Introduction
心臓弁疾患は、西洋世界における罹患率および死亡率の主要な原因です。その有病率は年齢とともに増加し、それは人口75年の10％以上と1古い影響を与えます。ハートの全身一部、大動脈弁と僧帽弁の弁は、ほとんど影響を受けています。心臓弁疾患は、機械的特性2の変化をもたらすバルブの高度に組織構造の喪失によって特徴づけられます。構造的完全性は、弁の機能のために極めて重要です。
弁のリーフレットは、非常に層状のパターン3,4で構成されて弁膜間質細胞（VIC）、弁膜内皮細胞（VEC）、および細胞外マトリックス、から構成されています。 VICには、ECM合成、分解と組織を担当しています。要因としては、血流から発せられる電気部品やその機能を組織のVICにECMの行為に常駐しています。加えて、機械的な力は、圧縮または引張応力がVICの5の動作に影響を与える、層状または振動せん断応力が生じる心周期中のリーフレットに作用します。
弁の構造が制御されている方法を理解するためには、最初のVICは、心周期の間に経験した刺激の多様なセットにどのように反応するかを理解する必要があります。in vitro試験は、心臓弁膜細胞の特性や能力について非常に有益でした。 in vitroでのこれらの細胞の応答は、しかし、常に正確にin vivoでの応答6を模倣しないことがあります。例えば、刺激にVICの応答は、ECおよびECM組成5の存在に依存します。また、刺激に対する弁膜細胞の応答は、リーフレット7に、その特定の場所に依存します。生化学的な刺激に加えて、弁の細胞の挙動は、Oに作用する機械的な力によって決定されますn個のバルブ8。バルブの各領域は、血行力学的応力の自身の特定のセットに供されます。現在のex vivoでのモデルは、機械的な力が弁膜構造5の重要な決定因子であることを示してきましたが、関連するメカニズムはまだ不明です。 in vivoモデルは、弁膜開発9,10の根底にある分子メカニズムへの洞察を提供してきたが、大人弁膜生物学への洞察はまだとらえどころのないです。
したがって、ex vivoでのフロー・モデルとは、心臓弁は、時間11の長期間の心に彼らの自然な位置で培養することができる開発されました。これは、弁がその天然のコンフィギュレーションに残りおよびVICは、VICの応答が可能な限り自然な刺激になって、 インビボのと同じ環境を経験するという利点を有します。また、心の中で彼らの自然な位置にある弁の文化はそれぞれを施す容易関連する血行動態ストレスに弁膜地域。このex vivoでのモデル、 すなわち、小型組織培養系（MTCS）において、弁は、心臓弁のリモデリングにおけるそれらの役割の研究を可能にする種々の生化学的及び血行力学的な刺激を受けることができます。
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Protocol
このプロトコルは、動物実験倫理委員会のLUMCのガイドラインに従っています。
楽器の調製、培養培地、及びMTCS
注：層流フード内のすべての準備を行います。 MTCS灌流チャンバー、気泡トラップとスタンドリーバーら 、2010 11に記載されています。
- 70％エタノールで鉗子とマイクロはさみを消毒します。無菌タイロード緩衝液（130mMの塩化ナトリウム、5.4のKCl、6.0 mMのヘペス、1.2 mMの硫酸マグネシウム、1.2 mMのKH 2 PO 4、20mMのグルコース、1.5mMの塩化カルシウム2・2H 2 Oで21G針で5 mlシリンジを準備pH値= 7.2）。無菌KCl溶液（100 mM）ので21G針で5 mlシリンジを準備します。
- 心あたりのメディアの65ミリリットルを準備し、10％ウシ胎児血清を補充したDMEM、抗生物質/抗真菌剤（A / A、ペニシリン100単位、ストレプトマイシン100μgの、およびアムホテリシンB / mlを0.25 UG）、インスリントランスフェリンセレン（ITS;を10μg/ mlのインスリン、5.5 / mlのトランスフェリン、6.7 ngの/ mlの亜セレン酸ナトリウム）、フィルター滅菌します。
- 70％エタノール、紙タオルで乾燥して噴霧することにより、灌流チャンバー及び気泡トラップを滅菌します。最初に灌流チャンバーなしに、しかし、MTCS（ 図1D）を組み立てます。スタンドに気泡トラップを配置します。簡単に負荷のポンプヘッドと蠕動ローラーポンプを使用してください。
- シリコンチューブを使用すると、リザーバ（50mlチューブ）、ポンプ、ポンプおよび気泡トラップ、気泡トラップとリザーバ（ 図1Dを参照）との間の接続を行います。媒体が気体透過性のシリコンチューブ（1メートル）とできるだけ短くインキュベーター外管を通してインキュベーターでガスでガス平衡に到達することを可能にする十分な長さインキュベーター内部の配管をしてください。
- 、70％エタノールで50mlのチューブを埋める（適切な循環を可能にするために、1ml /分の周りの流速）は、ポンプをオンにし、エタノールのCIRを聞かせてすべてのチューブを滅菌するために30分間culate。貯蔵器を空にし、システムからエタノールをポンピングすることにより、エタノールを除去します。
- 、滅菌蒸留水で50mlのチューブを埋めるポンプをオンにして、水が残っているエタノールを取り除くために30分間循環させて。貯蔵器を空にし、システムから水をポンプで水を除去します。
- メディアの45ミリリットルと50ミリリットルチューブを埋める、インキュベーター中にスタンドを置きます。ポンプ（1 ml /分の周りの流速）をオンにして、すべてのチューブを埋めるための媒体を循環させ、すべての気泡を除去し、培地は、少なくとも1時間インキュベーター内ガス組成に適応することができます。標準的な組織培養条件（5％CO 2、37℃）でインキュベーターを維持します。気泡がチューブ内に存在していないことを確認してください。
マウスの心臓の2の単離
- ヘパリン500単位でマウスを注入します。これは、凝固血液を防止し、Bの除去を可能にするであろう心の底からlood。 10分後、精密気化器を用いて、4％イソフルランで誘導チャンバ内でマウスを麻酔。マウスはつま先のピンチに応答しない時の麻酔で十分です。
- 解剖ボードにマウスを移し、同軸回路に接続されたフェイスマスクを用いて麻酔を維持します。 70％のアルコールでマウスの毛を消毒します。はさみは、腹腔を開いて使用すると、大静脈及びダイヤフラムを露出させます。
- 心臓を露出するために、最後から最初の肋骨に起動横切開を行い、マウスの頭の上に胸郭を反映しています。マウスはもう呼吸していないされているように麻酔を停止します。心臓の鼓動を観察します。
- （ダイアフラムを介して）胸腔内に腹部から下大静脈に無菌タイロード緩衝液を含む5 mlシリンジに取り付けた21G針を挿入します。血液が針の挿入から大静脈の尾側から出ることができることを確認してください。目を灌流電子タイロード緩衝液を静かにと大静脈への一定の圧力で心臓の一部が、その赤い色を失うまで。注意：心臓は、心臓からの血液の除去を可能鼓動のまま。
- 無菌のKCl溶液を含む5 mlシリンジに取り付けた21G針で針を交換してください。静かに心臓が鼓動を停止するまで大静脈にKCl溶液を灌流し、針を取り除きます。注意：KCl溶液を灌流針と冠動脈系の灌流を容易に挿入できるようになりますリラックスした拡張期に心を保持します。
- わずかに湾曲した鉗子を用いて心臓を持ち上げ、ハサミを使用して、周辺組織から自由に心を分析無傷と心臓に接続されている心臓の近位に動脈と静脈を残します。氷冷PBSを含む15mlチューブに心を移し抗生物質/抗真菌剤（A / A）を補いました。最大3時間、氷冷PBS中で心を保管してください。
3. Cannulatio灌流チャンバー内にマウスハーツのN
- 層流フード内のすべての手順を実行します。 10センチメートルシャーレに15mlチューブから分離された心を移し、PBSを追加し、A / Aを補いました。
- 解剖顕微鏡下では、すべての非心臓組織を除去するために、マイクロはさみとピンセットを使用していますが、上行大動脈を維持する心臓に腕頭動脈と肺静脈、2mmの近位との少なくとも分岐します。左心室の内腔（通常は2ミリメートル）へのアクセスを作成するために、心尖の先端をカット。解剖顕微鏡下流フードで灌流チャンバーを配置。
- シリコンチューブを使用して、挿入針に培地で5 mlシリンジを取り付けます。培地20mlで灌流チャンバーを記入し、灌流チャンバー（ 図1）で2平滑化した針との間で回転ステージに心を置きます。心臓は、目の前に配置されるように、回転ステージの高さを調整します針。
僧帽弁を培養するための4ライゲーション（図1参照）
- 縫合糸（絹7.0）で大動脈を連結。縫合糸で左心耳を結紮。左心房への肺静脈を通って（図1に1をNR）針を挿入し、左心房内のエントリに縫合糸の近位で連結します。これは、僧帽弁に損傷を与えるよう針が左心房にすぎないことを確認します。
- 左心室に直線運動で針（ 図1の nr.2）を挿入します。 50mlのチューブに灌流チャンバーからメディアを転送します。生体適合性の接着剤で心筋に針をシール。
- 接着剤が乾燥した後、慎重にnr.1針や漏れがあるかどうかを確認するための媒体で満たされた注射器を接続することにより、心に培地を注入します。針nr.2と最後に残った血液からの媒体出口は心の外に灌流されていることを確認します。
5.リー大動脈弁を培養するためのゲーション（図1を参照）
- 大動脈に注射針（ 図1の nr.1）を挿入し、縫合糸で連結します。これは大動脈弁を損傷するよう針が大動脈にすぎないことを確認します。左心室に直線運動で針（ 図1の nr.2）を挿入します。 50mlのチューブに灌流チャンバーからメディアを転送します。生体適合性の接着剤で心筋に針をシール。
- 接着剤が乾燥した後、慎重にnr.2針や漏れがあるかどうかを確認するための媒体で満たされた注射器を接続することにより、心に培地を注入します。針nr.1と最後に残った血液からの媒体出口は心の外に灌流されていることを確認します。
スタンドに6.灌流チャンバー
- メディア転送20mlで灌流チャンバーを埋めます。室にガスケットと蓋を置き、ワッシャー、ネジで締めます。
- incubaから組み立てMTCSを削除TOR。スタンドに灌流チャンバーを取り付けます。チューブを接続します（図1Dを参照してください ）。インキュベーター（5％CO 2、37℃）にスタンドを置きます。ポンプにチューブを接続します。 600μL/分の周りの流速でポンプの電源を入れます。
- 貯留および/または気泡トラップ媒体のレベルが入ってくるメディア滴の落下によって流れの存在の視覚化を可能にすることを確認します。培養後、心臓は、システムから除去固定し、組織学的検査のために処理されます。
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Representative Results
大動脈弁（ 図2）または僧帽弁11には、少なくとも 3日間培養することができます。 （大動脈弁と僧帽弁用拡張期位置のための収縮期位置を表す）開位置に培養することにより、弁膜細胞が生存したまま。 TUNEL陽性細胞（ 図2H、I）、または切断されたカスパーゼ3の発現の欠如によって決定されるように何らの細胞死が観察されない（図示していないリーバーら 、2010 11）。 （としてマッソンの三重染色により可視化）コラーゲン分布は、1％の血清（ 図2D、E）で培養し、ネイティブの状態に似ています。バルブは、培養条件の変化に応答します。厚いリーフレット（ 図2C）において10％の結果を血清の量を増加させます。また、明確なコラーゲンのない領域は大動脈壁への取り付け近いリーフレットの心室側で観察される（ 図2Fの矢印
図1.ミニチュア組織培養系。心の（A）灌流チャンバーで心が回転ステージ上に敷設され、nr.1とnr.2で示さ鈍化針と連結した。（B）灌流チャンバーはスタンドに装着されている。（C）模式図僧帽弁（左）または大動脈弁（右）。（D）大動脈弁培養のためのex vivoでのフローシステムのセットアップの概略図を培養するとき。この図は、部分的に以前の研究11から変更されている。 拡大版のOを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図F。
2ヶ月齢のマウスから培養したバルブの図2.組織学的分析。 （AC）heamatoxylin及びエオシン（H＆E）（DF）、マッソントリクローム染色およびGI）非培養大動脈弁のTUNEL染色（A、D、G）、1％の血清（B、Eの存在下で培養した大動脈弁、H）またはMTCSで3日間10％血清（C、F、I）。 10％血清を用いて培養し、弁が厚い（C）であり、変更されたECMパターン（F）を持っているのに対し、1％の血清を用いて培養バルブは、非培養バルブのように表示されます。いいえアポトーシスは、バルブ（GI）で観察されません。スケールバーは100μmのです。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
マウス心臓弁の培養における重要なステップは、流れの適切な向きを確保するために、マウスから心臓の切除および弁に対して垂直に針の生存率および連結を確実にするためにできるだけ短く灌流チャンバー内ライゲーションの間の時間を作る挙げ。さらに、メディアなし灌流チャンバー内ライゲーション後の流れをチェックする適切な挿入や針の連結を確実にします。これは、無菌培養を維持し、潜在的な流れを妨げる心に閉じ込められてしまう可能性がチューブに気泡を防ぐために重要です。
心臓の灌流のために使用される媒体の全体積は、（心臓を通して灌流される媒体は、灌流チャンバー内の培地20mlに接触しないことに注意）45 mlです。例は、少量のウイルスを添加するために好ましいことができます。一時的貯蔵器（および管の一部）回路Lから除去することができますバルブの感染を可能にするシステム5-7ミリリットルeaving。
心臓の鼓動が存在しないことは、限界と考えられます。しかしながら、リーフレットに働くすべての刺激を一定に保つことが可能な実験条件を作成することができます。これは、1つの単一の変更の影響を研究するユニークな機会を提供します。移動バルブが必要とされる場合には、拍動流を生成することができます。
弁生物学およびバルブで、分子細胞および機械的刺激の役割を研究するために、修正が容易に培養系に加えることができます。分子修飾は、増殖因子、化学化合物および灌流媒体に遺伝子送達11を媒介するウイルスの添加によって達成することができます。一つまたは複数の細胞型は、弁膜生物またはバルブへの貢献に対するこれらの細胞の影響を調べるために灌流培地に投与することができます。酸化ストレスまたは低酸素症の影響はすることができます培養培地中の酸素の圧力を変化させることによって検討しました。バルブ上の血行力学的応力は、流速、流れの方向、流量及び拍動粘度を変えることによって変えることができます。全体的な形態は、H＆E、組織化学および免疫蛍光染色により（ 図2B、C）を調べることができます。さらに、組織およびECMの組成、表現型は、増殖、および弁膜細胞の生存およびシグナル伝達経路の活性化は、これらの条件を変化させることの効果についての洞察を提供します。遺伝的に改変されたマウスは、特定のシグナル伝達経路の機能の喪失又は獲得と内皮 - 間葉転換またはマウスの存在を示す（のTie2-のCreとflox化レポーターマウスを用いた）内皮レポーターマウスを用いて、内皮細胞を追跡するために使用することができます。全体的に、ここで紹介するシステムは、心臓弁膜生物学を研究するための便利なツールです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
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