Summary
Gabaergic kortikal Interneuron stamfedre spre seg, utvikle og postsynaptisk integrere i en verts cortex etter transplantasjon. Disse cellene kan lett omformet før transplantasjon for in vivo studier av genmodifiserte gabaergic forløpere. Her viser vi viral merking teknikker for å målrette bestemte Interneuron undergrupper ved hjelp av eksisterende Grobunn linjer og Cre-avhengige journalister.
Abstract
Gabaergic kortikale interneuroner, avledet fra embryonale mediale og caudal ganglieblokkere eminenser (MGE og CGE), er funksjonelt og morfologisk mangfoldig. Innhugg har blitt gjort i å forstå rollene til forskjellige Interneuron undergrupper bark, men det er fortsatt mange mekanismer for å bli jobbet ut som kan bidra til utvikling og modning av ulike typer gabaergic celler. Videre kan forandres GABAergic signale bidra til fenotyper av autisme, schizofreni og epilepsi. Spesifikke Cre-driver linjer har begynt funksjonene til unike Interneuron undergrupper å pakke ut. Til tross for fremskritt i musemodeller, er det ofte vanskelig å effektivt studere gabaergic kortikal Interneuron stamfedre med molekylære metoder in vivo. En viktig teknikk som brukes for å undersøke celleautonome programmering av disse cellene er transplantasjon av MGE celler i vertsekser. Disse transplanterte cellene vandrer mye, differensiere, ennd funksjonelt integrere. I tillegg kan MGE celler effektivt transdusert med lentivirus umiddelbart før transplantasjonen, slik at for et mangfold av molekylære tilnærminger. Her har vi detalj en protokoll for å effektivt transduce MGE celler før transplantasjon for in vivo analyse, ved hjelp av tilgjengelige Cre-driver linjer og Cre-avhengige ekspresjonsvektorene. Denne fremgangsmåten er fordelaktig fordi den kombinerer nøyaktig genetisk manipulasjon med evnen til disse cellene for å dispergere etter transplantasjonen, hvilket tillater større celletype spesifikk oppløsning in vivo.
Introduction
Gabaergic kortikale interneuroner omfatter ~ 20-30% av nevroner i pattedyr neocortex, mens resten svarer til eksitatoriske, glutamaterge viktigste nevroner. Interneuroner er svært forskjellige i elektrofysiologisk egenskaper, axon og dendrite morfologi og synaptic målretting en, og ubalanser i eksitatorisk / hemmende tone er antatt å ligge til grunn noen fenotyper av nevrologiske / nevropsykiatriske lidelser, inkludert autisme, schizofreni og epilepsi 2. Det overordnede målet i protokollen beskrevet her er å gi et middel for å effektivt genmodifisere gabaergic kortikale Interneuron stamfedre før transplantasjon for in vivo analyser.
Kortikal gabaergic interneuroner er født i mediale og caudal ganglieblokkere eminenser (MGE og CGE, henholdsvis) 3,4 samt preoptic område 5. Kortikale Interneuron stamfedre gjennomgå langdistanse tangential migrasjon fulgtved radial migrasjon for å nå sine endelige mål. Ved ankomst til sine destinasjoner, må disse kortikale interneuroner riktig integrere i eksisterende nevronale nettverk, og hver unike interneuron undergruppe vil bidra til kortikal kretser på bestemte måter. Fire hoved undergrupper kan være preget av molekylære markører: MGE-avledet somatostatin (SST) + og parvalbumin (PV) + undergrupper, og CGE-avledet vasoaktive intestinal peptid (VIP) + og Reelin +; SST - undergrupper 6. Ulike Interneuron undergrupper kortikale er født over forskjellige tider under embryonal utvikling i MGE og CGE 7, 8. Disse og andre kortikale gabaergic Interneuron markører har blitt brukt til å generere spesifikke Cre-driver linjer for mange av disse undergruppene 9-11.
Transplantasjon av MGE stamfedre har dukket opp som en potensiell cellebasert terapi for å behandle lidelser som kan være forårsaket av ubalanseri eksitasjon / hemming 12-24. Disse terapeutiske fordeler kan skyldes delvis den unike evnen til MGE stamfedre (å spre seg, differensiere og integrere i en rekke hjernen), eller potensielt fordi mange peri-somatiske hemmende PV + celler er utledet fra MGE. MGE celler kan også være raskt og effektivt transdusert med lentivirus før transplantasjon 15, slik at celler som er genetisk modifisert in vitro for å bli studert in vivo. Begrunnelsen for å utvikle denne tilnærmingen var å overvinne veisperringer i å studere GABAergic kortikal interneuron utvikling og modning. Spesielt MGE transplantasjon tillates forskere for å studere utviklingen av mutante celler in vivo, når den mutante mus ellers ville ha dødd på et tidlig tidspunkt. Videre, ved innføring av gener som er av interesse før transplantasjon, virkningene av spesifikke gener på en mutant fenotype kan bli vurdert i en efficient måte.
Her gir vi en detaljert protokoll for å transduce MGE celler med lentiviruses før transplantasjon. I tillegg viser vi hvordan denne teknikken kan tilpasses til å uttrykke et gen av interesse i bestemte Interneuron undergrupper fra en heterogen gruppe av cortical Interneuron forløpere, ved hjelp av en kombinasjon av Cre-avhengige uttrykk lentiviruses og tilgjengelige Cre-driver mus linjer. Dessuten introduserer denne protokollen teknikker og en plattform for forskere å genmodifisere gabaergic kortikal Interneuron forløpere for in vivo studier på en unik måte. En fordel med denne teknikken fremfor andre nåværende metoder er at de transplanterte cellene MGE vil spre seg borte fra injeksjonsstedet. Også, i motsetning fokale virale injeksjoner, etter MGE celler spre deres morfologi er lettere å vurdere. Denne tilnærmingen kan brukes for å studere effekten av innføring av gener som er av interesse inn i villtype eller mutante celler, innføring av en celletype spesifikkreporter for å vurdere morfologi, eller eventuelt for å studere effekten av sykdoms alleler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Følgende prosedyrer er godkjent av vår institusjon og dyr protokollen. Sørg for å få godkjenning for alle prosedyrer som involverer overlevelses operasjoner før du begynner eksperimenter og kontrollere alle protokoller er oppdatert.
1. Lentivirus Forberedelse (valgfritt trinn)
- Delt i tre 10 cm plater av HEK293T celler for hver lentivirus å bli gjort, i nærvær av 10 ml DMEM / 10% FBS, og vokse til ~ 60-70% konfluens. Dyrke cellene i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Transfektere de følgende DNA-plasmider (10 ug totalt) i hver plate ved hjelp av en hvilken som helst transfeksjon reagens: 6,4 ug CAG-Flex-GFP lentiviral vektor-DNA (vektorsekvensen er gitt i tabell 1), 1,2 ug pMD2.G (koder for VSV-G), 1.2 mikrogram pRSV-Rev, og 1,2 mikrogram pMDLg / pRRE. De tre lentivirale emballasje vektorer er kommersielt tilgjengelige (tabell
Merk: Denne tilnærmingen benytter tredje generasjon lentiviral vektorer, men andre generasjon vektorer og tilhørende plasmider vil også arbeide. - Utarbeide en avfallsbeholder som inneholder en 10% blekemiddel innenfor en BSL2 sertifisert hette for å inaktivere noen løsninger eller enheter som kontaktet eller inneholder lentivirus. Deretter fjerne mediene 4-6 timer etter transfeksjon inn i blekemiddel, erstatte med samme volum av nye medier, og la cellene til å vokse.
- Etter 4 dager, samle mediet i 50 ml koniske rør og sentrifuger ved 1000 xg i 15 minutter for å pelletere en hvilken som helst cellerester. Deretter filtreres supernatanten gjennom et 0,45 um membran. Enhver lav protein binding filter, som PVDF, fungerer godt. Forsiktig: sted både fast og flytende viral avfall i kloroppløsning.
- Last 30 ml filtrert supernatant inn ultrasentrifugerør rør og inn i en ultrasentrifuge. Sentrifuger ved 100 000 x g i 2,5 timer ved 4 ° C. Åpne sentrifugerør i en BSL2 hette og fjerne supernatanten til 10% Bleach. Legg ~ 100 mL PBS til peklumpen, som gir titere på 1x10 ^ 7-8 smittsomme enheter / ml. Delmengde neste dag og oppbevares ved -80 ºC. Lentivirus aliquoter er stabil ved -80 ° C i minst seks måneder.
- Viktige hensyn: Mange institusjoner har nå viral kjerner. Erverve konsentrert virus med minimum titer av 1x10 7 smittsomme enheter / ml, for optimale resultater.
2. Donor Mus for MGE Dissection
- Først satt opp en tidsbestemt parring mellom en Cre-uttrykke linje av interesse og enten en vill type (WT) mus eller en mus som vil uttrykke en reporter etter Cre-mediert rekombinasjon.
Merk: Mange Cre-driver linjene er transgene og blir vedlikeholdt og oppvokst i hemizygous tilstand. Således vil bare halvparten av embryoene inneholde Cre transgenet. DNA kan raskt fremstilles fra embryoene etter en kort PCR for å påvise allele Cre. CRE + embryo kan deretter høstes slik at bare den MGE vevet for den ønskede genotype brukes. Vekselstrømsvis, kan en Cre-avhengige reporter brukes, for å velge embryoene for MGE disseksjon og transplantasjon. - Beregne hvilken dag vil tilsvare E13.5. Hvis dyrene var forbundet kvelden før, er dagen av pluggen 0.5. Bestill timet-gravide mus eller en WT kvinne med P1 valper for å tid å ha barsel (P) en mus på dagen donor vev vil være E13.5. Alternativt sette opp disse parringer i huset en uke før sammenkobling donordyrene.
Merk: Den tidligere strategi for å generere både E13.5 og P1 embryo / valper for samme dag er ofte vanskelig å gjøre en pålitelig måte.
3. Utarbeidelse av Media, verktøy og utstyr.
- Forberede reagenser og verktøy for MGE celle forberedelse (tabell 2).
- Forberede en ren flate og legger rene pinsett, saks og enten en mikro kniv eller fin pinsett (for presis vev disseksjon) på overflaten.
- Forbered Hanks balanserte saltløsning (HBSS), feller disseksjon, og Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint surem (FBS), for transduksjon.
- Forinkubere 20 til 30 ml DMEM / 10% FBS i en 37 ° C vevskultur-inkubator i ca. 1 time. Lokket bør løsnes for å tillate gassutveksling og pH likevekt av media.
Merk: Medie preinkubasjon kan tilberedes rett før du starter disseksjon.
4. MGE Cell Forberedelse
- Ofre den gravide mus i henhold til godkjent dyr protokollen og fjerne embryoene i en 10 cm petriskål med iskald HBSS.
- Fjerne hjernen fra hvert embryo ved hjelp av en dissekere omfang (gjøre en om gangen, mens resten av embryoene i iskald HBSS) og deretter fortsette å kutte ut MGE vev.
Merk: Detaljert nedenfor, og i figur 1, er viktige skritt som viser hvordan du fjerner MGE. I tillegg, figur 2 er en film som viser hele disseksjonprosedyren.- Plasser hjernen med ventral siden opp (figur 1A, A '). Merk: Det er også greit å ha rygg aspektet vendt opp. Skjær hjernen i to langs den Saggital plan for å generere to stykker. Et eksempel hemisected hjerne er vist (figur 1B, B '), legge merke til at rygg (overliggende cortex) og ventral aspekter av dekselet hjernen og omgir ganglie eminense (GE) vev.
- Neste, med en dominerende hånd, hold enten veldig fin pinsett eller en stabknife (tabell 2), mens immobilisere den halvkule med pinsett holdt av en ikke-dominant hånd. (The halvkule sin mediale aspekt skal vende opp). Brett ut dorsal og ventral vev med pinsett og et stikk kniven for å avdekke den underliggende GE vev (figur 1C og skjematisk i figur 1C).
Merk: Fjerning av noen medier fra disseksjon petriskål kan gjøre det lettere å stabilisere vev mens performing MGE disseksjon. - Oppnå rette kutt med stabknife eller fin pinsett for å skille CGE, LGE og septal vev (se eksempel kutt merket med stiplede røde linjer, figur 1D og D '). Disse kuttene kan gjøres i hvilken som helst rekkefølge.
Merk: Tenk MGE som en "boks" som er skåret ut av omkringliggende vev. Gjør du det hjelper reproduserbart gjøre lignende kutt for hver disseksjon, og dermed redusere variabilitet i vev disseksjoner. - Til slutt, slår MGE på sin side og klippe av bunnen (hva var den laterale del av hjernen). Dette fjerner mantelen sone av MGE (kast i figurene 1E og 1E ') fra resten av MGE. Den gjenværende del av MGE inneholder primært ventrikulær sone og subventricular sonepartier av MGE, som inneholder nesten alle de MGE stamceller. Fortsett med dette vevet.
- Viktig betraktning: Tilsetning av silikongel til bunnen av en petriskål can tjene som et utmerket disseksjon overflate som det beskytter den delikate tips av tang og gir en myk overflate for låsing vev med pinsett.
4.3 Andre strategier for MGE Dissection.
- Skjær huden av embryoet ved hjelp av tenger som en saks for å raskt fjerne hjernen. Som embryoet legger på sin side ved å holde vevet i bunnen av hodet med tang som benyttes for å feste vev. Først kuttet anterior ventral til hjernen og posterior ventral til hjernen, og deretter koble de to kutt langs siden av embryo. Så grip klaffen av huden og dra den over toppen av hjernen. Hjernen kan deretter raskt dissekert bort fra det gjenværende vevet.
- Alternativt kan forankre den bakre del av hele hjernen bak cortex. I mellomtiden, ta tak hver halvkule på det mest rygghale aspekt av hjernebarken og rive cortex bort fra den forankrede vev i en anterior retning. På denne måten, både cortices kan fjernes og de bilaterale ganglieblokkere eminences avsløres, fortsatt festet til resten av vevet bevare medial-lateral anatomi.
- Bytt til det stikk-kniv for å gjøre nøyaktige kutt rundt MGE på hver halvkule. Bruk enten en egen ren sett med tang for å samle MGE eller en pipette med en stor spiss (ie., P1000).
Merk: Hold samlet vev bort fra alt annet preparat materiale, som noen medier er uunngåelig overført når MGE samles. - Samle MGE og sette vevet i et 1,5 ml rør inneholdende samling DMEM / 10% FBS, (et volum på 500 ul er tilstrekkelig til å samle MGEs). Gjenta for den andre halvkule og plasser i samme samling rør. Holde prøvene på is inntil alt vev oppsamles.
5. Lentiviral merking og Transplantasjon
- Flytt rørene av MGE vevet inn en BSL2 sertifisert hette og fjerne mediet.
Merk:MGE vev er stort nok til å være synlige for øyet og vil synke til bunnen av røret slik at for de kalde medier for å være lett og forsiktig fjernet. - Legg ~ 500 pl DMEM / 10% FBS medier, som ble preinkubert i en 37 ° C vevskultur-inkubator. Deretter legger polybren å lette transduksjon til hvert rør til en sluttkonsentrasjon på 8 ug / ml. Triturer MGE vev for å lage en enkelt celle suspensjon, ved hjelp av en P1000 pipette. Til slutt legger ~ 15-20 mL konsentrert lentivirus i hvert rør.
- Viktig vurdering: Et finfordeling av 10-12 ganger er tilstrekkelig til å bryte opp MGE vev fra en enkelt embryo, men flere Triturations kan være nødvendig dersom flere MGEs samles sammen. Prøve ut forskjellige Triturerings forhold for å finne ut hva som fungerer best.
- Sikkert lukke hvert rør, inverterer å blande, enn stedet alle rørene i et 37 ° C inkubator. Cellene inkuberes i lentivirus i minst 30 minutter og opp til 1 time. Lengre ganger har resultert i dekrøllete celle levedyktighet. Invertere rør hvert 10 min før tiden er ute.
- Etter inkubering med lentivirus, fjerne rørene fra inkubatoren og sentrifuger ved ~ 700 x g i 3 minutter for å pelletere cellene. I BSL2 hette, fjern supernatanten og kast inn i 10% blekemiddel. Deretter tilsett 1 ml DMEM / 10% FBS og triturer pelleten 2-3 ganger for å vaske, og deretter sentrifugeres igjen ved samme hastighet for å pelletere cellene. Gjenta denne vaske-trinn 2-3 flere ganger for å fjerne overflødig virus.
Merk: Utfør sentrifugeringstrinn ved 4 ° C, men redusert levedyktighet har ikke blitt observert når korte spins utføres ved RT. - Etter den siste vaskingen, fjerne så mye media som mulig og sette hvert rør på is. På grunn av restmateriale på hver side av røret, ~ 2-3 ul av mediet vil ende opp som dekker cellepelleten av tiden transplantasjonsprosedyren har begynt.
6. Transplantasjon og validering
- Erverve verts P1 valper og forberede prosedyrenOmrådet ved sprøyting ned med 70% etanol. For å opprettholde sterilitet under prosedyren er det anbefalt å utføre disse fremgangsmåtene i en dedikert ren prosedyre rom. I tillegg bruker enten autoklaveres kirurgiske verktøy sterilisere overflater som valpene vil være i kontakt med med 70% etanol. Et eksempel på et representativt utstyr som trengs for å utføre de transplantasjoner og en representativ prosedyre område er vist på figur 3.
Merk: Når denne prosedyren er en injeksjon av små volumer og ikke et kirurgisk inngrep som krever et innsnitt, åpent sår eller suturer, anbefales det fremdeles at en ny mikropipette brukes for hver mus som skal injiseres. De mikropipetter er varme sterilisert når trukket og skrå på en overflate som ble sprayet med 70% etanol blir lagret i en lukket beholder.
- Generere mikropipetter for å ha en diameter ved spissen mellom 40-80 um. Etter disse dimensjonene vil gi optimalresultater. Heat sterilisere mikropipetter når trukket og skrå på en flate og spray med 70% etanol før lagring av mikropipetter i en lukket beholder.
Merk: Alternativt, hvis tilgang til de enhetene du trenger for å lage disse nålene (tabell 2) er begrensende, kan du bruke en hvilken som helst annen injeksjonsutstyr. Imidlertid kan disse ikke være så godt egnet som mikropipetter som skyldes forskjellige diametre. - Utarbeide mineralolje i en 1 ml sprøyte, og med en 30 1/2 G nål, fylle glasspipette fullstendig med mineralolje. Deretter monteres stempelet på stereotaxic enhet, deretter feste glass pipette til stereotaxic enhet og belastning på stempelet. Ved hjelp av hydraulisk drift, flytte stempelet omtrent midtveis i glass pipette, fjerne mineralolje som flommer ut med en ren et rent tørkepapir.
- Alternativt til å bruke en sprøyte, senk den bakre ende av pipetten i mineralolje og fylles ved kapillarvirkning. Å hindre luftbobler i pipette, opprettholde positivt trykk på sprøyten til det er helt ute av glasspipette.
Merk: Andre enheter kan brukes til å lykkes transplantere MGE celler 14. Alle enheter som kan levere et volum mindre enn eller i nærheten av 100 nl fungerer godt for denne prosedyren.
- Alternativt til å bruke en sprøyte, senk den bakre ende av pipetten i mineralolje og fylles ved kapillarvirkning. Å hindre luftbobler i pipette, opprettholde positivt trykk på sprøyten til det er helt ute av glasspipette.
- Deretter bruker du en steril papirhåndkle, eller noen absorberende materiale, med hjørnet vridd til en fin spiss for å fjerne overflødig media delikat ovenfor MGE cellepellet. Dette trinnet konsentrater celletettheten, slik at små injeksjonsvolumer kan oppnås. Deretter bruker du en lav volum (P2 er å foretrekke) pipette å sakte trekke opp cellen pellet og finfordel 1-2 ganger før du flytter cellesuspensjonen på en hydrofob overflate. Volumet bør være i underkant av en mikroliter. Flytter spissen av nålen inn i cellesuspensjonen, og ved hjelp av hydraulisk drift, tegne opp cellesuspensjonen inn i pipetten.
- Bedøver en P1 valp via hypotermi (pakk i en latex hanske og lagt på is for ~ 2-4 min).Sjekk for effektiviteten av anestesi med en skadelig stimulus. Klemme huden mellom tærne med fin pinsett: valpen bør være trege hvis klem. Deretter plasserer valpen på en mold som er under injeksjon enheten og deretter gjøre huden stram ved å trekke tilbake huden på hodet og sikring med standard lab tape.
Merk: Mens hypotermi er svært effektiv på nyfødte mus og resulterer i lav dødelighet, må prosedyrer gjøres raskt, som valper vil begynne å komme på under 10 min. I tillegg, er 4 min på is en øvre grense for hva som kan tolereres. Prøv å bare indusere hypotermi gang hvis en lengre tid er nødvendig for injeksjoner. Men hvis en valp gjen tidlig, først la valpen å fullt igjen før hypotermi igjen. Videre har bare indusere hypotermi en mer tid til å utføre injeksjoner. Valper vil komme innen 5-10 min av hypotermi. Dette kan gjøres lettere ved å plassere valpene med søppel og mamma eller ved å plassere valpen på en varm surface for å gjenopprette. - Ved hjelp av en stereotaksisk anordning, plassere spissen av pipetten glass på overflaten på pup hode, vinkelrett på overflaten av hodet. Når pipetten er i kontakt med hodet, anser dette som '0'. Deretter, trykk på pipetten gjennom overflaten av huden og skalle inn i hjernebarken, og deretter sette inn og trekke pipetten ~ 2 ganger før det stopper. For optimal målretting av celler inn i neocortex, blir injeksjoner utføres når mikropipette ligger i en dybde på 0,1 mm. Imidlertid bør dette være optimalisert av brukeren (se merknad nedenfor).
Merk: Mens denne dybden pålitelig rettet mot dypere neokortikale lag med enhetene som er beskrevet ovenfor, bør noen dybder testes bestemmes empirisk. I tillegg bør et område av dybder på forskjellige rostro-kaudal og Medio-lateral posisjon bli testet for å finne ut hva som er optimal dybde på hvert sted. Dessuten bør den første punkterings være hurtig, så sakte penetrering inn i neocortex avtar evnen til cleanly trenge inn i vevet. Prøv forskjellige hastigheter når den først starter denne prosedyren for å finne hva som fungerer best. I tillegg, for testing av koordinater, er det ingen reell erstatning for bruk av merkede celler, som fargestoffer har vært upålitelig å betegne stilling. - Når nålen er i posisjon, rotere den hydrauliske enheten for å avansere stempelet inn i glass pipette, presser et sett volum av cellesuspensjonen i hjernebarken. Injisere 50-70 NLS per område. Gjenta denne prosedyren på 3-6 forskjellige steder på forskjellige rostrokaudale nivåer hvis målet er å få en bred distribusjon av celler i hele neocortex.
Merk: Volumer på 100 nl eller større kan forårsake lesjoner og føre til store klumper av injiserte celler som ikke effektivt migrere ut av injeksjonsstedet. Dermed mindre injeksjonsvolumer (~ 70 nl eller mindre) er optimale, over flere områder dersom tiden tillater det. - Når injeksjoner er fullført, fjerner valpen fra scenen og merke det (tå klipping er en pålitelig måte å identifisere pups senere). Når valpen har kommet seg og er i stand til å bevege seg på egen hånd (dette skjer i løpet av minutter for å fjerne dem fra scenen), legg den tilbake med mor og kull.
Merk: Siden dette er en minimal invasiv prosedyre er det ingen post-kirurgiske prosedyrer når valpen er fritt bevegelige og varmet. Imidlertid bør pups kontrolleres ikke bare etter inngrepet, men også den påfølgende dagen for å sikre at de har ingen tegn til forverret helse. - Før du starter prosedyren på neste valp, spray ned området med 70% etanol for å opprettholde et sterilt arbeidsområde. Tillat de injiserte pups å utvikle og deretter vurdere vev ved passende utviklingsstadiet (ene).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siden MGE celler har en unik evne til å migrere og integrere når transplantert inn en rekke neocortex 16, de gir en utmerket modellsystem for genetisk manipulasjon før in vivo studier. Heri viser vi hvordan man kan isolere MGE vev fra E13.5 embryoer (figur 1 og 2), som deretter kan bli transdusert med lentivirus, enten in vitro eller in en hurtig måte før transplantasjon for in vivo-studier. Merking MGE via lentiviruses er utført før du bruker en forsterker kjører GFP i gabaergic nevroner 15. Imidlertid, evnen til å uttrykke gener i spesifikke undergrupper fra en heterogen populasjon før transplantasjon kan i stor grad hjelpe studier av disse cellenes dispergering og integrasjon. Heri, søkte vi å utvikle et middel til å målrette ekspresjon av et fluorescerende protein til en bestemt interneuron undergruppe, de som uttrykker somatostatin (SST) +.
Vi first subklonet en kommersielt tilgjengelig Cre-avhengige GFP reporter (vektor informasjon, tabell 2) inn i en lentiviral ryggrad. Vektoren ble dannet ved først å subklone kassetten inneholdende GFP flankert av loxP-seter fra AAV vektor og ligering av den i en lentiviral vektorryggraden 15 ved hjelp av Xbal og PflMI restriksjonsseter, (denne kassetten inneholdt bare noen av CAG promoter). Deretter ble resten av CAG promoter spaltet fra en pCAGGs pattedyr-ekspresjonsvektor med Spel og Xbal og ligert inn i XbaI-setet av vektoren lentiviral å generere pLenti-CAG-Flex-GFP. 5 'Spel-sete av innsatsen er gratis å Xbal og dermed ødelagt den 5' nettsted, mens 3 'XbaI nettstedet ble bevart. Den resulterende vektor (skjema figur 4A, vektorsekvensen tabell 1) ble først testet in vitro i nærvær eller fravær av Cre (skjema av in vitro-analysen, figur 4B). MGE primære neuroner fra Ai14 FLOX / + E13.5 embryoer ble dyrket og transdusert med en kombinasjon av lentivirus. Få eller ingen GFP + eller tdTomato + celler ble observert med bare transduksjon av CAG-Flex-GFP lentivirus (Tall 4C, 4F og 4I). TdTomato fluorescens var til stede i MGE celler transdusert med en CMV-Cre lentivirus, en indikasjon på Cre uttrykk (Tall 4D, 4G og 4J). Til slutt, co-transduksjon av MGE celler resulterte i mange tdTomato + -celler som også blir uttrykt GFP, noe som indikerer at CAG-Flex-GFP lentivirus virket som forventet (fig 4E, 4H og 4K). Noen sjeldne GFP + celler ble observert som ikke var tdTomato +, eventuelt på grunn av transdusert reporter som omfatter ved siden av en sterk promoter, som utgjorde <2% av alle de GFP + celler.
innhold "> MGE celler transplantert inn en villtype verts neocortex spre, moden og integreres i verts neocortex 16 E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 FLOX / + MGE celler ble transplantert inn WT neocortices på P1 (skjema, figur 5A) og deres fordeling undersøkt ved 7 og 35 dager etter transplantasjon (DPT). På begge aldre, kan tdTomato + celler sees hele neocortex (Tall 5B og 5C). Bildene i figur 5B og 5C er representative transplantasjoner utnytte MGE . celler fra en enkelt embryo For å teste hvor effektivt MGE celler kunne merkes med protokollen beskrevet her, MGE celler fra SST-IRES-Cre +; Ai14 FLOX / + embryoene ble omformet med CAG-Flex-GFP lentivirus og transplantert i samme måte. For disse eksperimentene, ~ 15 ul av concentrated lentivirus (1x10 ~ 7 infeksiøse enheter / ml) ble anvendt med de kombinerte MGEs fra en embryo for hver transplantasjon. Cellene ble deretter transplantert inn i en verts P1 WT cortex og analysert ved 7 DPT (figurene 5D-5F). Av de transplanterte cellene (tdTomato +), ca 20% var GFP +, noe som indikerer transduksjon med CAG-Flex-GFP lentivirus (figur 5G). Disse data antyder at med mengden og titer av lentivirus beskrevet ovenfor, ~ 20% av transplanterte celler MGE kan merkes. Mengden av virus kan enten reduseres eller økes, eller eventuelt andre variabler som varigheten av viral inkubasjon kan endres, for å oppnå sparser eller tettere cellemerking.Ved hjelp MGE vev fra en Cre-avhengig reporter mus linje i forbindelse med den CAG-Flex-GFP lentivirus kan begrense antallet av ytterligere markører som kan bli probet for ved immunfluorescens. Derfor SST-IRES-Cre + < / Sup> E13.5 MGE vev ble samlet og transdusert med CAG-Flex-GFP lentivirus for å visualisere de transplanterte MGE celler som uttrykte Cre (vil bli GFP +). Disse cellene ble transplantert inn P1 WT cortex og vurdert til 35 DPT (se eksperimentell design, figur 6A), et tidspunkt da modne markører Interneuron er uttrykt. Ved 35 DPT, ~ 85% av GFP + celler co-uttrykte SST, men bare ~ 4% uttrykt PV (fig 6B-6H). Disse tallene er konsistente med avstamning analyse av SST-IRES-Cre mus linje, som også skjebnen maps til ~ 5-10% av PV + celler 9 (Vogt og Rubenstein, upubliserte resultater). Disse data antyder at virus merking av MGE er effektiv og kan være en anvendelig metode for å innføre en reporter eller potensielt et gen av interesse før in vivo analyse.
740fig1.jpg "/>
Figur 1. Representant prosedyre for disseksjon av E13.5 MGE vev. Eksempel disseksjon av MGE vev for enten primære kulturer eller transplantasjoner. (AE) Bilder av E13.5 hjernen disseksjoner, og (A'-E ') skjemaer for å markere strukturer og viktige skritt i prosedyren. (A, A ') Representant E13.5 hjernen sett fra ventral aspektet. Rød linje betegner det første kuttet laget, som vil hemisect hjernen i to deler. (B, B ') Utsikt over én hjerne hemisection. Den mediale aspektet er synlig, med sideveis aspekt ned. Vev fra rygg cortex (blå farge) ligger over ganglieblokkere eminenser. I tillegg er ventral vev som skal fjernes vist i orange. (C, C ') Se og illustrasjon av de eksponerte ganglieblokkere eminences etter overliggende vev har blitt skrellet bort. (D, D') Samme riss av eksponert ganglie-emi nences som i (C, C '), men med detaljerte kutt områder vist som stiplede røde linjer. Etter MGE er skåret ut i henhold til de linjer som er betegnet i (D, D '), blir vevet snudd på sin side (E, E'), og den laterale aspekt er trimmet fra og kastet. Representative trinn i disseksjon og isolering av MGE vev. Forkortelser: (CGE) hale ganglie eminence, (LGE) lateral ganglie eminense, (MGE) mediale ganglionice eminense. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Film som viser en E13.5 MGE disseksjon. Film viser fjerningen av en E13.5 hjernen fulgt av etterfølgende utfolding og fjerning av det overliggende vevet. MGE er merket og kuttene er gjort for å fjerne omkringliggende vev er show i en trinnvis rekkefølge.. MGEdissect movie.mov "target =" _ blank "> Klikk her for å se denne videoen.
Figur 3. Representant prosedyre området og eksempel på kanylen for neonatale transplantasjoner. (A, A ') Bildene viser et eksempel oppsett for å utføre transplantasjoner i neonatale mus. Et mikroskop (1) er plassert over en scene som inneholder en form som kan holde en neonatale mus (5) og en stereotaksisk anordning (2). (A ') Et forstørret bilde av (A) som viser det område av stereotaktisk anordning som holder glassinjeksjonsnålen (6) med en innsatt stempel (7). Stempelet styres av en fin hydraulisk drift (4) og beveger mineralolje i glasset nål som medierer indre og ytre strømmer fra nålen. (B) Eksempel på en glass kanyle med en avfaset spiss. For det hersker i (B), hvert store avgrensning = 100 mikrometer. (C) Inventory liste over elementer som vises i (A, A '). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. In vitro tester demonstrerer ekspresjon av GFP fra en CAG-Flex-GFP lentivirus i nærvær av Cre. (A) Skjema av hvordan lentiviral CAG-Flex-GFP vektor arbeider i nærvær av Cre. (B) Skjema av primær MGE cellekultur eksperiment for å vurdere om den lentiviral CAG-Flex-GFP ville uttrykke GFP i disse cellene med Cre uttrykk. I korthet MGE celler fra en Cre-avhengig reporter, Ai14 (uttrykker tdTomato i nærvær av Cre), ble dyrket in vitro og omformet med Cre og / eller Flex-GFP lentiviruses. (CK) Immunofluorescent bilder av E13.5 MGE primærkulturer som ble transduserte med en CMV-Cre, CAG-Flex-GFP eller begge deler. Kulturer ble fotografert for native tdTomato uttrykk, GFP og DAPI. Skala bar i (K) = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representative bilder av transplanterte og transduserte, SST-IRES-Cre +; Ai14 FLOX / + MGE celler. (A) Schema av eksperimentell design å transplantere enten MGE celler alene eller etter lentiviral transduksjon inn en villtype (WT) vert, (DPT) dager post transplantasjon. Kortfattet, E13.5 SST-IRES-Grobunn +;. Ai14 FLOX / + MGE celler ble enten transplantert eller transdusert med CAG-Flex-GFP lentivirus før transplantasjon til WT neocortices og vurdert til 7 DPT (B, C) immunofluorescent bilder av neocortices på 7 eller 35 DPT viser representative MGE transplanterte celler (tdTomato +). (DF) Immunofluorescent bilder av MGE celler transdusert med CAG-Flex-GFP lentivirus vurdert til 7 DPT. (G) Kvantifisering av andelen tdTomato + celler som uttrykke GFP 7 DPT. Skala barer i (C) og (F) = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2740fig6.jpg "/>
Figur 6. Representative bilder av CAG-Flex-GFP lentivirus omformet, SST-IRES-Cre + MGE transplantasjoner som co-express MGE-avledet Interneuron undergruppe markører. (A) Schema av E13.5 SST-IRES-Cre + MGE celleinnhøstningsutstyr og transduksjon med en CAG-Flex-GFP lentivirus og transplantasjon inn i neocortex av P1 WT verter før vurdering på 35 DPT. Representative bilder fra neocortex av transplanterte verter som viser ekspresjon av GFP, fra Flex-vektor (B, E), co-farget for enten somatostatin (SST) (C) eller parvalbumin (PV) (F). (D, G) Sammenslåtte bilder co-farget med DAPI. (H) Kvantifisering av andelen av GFP celler som co-express SST eller PV. Data representerer ± SEM (n) = 3. Skala bar i (G) = 100 um./52740fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. FASTA fil av pLentiviral-CAG-Flex-GFP DNA vektor.
| Reagenser og utstyr for MGE celle forberedelse og transduksjon | Catalog # | Selskap | ||||||
| 1) | Dulbeccos modifiserte Eagle-medium med høyt glukose | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | Varme-inaktivert føtalt bovint serum | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | Hanks balanserte saltløsning (HBSS) uten kalsium eller magnesium | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | 1,5 ml mikrosentrifugerør (eller annensamling rør med lokk) | 3810X | Eppendorf International | |||||
| 5) | Polybren | sc-134220 | Santacruz Bioteknologi | |||||
| 6) | Dolke kniv rett 22.5 ° (valgfritt) | NR 72-2201 | Kirurgiske spesialiteter aksjeselskap | |||||
| 7) | Petriskål (10 cm), for vev disseksjoner | FB0875713 | Fisher Scientific | |||||
| 8) | 2 fine tips tang, som Dumont # 5 | 11254-20 | Fin Vitenskapelige Tools | |||||
| 9) | 37 ° C vevsdyrkningsinkubator med 5% CO 2 inngang | C150 | Binder | |||||
| 10) | Tabletop sentrifuge som kan spinne 1,5 ml mikrosentrifugerør | |||||||
| 11) | Enhver P1000 pipette som kan brukes for celle trituration | |||||||
| 12) | Biosikkerhetsnivå 2 hette | |||||||
| Reagenser og utstyr for in vitro MGE primærkulturer | Catalog # | Selskap | ||||||
| 1) | Lab-TekII chamberslides med cover, åtte godt | 154941 | Thermo Fisher | |||||
| 2) | Poly-L-lysin 0,1% vekt / volum | P8920 | Sigma Aldrich | |||||
| 3) | Mus Laminin, 0,5-2 mg / ml | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | Neurobasal medium | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | B27 serum gratis supplement | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, 100x lager | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | Penicillin-streptomycin, 100x lager | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | Glukose, (stille en 25% oppløsning i vann) | G5400 | Sigma Aldrich | |||||
| Reagenser og utstyr for MGE celletransplantasjon | Catalog # | Selskap | ||||||
| 1) | 1 ml sprøyte | NR 309602 | BD, Becton Dickinson og selskap | |||||
| 2) | 30 1/2 G nål | 305106 | BD, Becton Dickinson og selskap | |||||
| 3) | PreCision boringen for å levere 5 pl (kommer med stempelet) | 5-000-1005 | Drummond vitenskapelige selskap | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |||||
| 5) ** | Stereo mikroskop med boomstand | MZ6 | Leica | |||||
| 6) ** | Digital bare for mus stereotaksiske instrument | 51725D | Stoelting selskap | |||||
| 7) ** | Single-aksen olje hydraulisk fin mikromanipluatoren | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | Diamantbelagt roterende beveler | na | gjort i huset | |||||
| 9) | Nål pipettete avtrekker | 730 | Kopf instrumenter | |||||
| 10) | Mineral olje | na | Enhver stoff butikk eller apotek | |||||
| 11) | Enhver pipette og tips som kan reliaby tiltak 1 mL av volum | |||||||
| ** Disse er de spesielle modellene vi bruker, men mange andre oppsett bør arbeide | ||||||||
| Optional Reagenser (for å gjøre lentiviruses) | Catalog # | Selskap | ||||||
| 1) | 25 mm, 0,45 um filter | 09-719B | Fisher Scientific | |||||
| 2) | Ultra-klare sentrifugerør (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1,5 ml størrelse) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| Andre kommersielt tilgjengelige forsyninger | Catalog # | Selskap | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE plasmid koding gag / pol | 12251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-Rev plasmid koding Rev | 12253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G plasmid koding VSVG | 12259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |||||
Tabell 2. Lager liste over reagenser og verktøy. En opptelling av kommersielt tilgjengelige reagenser inkludert media, disseksjon verktøy, representative utstyr for transplantasjon og DNA-vektorer. (Na) Ikke tilgjengelig eller relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av gabaergic kortikal Interneuron forløpere fra embryonale ganglieblokkere eminenser (GES) for cellebasert terapi viser lovende for mange forhold 12 -1 4. Presise molekylære teknikker for å spore, og uttrykke gener av interesse i bestemte Interneuron undergrupper. Her har vi gi en detaljert protokoll for merking embryonale MGE celler med lentivirus før transplantasjon, og viser hvordan denne teknikken kan brukes til å uttrykke gener som er av interesse i spesielle Interneuron undergrupper kortikale for in vivo analyse.
Protokollen er beskrevet her kan bli pålitelig brukes, men for optimal reproduserbarhet er det viktig å følge noen viktige skritt. Først, for viral transduksjon for å være effektive, fysiologisk temperatur og pH er nødvendig. Hvis disse parameterne er oppfylt, kan MGE celler bli omformet i ~ 30 minutter. For det andre, sørg for å ha en tett MGE pellet før du fortsetterå gjøre en transplantasjon. Dette er viktig fordi bare et begrenset volum, kan injiseres i neonatale mus hjernen på hvert sted uten at det oppstår skade, og cellene vil vandre bort fra injeksjonsstedet, slik at deres densitet på tidspunktet for transplantasjon er mindre bekymring enn kanskje forventet. Endelig kjøre noen testforhold med MGE celler som uttrykker en fluorescerende reporter å finne ut hva injeksjon dybder er optimale. Mens denne protokollen som brukes MGE celler, kunne CGE-celler også anvendes på samme måte. En ulempe er at det er ikke mange Cre-driver linjer som begrenser uttrykket til hele CGE eller til bestemte undergrupper av CGE-avledet interneuroner. Imidlertid vasoaktivt intestinalt peptid (VIP) 9 er et pålitelig Cre-linje som kan brukes for å skille ut denne undergruppen av CGE-avledede celler. Som nye linjer blir tilgjengelige, vil det være mulig å bruke denne protokollen med mer genetisk presisjon.
Tidligere har vi og andre vistnytten av å innføre gener i MGE celler før transplantasjon via elektroporering eller med lentivirus 15, 17. Mens disse teknikkene var effektive til å innføre genene for in vivo-analyse, er MGE vev heterogent og gir opphav til flere undergrupper Interneuron så vel som ikke-nevronale celler 4. Videre har det vært vanskelig å uttrykke et gen av interesse bare i et bestemt interneuron undergruppe. Store fremskritt er gjort for å generere transgene linjer som rekapitulere de uttrykk mønstre av mange kortikale Interneuron undergrupper, inkludert, men ikke begrenset til, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre en d VIP-Cre 9 -11, og framveksten av nye linjer vil bidra til belyse flere mulige populasjoner i fremtiden. Dessuten, med generering av Cre-avhengige reportere og ekspresjonsvektorer, inkludert Cre-avhengige rapportør vektorer som anvendes her, kan oppnås en mer presis ekspresjon av gener som er av interesse.
En begrensning til denne teknikken kan være størrelsen av fragmentet at man på en pålitelig måte kan pakke inn en lentiviral vektor. I tillegg er denne tilnærmingen har ennå ikke blitt testet med AAVs. Imidlertid, når denne teknikken blir optimalisert ved individuelt, mange variasjoner av denne fremgangsmåten kan anvendes. Først tilnærmingen beskrevet her vil tillate forskere å uttrykke journalister ved hjelp av en Cre-avhengige reporter lentivirus i forbindelse med MGE donorceller av spesifikke Cre-driver linjer. Denne teknikken kan brukes til å vurdere morfologien av individuelle MGE celler eller potensielt å uttrykke et gen av interesse i forskjellige undergrupper hvis et andre gen som er klonet inn i vektoren. For det andre kan det også være mulig å bruke en Cre-uttrykkende virus med Cre-avhengig reporter MGE donorceller eller Potensially utnytte utvikling bevart DNA-elementer, arrangører og Forsterker, for å drive uttrykk i forskjellige populasjoner av celler fra en heterogen befolkning.
En fremtidig hinder å overvinne vil bli merking menneske avledet indusert pluripotent stamceller eller embryonale stamceller til potensielt rense og / eller studere en bestemt gruppe av celler. Interessant nok kan konserverte DNA- forsterkere også brukes i virale ekspresjonssystemer for å målrette GABAergiske nevroner i primære kulturer etter injeksjon i cortex, og før transplantasjon av MGE celler 15, 18, 19. Enhancers kan være et svar på dette hinderet, og vil bli av interesse som molekylære verktøy, som nye teknikker er nødvendig for å studere nytten av disse cellene i terapi. Faktisk innhugg til å oppdage enhancers som potensielt kan merke enten gabaergic interneuroner 20 eller andre nevronale subtyper, inkludert glutamaterge nevroner 21, er i gang. Bruke viral merking metode her,Det kan være mulig å omsette differensierte humane-avledet stamceller med celletypespesifikke enhancers å merke distinkte celler av interesse før transplantasjon og in vivo analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til JLRR fra: Autism Speaks, Nina Irland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880, og NIMH R37 MH049428. PRW ble støttet av et fellesskap fra National Science Council of Taiwan. SFS ble støttet av F32 (MH103003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
