules dérivées de la CGE. Comme de nouvelles lignes deviennent disponibles, il sera possible d'utiliser ce protocole avec une précision plus génétique.

Auparavant, nous et d'autres avons montrél'utilité de l'introduction de gènes dans des cellules MGE par électroporation ou avec des lentivirus ^{15, 17} avant la transplantation. Bien que ces techniques étaient efficaces pour l'introduction de gènes pour l'analyse in vivo, le tissu MGE est hétérogène et donne lieu à de multiples sous-groupes des interneurones ainsi que des cellules non neuronales ^4. En outre, il a été difficile d'exprimer un gène d'intérêt que dans un sous-groupe spécifique interneurone. De grands progrès ont été faits pour générer des lignées transgéniques qui récapitulent les profils d'expression de nombreux sous-groupes de interneurones corticaux, y compris, mais sans s'y limiter, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre un d VIP-Cre ^{9 -11,} et l'avènement de nouvelles lignes va aider à élucider populations supplémentaires possibles à l'avenir. De plus, avec la génération de reporters Cre-dépendants et des vecteurs d'expression, y compris des vecteurs rapporteurs Cre-charge est utilisé ici, une expression plus précise des gènes d'intérêt peut être obtenue.

Une limitation de cette technique peut être la taille du fragment que l'on peut conditionner de manière fiable dans un vecteur lentiviral. En outre, cette approche n'a pas encore été testé avec AAV. Cependant, une fois cette technique est optimisée par un particulier, de nombreuses variantes de cette approche peuvent être utilisés. Premièrement, l'approche décrite ici permettra aux chercheurs d'exprimer journalistes utilisant un journaliste lentivirus Cre dépendant conjointement avec les cellules du donneur MGE de lignes Cre-pilote spécifique. Cette technique peut être utilisée pour évaluer la morphologie des cellules individuelles ou potentiellement MGE pour exprimer un gène d'intérêt dans différents sous-groupes, si un second gène est cloné dans le vecteur. Deuxièmement, il peut également être possible d'utiliser un virus exprimant Cre Cre dépendant cellules journaliste MGE donateurs ou potentiautiliser lly évolution des éléments d'ADN conservées, promoteurs et des amplificateurs, pour diriger l'expression dans des populations distinctes de cellules dans une population hétérogène.

Un obstacle à surmonter avenir sera marquage de cellules souches pluripotentes induites humaines dérivées ou des cellules souches embryonnaires pour éventuellement purifier et / ou d'étudier un groupe spécifique de cellules. Fait intéressant, des activateurs d'ADN conservées peuvent également être utilisés dans des systèmes d'expression viraux pour cibler les neurones GABAergiques dans des cultures primaires, après injection dans le cortex, et avant la transplantation de cellules MGE ^{15, 18, ​​19.} Les activateurs peuvent être une réponse à cet obstacle et seront d'intérêt comme des outils moléculaires, que de nouvelles techniques sont nécessaires pour étudier l'utilité de ces cellules dans la thérapie. En effet, les progrès réalisés jusqu'à exhausteurs découvrent que pourraient étiqueter soit interneurones GABAergiques ²⁰ ou d'autres sous-types de neurones, y compris les neurones glutamatergiques ^21, sont en cours. En utilisant la méthode de marquage viral présent mémoire,il peut être possible pour la transduction de cellules souches d'origine humaine différenciées avec des activateurs spécifiques de type cellulaire pour marquer des cellules distinctes d'intérêt avant la transplantation et l'analyse in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and equipment for MGE cell transplantation
1 ml syringe	REF 309602	BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G needle	305106	BD, Becton Dickinson and company
Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger)	5-000-1005	Drummond scientific company
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Stereo microscope with boomstand **	MZ6	Leica
Digital just for mice stereotaxic instrument **	51725D	Stoelting company
Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **	MO-10	Narishige
Diamond coated rotary beveler		made in house
Needle pipette puller	730	Kopf instruments
Mineral oil		Any drug store or pharmacy
Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume
** These are the particular models we use, but many other setups should work
Optional Reagents (for making Lentiviruses)
25 mm, 0.45 µm filter	09-719B	Fisher Scientific
Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)	11668019	Invitrogen
Other commercially available supplies
pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev plasmid encoding Rev	12253	Addgene
pMD2.G plasmid encoding VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene