Summary
GABAerge kortikal interneuron stamfædre sprede, udvikle og synaptisk integrere i et væld cortex efter transplantation. Disse celler kan let transduceres før transplantation til in vivo undersøgelser af genetisk modificerede GABAerge forstadier. Her viser vi virale mærkningsteknikker at målrette specifikke interneuron undergrupper under anvendelse af eksisterende Cre linjer og Cre-afhængige journalister.
Abstract
GABAerge kortikale interneuroner, der stammer fra den embryonale mediale og caudale ganglioniske eminences (MGE og CGE), er funktionelt og morfologisk forskelligartet. Indhug er foretaget i forståelsen af roller forskellige kortikale interneuron undergrupper, men der er stadig mange mekanismer, der skal udarbejdes, der kan bidrage til udvikling og modning af forskellige typer GABAerge celler. Endvidere kan ændres GABAergic signalering bidrage til fænotyper af autisme, skizofreni og epilepsi. Specifikke Cre-driver linjer er begyndt at udstykke funktioner unikke interneuron undergrupper. På trods af de fremskridt i musemodeller, er det ofte vanskeligt at effektivt at studere GABAerge kortikale interneuron stamfædre med molekylære metoder in vivo. En vigtig teknik, der anvendes til at studere celleautonom programmering af disse celler er transplantation af MGE celler i værten cortex. Disse transplanterede celler migrere ekstensivt, differentierer etnd funktionelt integrere. Desuden kan MGE celler effektivt transduceret med lentivirus umiddelbart før transplantation, giver mulighed for en lang række molekylære metoder. Her har vi detaljeret en protokol til effektivt at transducere MGE celler før transplantation til in vivo analyse, ved hjælp af tilgængelige Cre-driver linjer og Cre-afhængige ekspressionsvektorer. Denne fremgangsmåde er fordelagtig, fordi den kombinerer præcis genetisk manipulation med evnen af disse celler til at dispergere efter transplantation, hvilket tillader større celletypespecifik opløsning in vivo.
Introduction
GABAerge corticale interneuroner omfatter ~ 20-30% af neuroner i pattedyr neocortex, mens resten svarer til excitatoriske, glutamaterge vigtigste neuroner. Interneuroner er meget forskellige i elektrofysiologiske egenskaber, axon og dendritceller morfologi og synaptisk målretning 1, og ubalancer i excitatorisk / hæmmende tone er en hypotese at ligge til grund nogle fænotyper af neurologiske / neuropsykiatriske lidelser, herunder autisme, skizofreni og epilepsi 2. Det overordnede mål med protokollen beskrevet heri er at sikre et middel til effektivt at gensplejse GABAerge kortikale interneuron forfædre før transplantation til in vivo analyser.
Cortical GABAerge interneuroner er født i den mediale og caudale ganglioniske eminences (MGE og CGE, henholdsvis) 3,4 samt præoptiske område 5. Kortikale interneuron progenitorer undergår langdistance tangential migration fulgtved radial migration for at nå deres endelige mål. Ved ankomsten til deres destinationer, skal disse kortikale interneuroner korrekt integreret i det eksisterende neuronal netværk, og hver unik interneuron undergruppe vil bidrage til kortikale kredsløb på bestemte måder. Fire vigtigste undergrupper kan skelnes ved molekylære markører: MGE-afledt somatostatin (SST) + og parvalbumin (PV) + undergrupper, og CGE-afledt vasoaktivt intestinalt peptid (VIP) + og Reelin +; SST - undergrupper 6. Forskellige corticale interneuron undergrupper fødes over forskellige tidspunkter under fosterudviklingen i MGE og CGE 7, 8. Disse og andre corticale GABAerge interneuron markører er blevet anvendt til at generere specifikke Cre-driver linjer for mange af disse undergrupper 9-11.
Transplantation af MGE progenitorer er opstået som en potentiel cellebaseret terapi til behandling af sygdomme, der kan være forårsaget af ubalanceri excitation / hæmning 12 - 24. Disse terapeutiske fordele kan skyldes til dels den unikke evne MGE stamfædre (at sprede, differentiere og integrere i en vært hjernen), eller potentielt fordi mange peri-somatiske hæmmende PV + celler er afledt af MGE. MGE celler kan også hurtigt og effektivt transduceret med lentivirus før transplantation 15 tillader celler, der er genetisk modificeret in vitro til at blive undersøgt in vivo. Begrundelsen for at udvikle denne fremgangsmåde var at overvinde vejspærringer i at studere GABAerge kortikal interneuron udvikling og modning. Især MGE transplantation tilladt forskere til at studere udviklingen af mutante celler in vivo, når mutant mus ellers ville have døde på et tidligt tidspunkt. Ved at indføre gener af interesse før transplantation, virkningerne af specifikke gener på en mutant fænotype kunne vurderes i en efficient måde.
Her giver vi en detaljeret protokol til at transducere MGE celler med lentivira før transplantation. Desuden viser vi, hvordan denne teknik kan tilpasses til at udtrykke et gen af interesse i specifikke interneuron undergrupper fra en heterogen gruppe af kortikale interneuron forstadier ved hjælp af en kombination af Cre-afhængige udtryk lentivira og tilgængelige Cre-driver muselinjer. Desuden protokollen introducerer teknikker og en platform for forskere at gensplejse GABAerge kortikal interneuron forstadier til in vivo undersøgelser på en unik måde. En fordel ved denne teknik i forhold til andre aktuelle metoder, er, at de transplanterede MGE celler vil sprede sig væk fra injektionsstedet. Også, i modsætning fokale virale injektioner, efter MGE celler sprede deres morfologi er lettere at vurdere. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge virkningen af indføring af gener af interesse i vildtype- eller mutantceller, indførelse af en celletype specifikreporter at vurdere morfologi eller potentielt at studere virkningen af sygdomstilstande alleler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Følgende procedurer er blevet godkendt af vores institution og dyrs protokol. Sørg for at få godkendelse til alle procedurer, der involverer overlevelse operationer, før du begynder eksperimenter og kontrollere alle protokoller er ajour.
1. Lentivirus Forberedelse (valgfrit trin)
- Split tre 10 cm plader af HEK293T celler for hver lentivirus skal foretages, i nærvær af 10 ml DMEM / 10% FBS, og vokse til ~ 60-70% konfluens. Grow celler i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Transficere følgende DNA-plasmider (10 ug total) i hver plade ved hjælp af en transfektionsreagens: 6,4 ug CAG-Flex-GFP lentiviral vektor (DNA-vektor sekvens i tabel 1), 1,2 ug pMD2.G (koder VSV-G), 1,2 ug pRSV-Rev, og 1,2 pg pMDLg / pRRE. De tre lentivirale emballage vektorer er kommercielt tilgængelige (tabel
Bemærk: Denne særlige tilgang udnytter 3. generation lentivirAL vektorer men 2. generations vektorer og tilhørende plasmider vil også arbejde. - Forbered en affaldscontainer, der indeholder en 10% blegemiddel løsning inden for en BSL2 certificeret hætte at inaktivere eventuelle løsninger eller enheder, der kontaktede eller indeholder lentivirus. Dernæst helt at fjerne medierne 4-6 timer efter transfektion i blegemiddel løsning, udskiftes med det samme volumen af nye medier, og gøre det muligt for cellerne at vokse.
- Efter 4 dage indsamle medier i 50 ml koniske rør og centrifugeres ved 1.000 xg i 15 minutter for at pelletere enhver cellerester. Dernæst filtreres supernatanten gennem et 0,45 um membran. Enhver lav proteinbinding filter, ligesom PVDF, fungerer godt. Forsigtig: sted både fast og flydende viral affald i blegemiddel løsning.
- Load 30 ml filtreret supernatant i ultracentrifugerør og ind i en ultracentrifuge. Centrifugeres ved 100.000 x g i 2,5 timer ved 4 ° C. Åben centrifugeglassene i en BSL2 hætte og fjern supernatanten i 10% blegemiddel. Tilføj ~ 100 pi PBS til PEllet, hvilket giver titere på 1x10 ^ 7-8 infektiøse enheder / ml. Alikvot den følgende dag og opbevares ved -80 ºC. Lentivirus portioner er stabile ved -80 ° C i mindst seks måneder.
- Vigtig overvejelse: Mange institutioner har nu virale kerner. Anskaf koncentreret virus med et minimum titer på 1x10 7 infektiøse enheder / ml, for optimale resultater.
2. donormus til MGE Dissection
- Først oprette en tidsindstillet parring mellem en Cre-udtrykkende linje af interesse og enten en vildtype (WT) mus eller en mus, der vil udtrykke en journalist efter Cre-medieret rekombination.
Bemærk: Mange Cre-driver linjer er transgene og vedligeholdes og opdrættet i hemizygote tilstand. Således vil kun halvdelen af embryonerne indeholder Cre transgen. DNA kan hurtigt fremstilles fra embryoner til et kort PCR til påvisning af Cre-allelen. Cre + embryoner kan derefter høstes så kun MGE væv af den ønskede genotype anvendes. Alternatitivt kan et Cre-afhængig reporter anvendes til at vælge de embryoner til MGE dissektion og transplantation. - Beregn hvilken dag vil svare til E13.5. Hvis dyrene blev parret om aftenen før, den dag stikket er 0,5. Bestil timed-drægtige mus eller en WT kvinde med P1 unger for at tid have postnatal (P) 1 mus på dagen donorvævet bliver E13.5. Alternativt oprette disse parringer i hus en uge før parring donorerne.
Bemærk: Den tidligere strategi til at generere både E13.5 og P1 embryoner / unger for den samme dag er ofte vanskeligt at gøre pålideligt.
3. Fremstilling af Media, værktøj og udstyr.
- Forbered reagenser og værktøjer til MGE cellepræparat (tabel 2).
- Forbered en ren overflade og placere rene pincet, saks og enten en microsurgical kniv eller fine pincet (for præcis væv dissektion) på overfladen.
- Forbered Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), feller dissektion og Dulbecos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint surem (FBS) til transduktion.
- Præinkubere 20-30 ml DMEM / 10% FBS i en 37 ° C vævskultur inkubator i ca. 1 time. Låget bør løsnes for at tillade gasudveksling og pH ækvilibrering af mediet.
Bemærk: Medierne præinkubering kan fremstilles lige før du starter dissektion.
4. MGE Cell Forberedelse
- Sacrifice den gravide mus efter en godkendt dyr protokol og flytte embryoner i en 10 cm petriskål indeholdende iskold HBSS.
- Tag hjernen fra hver foster ved hjælp af en dissekere omfang (gøre én ad gangen, mens resten af embryonerne i iskold HBSS) og derefter gå videre til at skære ud MGE væv.
Bemærk: Nærmere beskrevet nedenfor, og i figur 1, er vigtige skridt, der viser, hvordan du fjerner MGE. Desuden Figur 2 er en film, der viser hele dissektionprocedure.- Placer hjernen med ventrale side opad (figur 1A, A '). Bemærk: det er også okay at have det dorsale aspekt opad. Skær hjernen i halvdelen langs saggitale plan for at generere to stykker. Et eksempel hemisected hjerne er vist (figur 1B, B '), bemærke, at dorsale (den overliggende cortex) og ventrale dele af hjernen dæksel og omgiver ganglie eminence (GE) væv.
- Dernæst med en dominerende hånd, hold enten meget fine pincet eller en stabknife (tabel 2), mens immobilisere halvkugle med en pincet, som en ikke-dominerende hånd. (The halvkugle mediale side skal vende opad). Fold dorsale og ventrale væv med pincet og en stab kniv til at afsløre den underliggende GE væv (figur 1C og afbildet i figur 1C).
Bemærk: Fjernelse nogle medier fra dissektion petriskål kan gøre det lettere at stabilisere vævet mens performing MGE dissektion. - Gør lige snit med stabknife eller fin pincet til at adskille CGE, LGE og septumdefekter væv (se eksempel nedskæringer betegnet af røde linjer, figurer 1D og D '). Disse nedskæringer kan foretages i vilkårlig rækkefølge.
Bemærk: Forestil MGE som en "kasse", der er skåret ud af det omgivende væv. Hvis du gør det hjælper reproducerbart foretage lignende nedskæringer for hver dissektion og dermed reducere variation i væv dissektioner. - Endelig drejes MGE om på siden og trim væk fra bunden (hvad var den laterale del af hjernen). Dette fjerner kappe zone MGE (skille i figur 1E og 1E) fra resten af MGE. Den resterende del af MGE indeholder primært ventrikulær zone og subventrikulære zone dele af MGE, som indeholder næsten alle MGE progenitorceller. Fortsæt med dette væv.
- Vigtig overvejelse: Tilsætning af siliconegel til bunden af en petriskål CAn tjene som en glimrende dissektion overflade, da det beskytter de fine tips af tang og giver en blød overflade til pinning væv med pincet.
4.3 Yderligere strategier for MGE dissektion.
- Skær huden af embryoet med pincet som en saks til hurtigt at fjerne hjernen. Som embryonet der på sin side, at holde vævet på basis af hovedet med tangen anvendes til at forankre vævet. Først skæres forreste ventrale til hjernen og bageste ventral til hjernen, og derefter forbinde de to snit langs siden af embryoet. Så få flappen af huden og trække det over toppen af hjernen. Hjernen kan derefter hurtigt dissekeres væk fra det resterende væv.
- Alternativt forankre den bageste del af hele hjernen bag cortex. I mellemtiden, forstå hver halvkugle på det mest dorsale caudale aspekt af cortex og rive cortex væk fra den forankrede væv i en anterior retning. På denne måde både cortices kan fjernes og de bilaterale ganglioniske eminences bliver afsløret, stadig fastgjort til resten af vævet bevare den mediale-laterale anatomi.
- Skift til den stab-kniv til at lave præcise snit omkring MGE på hver halvkugle. Brug enten en separat ren sæt pincet til at indsamle MGE eller en pipette med en stor spids (dvs.., P1000).
Bemærk: Hold indsamlede væv væk fra alle andre dissekeret materiale, som nogle medier uundgåeligt overføres når MGE indsamles. - Saml MGE og sætte vævet i et 1,5 ml opsamlingsrør indeholdende DMEM / 10% FBS (et volumen på 500 pi er tilstrækkelig til at indsamle de MGEs). Gentag i den anden halvkugle og sted i samme samling rør. Opbevare prøver på is indtil alle væv opsamles.
5. Lentiviral mærkning og transplantation
- Flyt rør af MGE væv i en BSL2 certificeret hætte og fjerne mediet.
Bemærk:MGE væv er stor nok til at være synlige for øjet og vil sedimentere til bunden af røret muliggør de kolde medier til at være let og forsigtigt fjernet. - Tilføj ~ 500 ul DMEM / 10% FBS medier, der blev præinkuberet i en 37 ° C vævskultur inkubator. Dernæst tilsættes polybren at lette transduktion til hvert rør i en slutkoncentration på 8 ug / ml. Findel MGE væv til at skabe en enkelt celle suspension ved hjælp af en P1000 pipette spids. Endelig tilsættes ~ 15-20 pi koncentreret lentivirus til hvert rør.
- Vigtig overvejelse: En findeling af 10-12 gange er tilstrækkelig til at bryde op MGE væv fra en enkelt embryo, men kan være nødvendigt flere triturationer hvis flere MGEs samles sammen. Prøv forskellige findeling betingelser for at afgøre, hvad der fungerer bedst.
- Sikker lukke hvert rør, vend at blande, end plads alle rørene i et 37 ° C inkubator. Inkubér cellerne i lentivirus mindst 30 minutter og op til 1 time. Længere tider har resulteret i dekrøllet cellelevedygtighed. Vend rørene hver 10 min, indtil tiden er gået.
- Efter inkubation med lentivirus fjernes rørene fra inkubatoren og der centrifugeres ved ~ 700 xg i 3 min for at pelletere cellerne. I BSL2 hætte, supernatanten fjernes og kasseres i 10% blegemiddel. Dernæst tilsættes 1 ml DMEM / 10% FBS og udriv pellet 2-3 gange for at vaske, centrifugeres igen ved den samme hastighed for at pelletere cellerne. Gentag dette wash-trin 2-3 flere gange for at fjerne overskydende virus.
Bemærk: Udfør centrifugeringstrin ved 4 ° C, dog nedsat levedygtighed er ikke blevet observeret, når korte spins udføres ved stuetemperatur. - Efter den sidste vask, Fjern så meget medier som muligt og sætte hvert rør på is. På grund af resterende medier på siderne af røret, ~ 2-3 pi medier ender dækker cellepelleten ved tidspunktet for transplantation procedure er begyndt.
6. Transplantation og validering
- Anskaf værten P1 hvalpe og forberede procedurenområde ved sprøjtning ned med 70% ethanol. For at opretholde sterilitet under proceduren anbefales det at udføre disse procedurer i en dedikeret ren procedure værelse. Desuden enten bruge autoklaverede kirurgiske redskaber sterilisere overflader, hvalpene vil være i kontakt med at bruge 70% ethanol. Et eksempel på repræsentative nødvendige udstyr til at udføre transplantationer og en repræsentativ procedure område er vist i figur 3.
Bemærk: Når denne procedure er en injektion af små volumener og ikke en kirurgisk procedure, som ville kræve et indsnit, åbent sår eller suturer, anbefales det stadig, at et nyt mikropipette anvendes til hver mus, der skal injiceres. De mikropipetter er varmesteriliseret, når de trækkes og skrå på en overflade, der var sprøjtet med 70% ethanol opbevares i en forseglet beholder.
- Generere mikropipetter at have en diameter på spidsen mellem 40-80 um. Efter disse dimensioner vil give optimalresultater. Heat sterilisere mikropipetter, når de trækkes og skrå på en overflade og spray med 70% ethanol, før opbevaring af mikropipetter i en forseglet beholder.
Bemærk: Alternativt, hvis adgang til de enheder, der er nødvendige for at skabe disse nåle (tabel 2) er begrænsende, bruge en anden indsprøjtning enhed. Dog kan disse ikke være så velegnet som mikropipetter følge af forskellige diametre. - Udarbejd mineralsk olie i en 1 ml sprøjte, og med en 30 1/2 G nål, fylde glaspipette helt med mineralsk olie. Dernæst montere stemplet på stereotaktisk apparat, så fastgør glaspipette til stereotaktisk apparat og belastning på stemplet. Ved hjælp af hydrauliske drev, bevæge stemplet halvvejs ind i glaspipette, fjerne mineralolie der udslip ud med en ren en ren papirserviet.
- Alternativt til anvendelse af en sprøjte, nedsænkes bagenden af pipetten i mineralolie og fyldes ved kapillarvirkning. For at undgå luftbobler i pipette opretholde et positivt tryk på sprøjten, indtil helt ud af glaspipette.
Bemærk: Andre enheder kan bruges med succes transplantere MGE celler 14. Enhver enhed, der kan levere et volumen mindre end eller i nærheden af 100 nl fungerer godt for denne procedure.
- Alternativt til anvendelse af en sprøjte, nedsænkes bagenden af pipetten i mineralolie og fyldes ved kapillarvirkning. For at undgå luftbobler i pipette opretholde et positivt tryk på sprøjten, indtil helt ud af glaspipette.
- Brug derefter en steril køkkenrulle eller et absorberende materiale, med hjørnet snoet ind i en fin spids til fint fjerne overskydende medier over MGE cellepelleten. Dette trin koncentrerer celledensiteten, således at mindre injektionsvolumener kan opnås. Brug derefter en lav volumen (P2 foretrækkes) pipette til langsomt udarbejde cellepelleten og udriv 1-2 gange før du flytter cellesuspensionen på en hydrofob overflade. Mængden skal være lige under 1 pi. Flyt spidsen af nålen i cellesuspensionen og ved hjælp af hydrauliske drev, trækker cellesuspensionen op i pipetten.
- Bedøve en P1 hvalp via hypotermi (wrap i en latex handske og lægge på is i ~ 2-4 min).Check for effektiviteten af anæstesi med en skadelig stimulus. Klem huden mellem tæerne med fine pincet: hvalpen skal være afvisende, hvis klemt. Herefter sættes hvalpen på en støbeform, der er under injektionen enheden og derefter gøre huden stram ved at trække tilbage i huden på hovedet og sikring med standard lab tape.
Bemærk: Mens hypotermi er meget effektive på neonatale mus og resulterer i lav dødelighed, skal procedurer gøres hurtigt, da hvalpene vil begynde at komme sig i under 10 min. Desuden 4 min på is er en øvre grænse for, hvad der kan tolereres. Prøv kun at fremkalde hypotermi én gang, hvis der kræves en længere tid til injektioner. Men hvis en hvalp genopretter tidligt, først lade hvalpen at komme sig helt, inden fremkaldelse af hypotermi igen. Desuden er det kun fremkalde hypotermi én mere tid til at udføre indsprøjtninger. Hvalpe vil komme inden for 5-10 min af hypotermi. Dette kan fremmes ved at placere hvalpe med strøelse og mor eller ved at placere hvalpen på en varm overflade at komme sig. - Ved hjælp af en stereotaktisk anordning, placere spidsen af glaspipette på overfladen på pup hoved, vinkelret på overfladen af hovedet. Når pipetten er i kontakt med hovedet, betragte dette som '0'. Dernæst skubbe pipetten gennem overfladen af huden og kraniet i cortex, indsæt og trække pipetten ~ 2 gange før de stoppede. For optimal målretning af celler i neocortex, injektioner udføres, når mikropipetten er i en dybde på 0,1 mm. Dette bør imidlertid optimeres af brugeren (se note nedenfor).
Bemærk: Selvom denne dybde pålideligt henvender dybere neocorticale lag med de anordninger, der er beskrevet ovenfor, bør nogle dybder testes bestemmes empirisk. Desuden bør en række dybder på forskellige Rostro-caudale medio-lateral position testes for at afgøre, hvilken dybde er optimal ved hvert sted. Desuden bør den indledende punktering være hurtig, da langsom indtrængen i neocortex formindsker evnen til cleanly gennemtrænge vævet. Prøv forskellige hastigheder, når du starter denne procedure for at finde, hvad der fungerer bedst. Desuden, til afprøvning koordinater, er der ingen reel erstatning for anvendelse af mærkede celler, som farvestoffer har været upålidelige til at betegne position. - Når nålen er på plads, roterer den hydrauliske enhed at fremføre stemplet i glaspipette, skubber et sæt volumen af cellesuspension i cortex. Injicer 50-70 NLS pr site. Gentag denne procedure på 3-6 forskellige steder på forskellige rostralt-caudale niveauer, hvis målet er at opnå en bred fordeling af celler i hele neocortex.
Bemærk: Mængder af 100 nl eller mere kan forårsage læsioner og føre til store klumper af injicerede celler, der ikke effektivt migrere ud af injektionsstedet. Således mindre injektionsvolumener (~ 70 nl eller mindre) er optimale over flere websteder, hvis tiden tillader det. - Når injektioner er færdig, skal du fjerne hvalpen fra scenen og markere det (toe klipning er en pålidelig måde at identificere pups senere). Når hvalpen er kommet sig og er i stand til at bevæge sig af sig selv (det sker i løbet af minutter at fjerne dem fra scenen), sætte det tilbage med mor og strøelse.
Bemærk: Da dette er en minimalt invasiv procedure er der ingen post-kirurgiske procedurer, når hvalpen er frit bevægelige og varmes. Imidlertid bør hvalpe kontrolleres ikke kun efter indgrebet, men også den følgende dag for at sikre de har ingen tegn på svigtende helbred. - Før start af fremgangsmåden på den næste pup, spray ned med 70% ethanol for at opretholde et sterilt arbejdsområde. Lad de injicerede unger til at udvikle og derefter vurdere vævet på et passende udviklingsstadiet (r).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da MGE celler har den unikke evne til at migrere og integrere når transplanteres i en vært neocortex 16, giver de en fremragende model for genetisk manipulation før in vivo studier. Heri viser vi, hvordan man kan isolere MGE væv fra E13,5 embryoner (figur 1 og 2), som derefter kan transduceres med lentivirus enten in vitro eller i en hurtig måde før transplantation til in vivo undersøgelser. Mærkning MGE via lentivira er udført, før du bruger en forstærker kørsel GFP i GABAerge neuroner 15. Men evnen udtrykke gener i specifikke undergrupper fra en heterogen population før transplantation kan i høj grad støtte undersøgelser af disse celler 'spredning og integration. Heri vi forsøgt at udvikle et middel til at målrette ekspression af en fluorescerende protein til en bestemt interneuron undergruppe de, der udtrykker somatostatin (SST) +.
Vi first subklonet en kommercielt tilgængelig Cre-afhængig GFP reporter (vektor information, tabel 2) i en lentiviral backbone. Vektoren blev frembragt ved først at subklone kassetten indeholdende GFP flankeret af loxP-sites fra AAV-vektor og ligere det ind i en lentiviral vektor backbone 15 under anvendelse af Xbal og PflMI restriktionssteder (denne kassette indeholdt kun en del af CAG promotor). Dernæst blev den resterende del af CAG-promotoren udskæres fra en pCAGGS mammal ekspressionsvektor med Spel og Xbal-stederne og ligeret ind i XbaI-stedet af den lentivirale vektor for at generere pLenti-CAG-Flex-GFP. 5'Spel-stedet af indsatsen er gratis for XbaI og dermed ødelagt 5'site, mens 3 'Xbal site blev bevaret. Den resulterende vektor (skema 4A, vektorsekvens tabel 1) blev først testet in vitro i nærværelse eller fravær af Cre (skema af in vitro-assay, figur 4B). MGE primære neuroner fra Ai14 Flox / + E13,5 embryoner blev dyrket og transduceret med en kombination af lentivirus. Få til ingen GFP + eller tdTomato + celler blev observeret med kun transduktionen af CAG-Flex-GFP lentivirus (figur 4C, 4F og 4I). TdTomato fluorescens var til stede i MGE celler transduceret med en CMV-Cre lentivirus, indikerer Cre-ekspression (figur 4D, 4G og 4J). Endelig co-transduktion af MGE celler resulterede i mange tdTomato + celler, der også udtrykte GFP, hvilket indikerer, at CAG-Flex-GFP lentivirus arbejdede som forventet (fig 4E, 4H og 4K). Nogle sjældne GFP + -celler blev observeret, at ikke var tdTomato + potentielt grund af den transducerede reporter inkorporerer ved siden af en stærk promotor, som udgjorde <2% af alle GFP + -celler.
indhold "> MGE celler transplanteret ind i en vildtype vært neocortex sprede, modne og integrere i værtens neocortex 16 E13,5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 Flox / + MGE celler blev transplanteret ind WT neocortices på P1 (skema, figur 5A) og deres fordeling undersøgt på 7 og 35 dage efter transplantation (DPT). På begge aldre, kunne tdTomato + celler ses på hele neocortex (figur 5B og 5C). Billederne i figur 5B og 5C er repræsentative transplantationer anvender MGE . celler fra et enkelt embryon at teste, hvor effektivt MGE celler kunne mærkes med protokollen beskrevet heri, MGE celler fra SST-IRES-Cre +; Ai14 FLOX / + embryonerne blev transduceret med CAG-Flex-GFP lentivirus og transplanteres i samme måde. Til disse eksperimenter ~ 15 ul koncentrated lentivirus (~ 1x10 7 infektiøse enheder / ml) blev anvendt med de kombinerede MGEs fra et foster for hvert transplantation. Cellerne blev derefter transplanteret ind i en P1 WT vært cortex og analyseres på 7 DPT (figur 5D-5F). Af de transplanterede celler (tdTomato +), ca. 20% var GFP + angivelse transduktion med CAG-Flex-GFP lentivirus (figur 5G). Disse data tyder på, at med ovennævnte mængde og titer af lentivirus, ~ 20% af transplanterede MGE celler kan mærkes. Mængden af virus kan enten reduceres eller øges, eller potentielt andre variabler som varigheden af viral inkubation kan ændres, for at opnå sparser eller tættere mærkning celle.Brug MGE væv fra en Cre-afhængig reporter mus linje i forbindelse med CAG-Flex-GFP lentivirus kan begrænse antallet af yderligere markører, der kan probes ved immunofluorescens. Derfor SST-IRES-Cre + < / Sup> E13.5 MGE væv blev opsamlet og transduceret med CAG-Flex-GFP lentivirus for at visualisere de transplanterede MGE celler, der udtrykte Cre (vil blive GFP +). Disse celler blev transplanteret ind i P1 WT cortex og vurderet ved 35 DPT (se eksperimentelt design, figur 6A), et tidspunkt, hvor modne interneuron markører udtrykkes. På 35 DPT, ~ 85% af GFP + celler co-udtrykte SST, men kun ~ 4% udtrykt PV (figur 6B-6H). Disse tal er i overensstemmelse med afstamning analyse af SST-IRES-Cre mus linje, som også skæbne kort til ~ 5-10% af PV + celler 9 (Vogt og Rubenstein, upublicerede resultater). Disse data tyder på, at virale mærkning af MGE er effektiv og kan være en anvendelig metode til at indføre en reporter eller potentielt et gen af interesse, før in vivo-analyse.
740fig1.jpg "/>
Figur 1. Repræsentant procedure for dissektion af E13.5 MGE væv. Eksempel dissektion af MGE væv til enten primære kulturer eller transplantationer. (AE) Billeder af E13,5 hjerne dissektioner, og (A'-E ') Skema at fremhæve strukturer og vigtige skridt i proceduren. (A, A ') Repræsentant E13.5 hjerne set fra den ventrale aspekt. Rød linie betegner det første snit foretaget, hvilket vil hemisect hjernen i to stykker. (B, B ') Udsigt til en hjerne hemisektion. Den mediale aspekt er synligt med laterale side ned. Væv fra dorsale cortex (blå farve) ligger over de ganglioniske eminences. Desuden ventral væv, der vil blive fjernet vist i orange. (C, C ') Se og illustration af de eksponerede ganglioniske eminences efter overliggende væv er blevet skrællet væk. (D, D') Samme visning af eksponeret ganglie emi nences som i (C, C '), men med detaljerede snitsteder vist som røde linjer. Efter MGE udskæres efter linjerne betegnet i (D, D '), der er vævet tændt sin side (E, E'), og det laterale aspekt skæres og kasseres. Repræsentative trin i dissektion og isolering af MGE væv. Forkortelser: (CGE) caudale ganglionisk eminence, (LGE) lateral ganglionisk eminence, (MGE) mediale ganglionice eminence. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Movie viser en E13.5 MGE dissektion. Film viser fjernelsen af en E13.5 hjerne efterfulgt af efterfølgende udfoldning og fjernelse af det overliggende væv. MGE er mærket og nedskæringer for at fjerne omgivende væv er show i en trinvis rækkefølge.. MGEdissect movie.mov "target =" _ blank "> Klik her for at se denne video.
Figur 3. Repræsentant procedure område og eksempel på kanyle for neonatale transplantationer. (A, A ') billeder, der viser et eksempel setup til at udføre transplantationer i neonatale mus. A mikroskop (1) er anbragt over en fase, der indeholder en støbeform, der kan holde en neonatal mus (5) og en stereotaktisk anordning (2). (A) Et forstørret billede af (A), der viser det område af stereotaktisk anordning, der holder glas injektionsnål (6) med et indsat stempel (7). Stemplet styres af en fin hydraulisk drev (4) og bevæger mineralolie i glasset nål, der medierer indad og udad strømme fra nålen. (B) Eksempel på et glas injektionsnål med en affaset spids. For linealen i (B), hver større afgrænsning = 100 um. (C) Inventory liste over emner, der er vist i (A, A '). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. In vitro-test viser ekspressionen af GFP fra en CAG-Flex-GFP lentivirus i nærvær af Cre. (A) Schema hvordan lentiviral CAG-Flex-GFP-vektoren fungerer i nærvær af Cre. (B) Schema primære MGE cellekultur eksperiment for at vurdere, om den lentivirale CAG-Flex-GFP ville udtrykke GFP i disse celler med Cre-ekspression. Kort fortalt MGE celler fra en Cre-afhængig reporter, Ai14 (udtrykker tdTomato i nærvær af Cre), blev dyrket in vitro og transduceret med Cre og / eller Flex-GFP lentivirus. (CK) Immunofluorescerende billeder af E13.5 MGE primære kulturer, der blev transduceret med en CMV-Cre, CAG-Flex-GFP eller begge. Kulturer blev afbildet for native tdTomato ekspression GFP og DAPI. Scale bar i (K) = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Repræsentative billeder af transplanterede og transducerede, SST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + MGE celler. (A) Schema af forsøgene til transplantation enten MGE celler alene eller efter lentiviral transduktion i en vildtype (WT) vært, (DPT) dage efter transplantation. Kort fortalt E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 Flox / + MGE celler blev enten transplanteret eller transduceret med CAG-Flex-GFP lentivirus før transplantation i WT neocortices og vurderes på 7 DPT (B, C) Immunofluorescerende billeder af neocortices på 7 eller 35 DPT viser repræsentative MGE transplanterede celler (tdTomato +). (DF) Immunofluorescerende billeder af MGE-celler transduceret med CAG-Flex-GFP lentivirus vurderet 7 DPT. (G) Kvantificering af andelen af tdTomato + celler, udtrykker GFP ved 7 DPT. Scale barer i (C) og (F) = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
2740fig6.jpg "/>
Figur 6. Repræsentative billeder af CAG-Flex-GFP lentivirus transducerede, SST-IRES-Cre + MGE transplantationer, der co-express MGE-afledte interneuron subgruppe markører. (A) Schema af E13,5 SST-IRES-Cre + MGE cellehøst og transduktion med en CAG-Flex-GFP lentivirus og transplantation i neocortex af P1 WT værter før vurdering på 35 DPT. Repræsentative billeder fra neocortex af transplanterede værter viser ekspressionen af GFP, fra Flex-vektoren (B, E), co-farvet for enten somatostatin (SST) (C) eller parvalbumin (PV) (F). (D, G) Flettede billeder co-farvet med DAPI. (H) Kvantificering af andelen af GFP-celler, som co-express SST eller PV. Dataene repræsenterer ± SEM (n) = 3. Scale bar in (G) = 100 um./52740fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Tabel 1. FASTA fil med pLentiviral-CAG-Flex-GFP DNA-vektor.
| Reagenser og udstyr til forberedelse og transduktion MGE celle | Catalog # | Firma | ||||||
| 1) | Dulbeccos Modified Eagle Medium med højt glucoseindhold | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | Varmeinaktiveret kalvefosterserum | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), ingen calcium eller magnesium | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | 1,5 ml mikrocentrifugerør (eller andreindsamling rør med låg) | 3810X | Eppendorf International | |||||
| 5) | Polybrene | SC-134220 | SantaCruz Bioteknologi | |||||
| 6) | Stab kniv lige 22,5 ° (valgfrit) | REF 72-2201 | Kirurgiske specialer selskabsskat | |||||
| 7) | Petriskål (10 cm), for væv dissektioner | FB0875713 | Fisher Scientific | |||||
| 8) | 2 fine tip pincet, ligesom Dumont # 5 | 11254-20 | Fin videnskabelige værktøjer | |||||
| 9) | 37 ° C vævsdyrkningsinkubator med 5% CO2-indgang | C150 | Binder | |||||
| 10) | Tabletop centrifuge, der kan dreje 1,5 ml mikrocentrifugerør | |||||||
| 11) | Enhver P1000 pipette, der kan anvendes til celle triturering | |||||||
| 12) | Biosikkerhed niveau 2 hætte | |||||||
| Reagenser og udstyr til in vitro-MGE primære kulturer | Catalog # | Firma | ||||||
| 1) | Lab-TekII chamberslides med låg, 8 godt | 154.941 | Thermo Fisher | |||||
| 2) | Poly-L-lysin 0,1% vægt / volumen | P8920 | Sigma Aldrich | |||||
| 3) | Mus laminin, 0,5-2 mg / ml | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | Neurobasal medium | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | B27 serumfrit supplement | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, 100x lager | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | Penicillin-streptomycin, 100x lager | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | Glucose, (fremstille en 25% opløsning i vand) | G5400 | Sigma Aldrich | |||||
| Reagenser og udstyr til MGE celle transplantation | Catalog # | Firma | ||||||
| 1) | 1 ml sprøjte | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and Company | |||||
| 2) | 30 1/2 G nål | 305.106 | BD, Becton Dickinson and Company | |||||
| 3) | PreCision boring at levere 5 pi (leveres med stempel) | 5-000-1005 | Drummond Scientific Company | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |||||
| 5) ** | Stereo mikroskop med boomstand | MZ6 | Leica | |||||
| 6) ** | Digital bare for mus stereotaksiske instrument | 51725D | Stoelting selskab | |||||
| 7) ** | Single-aksen olie hydraulisk fine mikromanipulator | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | Diamantbelagt roterende beveler | na | foretaget i hus | |||||
| 9) | Needle pipettete aftrækker | 730 | Kopf instrumenter | |||||
| 10) | Mineralolie | na | Enhver apotek eller apotek | |||||
| 11) | Enhver pipette og tips, der kan reliaby foranstaltning 1 pi volumen | |||||||
| ** Det er de særlige modeller, vi bruger, men mange andre opsætninger bør arbejde | ||||||||
| Optional Reagenser (for at udføre Lentivirus) | Catalog # | Firma | ||||||
| 1) | 25 mm, 0,45 um filter | 09-719B | Fisher Scientific | |||||
| 2) | Ultra-klare centrifugerør (25 x 89 mm) | 344.058 | Beckman Coulter® | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1,5 ml størrelse) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| Andre kommercielt tilgængelige forsyninger | Catalog # | Firma | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE plasmid, der koder gag / pol | 12.251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-Rev plasmid, der koder Rev | 12.253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G plasmid, der koder VSVG | 12.259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28.304 | Addgene | |||||
Tabel 2. Opgørelse liste af reagenser og værktøjer. En opgørelse af kommercielt tilgængelige reagenser, herunder medierne, dissektion værktøj, repræsentativt udstyr til transplantation og DNA-vektorer. (Na) Ikke tilgængelig eller relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af GABAerge kortikal interneuron forstadier fra embryonale ganglioniske eminences (GES) for cellebaserede behandlingsformer viser lovende for mange betingelser 12 -1 4. Præcise molekylære teknikker er nødvendige for at spore og hurtig gener af interesse i bestemte interneuron undergrupper. Her giver vi en detaljeret protokol til mærkning embryonale MGE celler med lentivira før transplantationen og vise, hvordan denne teknik kan bruges til at udtrykke gener af interesse i specifikke kortikale interneuron undergrupper til in vivo analyser.
Den her beskrevne protokol kan bruges som pålideligt, men for optimal reproducerbarhed er det vigtigt at holde sig til et par kritiske trin. Først for viral transduktion at være effektiv, fysiologisk temperatur og pH er nødvendige. Hvis disse parametre er opfyldt, kan MGE celler transduceres i ~ 30 minutter. For det andet, så sørg for at have en tæt MGE pellet, før du fortsættertil at gøre en transplantation. Dette er vigtigt, fordi kun et begrænset volumen kan indsprøjtes i neonatal musehjerne ved hvert sted uden at pådrage skader, og cellerne vil vandre væk fra injektionsstedet, så deres densitet ved transplantation er et mindre problem, end man kunne forventet. Endelig køre nogle testbetingelser med MGE celler, der udtrykker et fluorescerende reporter at bestemme, hvad injektion dybder er optimale. Mens dette anvendte protokol MGE celler kunne CGE celler også anvendes på samme måde. En ulempe er, at der ikke er mange Cre-driver linjer, der begrænser udtryk for hele CGE eller til bestemte undergrupper af CGE-afledte interneuroner. Imidlertid vasoaktivt intestinalt peptid (VIP) 9 er en pålidelig Cre-line, der kan anvendes til at adskille denne undergruppe af CGE-afledte celler. Som nye linjer bliver tilgængelige, vil det være muligt at anvende denne protokol med mere genetisk præcision.
Tidligere har vi og andre vistnytten af at indføre gener i MGE celler før transplantation via elektroporering eller med lentivirus 15, 17. Selv om disse teknikker var effektiv til indføring af gener til in vivo-analyse, MGE væv er heterogen og giver anledning til flere interneuron undergrupper samt ikke-neuronale celler 4. Endvidere har det været vanskeligt at udtrykke et gen af interesse kun i et bestemt interneuron undergruppe. Store fremskridt er blevet gjort for at generere transgene linjer, der rekapitulere ekspressionsmønstre for mange corticale interneuron undergrupper, herunder, men ikke begrænset til, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre en d VIP-Cre 9 -11, og fremkomsten af nye linjer vil hjælpe belyse yderligere mulige vifte i fremtiden. Endvidere med genereringen af Cre-afhængige reportere og ekspressionsvektorer, herunder Cre-afhængige reporter vektorer anvendt heri, en mere præcis ekspression af gener af interesse kan opnås.
En begrænsning af denne teknik kan være størrelsen af fragmentet, at man pålideligt kan pakke i en lentiviral vektor. Desuden denne fremgangsmåde er endnu ikke blevet testet med AAV'er. Men når denne teknik optimeres individuelt, mange variationer af denne fremgangsmåde kan anvendes. Først den fremgangsmåde, der er beskrevet her, vil gøre det muligt for forskerne at udtrykke journalister ved hjælp af et Cre-afhængig reporter lentivirus sammen med MGE donorceller specifikke Cre-driver linjer. Denne teknik kan anvendes til at vurdere morfologien af individuelle MGE celler eller potentielt at udtrykke et gen af interesse i forskellige undergrupper, hvis et andet gen klones ind i vektoren. For det andet kan det også være muligt at anvende en Cre-udtrykkende virus med Cre-afhængig reporter MGE donorceller eller potentially udnytte udviklende konserverede DNA-elementer, promotorer og forstærkere, til at drive ekspression i forskellige populationer af celler fra en heterogen population.
En fremtidig hurdle at overvinde, vil blive mærkning humant afledte inducerede pluripotente stamceller eller embryonale stamceller til potentielt rense og / eller studere en bestemt gruppe af celler. Interessant, kan konserverede DNA enhancere også anvendes i virale ekspressionssystemer at målrette GABAerge neuroner i primære kulturer, efter injektion i cortex, og før transplantation af MGE celler 15, 18, 19. Enhancere kan være et svar på denne hindring og vil være af interesse som molekylære værktøjer, som nye teknikker er nødvendige for at undersøge anvendeligheden af disse celler i terapi. Faktisk indhug til at opdage forstærkere, der potentielt kan mærke enten GABAerge interneuroner 20 eller andre neuronale undertyper, herunder glutamaterge neuroner 21, er på vej. Anvendelse af virale mærkningsmetode herikan det være muligt at transducere differentierede humane afledte stamceller med celletype-specifikke enhancere til at mærke forskellige celler af interesse før transplantationen og in vivo analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud til JLRR fra: Autisme Taler, Nina Irland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880, og NIMH R37 MH049428. PRW blev støttet af et stipendium fra Science Rådet for Taiwan National. SFS blev støttet af F32 (MH103003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
