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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

Nous décrivons une méthode pour la génération des mastocytes dérivés in vitro, leur greffe en souris mastocytaires-déficientes, et l’analyse du phénotype, des nombres et de la distribution des mastocytes engrafted à différents emplacements anatomiques. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les fonctions des mastocytes in vivo.

Abstract

Les mastocytes (MC) sont des cellules hématopoïétiques qui résident dans divers tissus et sont particulièrement abondantes aux sites exposés à l’environnement externe, tels que la peau, les voies respiratoires et le tractus gastro-intestinal. Mieux connus pour leur rôle néfaste dans les réactions allergiques IgE-dépendantes, les MCs ont également émergé en tant qu’acteurs importants dans la défense de l’hôte contre le venin et envahissant les bactéries et les parasites. Le phénotype et la fonction de MC peuvent être influencés par des facteurs microenvironnementaux qui peuvent différer selon l’emplacement anatomique et/ou basé sur le type ou le stade de développement des réponses immunitaires. Pour cette raison, nous et d’autres avons favorisé les approches in vivo sur les méthodes in vitro pour mieux comprendre les fonctions mc. Ici, nous décrivons des méthodes pour la génération de MCs cultivés moelle-dérivés de souris (BMCMCs), leur transfert adoptif dans les souris génétiquement MC-déficientes, et l’analyse du nombre et de la distribution de MCs adoptivement transférés à différents emplacements anatomiques. Cette méthode, appelée l’approche« mastocyte knock-in », a été largement utilisée au cours des 30 dernières années pour évaluer les fonctions des MCcs et des produits dérivés de MC in vivo. Nous discutons des avantages et des limites de cette méthode, à la lumière des approches alternatives qui ont été développées ces dernières années.

Introduction

Les mastocytes (MC) sont des cellules hématopoïétiques qui proviennent de progéniteurs pluripotents de moelle osseuse1-3. Après l’évacuation de la moelle osseuse, les progéniteurs des MC migrent dans divers tissus où ils se développent en MC matures sous l’influence des facteurs de croissance locaux1-3. Les MC résidants dans les tissus sont stratégiquement situés aux interfaces hôte-environnement, telles que la peau, les voies respiratoires et le tractus gastro-intestinal, où ils se comportent comme une première ligne de défense contre les insultes externes3-6. Les MC sont souvent sous-classés en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques « de base » et de leurs emplacements anatomiques. Chez la souris, deux types de MC ont été décrits: les MC de type « tissu conjonctif » (CTMCs) et les MCs muqueux (MMCs)1-3,7,8. Les CTMCs sont souvent situés autour des veinules et près des fibres nerveuses, et résident dans les cavités sérales, tandis que les MMC occupent des emplacements intraépithéliaux dans l’intestin et la muqueuse respiratoire1-3.

De nombreuses méthodologies ont été appliquées pour étudier les fonctions biologiques des MC9-13. De nombreux groupes se sont concentrés sur des approches in vitro utilisant soit des lignées cellulaires (telles que les lignées MC humaines HMC114 ou LAD215,16),des MC dérivées in vitro (telles que les MC17dérivées du sang périphérique humain, ou des MC cultivés dérivés de la moelle osseuse de souris [BMCMC]18,des MC cultivés dérivés de la peau fœtale [FSCMC]19 et des MC dérivés de cellules péritonéales [PCMC]20) ou des MC isolés ex vivo provenant de différents sites anatomiques. Tous ces modèles sont largement utilisés pour étudier les détails moléculaires de la biologie de MC, tels que les voies de signalisation impliquées dans l’activation de MC. Cependant, un aspect important de la biologie des MC est que leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles(par exemple,la teneur en protéase des granules cytoplasmiques ou la réponse à différents stimuli) peuvent être modulées par localisation anatomique et microenvironnement2,7. Étant donné que le mélange exact de tels facteurs rencontrés in vivo peut être difficile à reproduire in vitro,nous privilégions l’utilisation d’approches in vivo pour obtenir des informations sur les fonctions des MC9.

Il existe plusieurs souches de souris présentant une déficience génétique en MC, telles que les souris WBB6F1-Kit W/W-v ou C57BL/6-Kit W-sh/W-sh largement utilisées. Ces souris manquent d’expression et/ou d’activité de KIT (CD117), le récepteur du principal facteur de cellules souches de facteur de croissance MC (SCF)21,22. En conséquence, ces souris ont un déficit profond en MC mais ont également des anomalies phénotypiques supplémentaires liées à leurs mutations c-kit (chez les souris WBB6F1-Kit W/W-v) ou aux effets de la grande inversion chromosomique qui entraîne une réduction de l’expression duc- kit (chez les souris C57BL/6- Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Plus récemment, plusieurs souches de souris présentant un déficit constitutif indépendant de MC enc- kitont été signalées24-26. Toutes ces souris et quelques nouveaux types supplémentaires de souris inductibles mc-déficientes ont été récemment examinés en détail9,10,13.

Ici, nous décrivons des méthodes pour la génération de MCs cultivés moelle-dérivés de souris (BMCMCs), leur transfert adoptif dans les souris MC-déficientes, et l’analyse des nombres et de la distribution de MCs adoptivement transférés à différents emplacements anatomiques. Cette méthode dite de « mastocyte knock-in » peut être utilisée pour évaluer les fonctions des MC et des produits dérivés de MC in vivo. Nous discutons des avantages et des limites de cette méthode, à la lumière des approches alternatives qui ont été développées ces dernières années.

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Protocol

Tous les soins et expérimentations sur les animaux ont été menés conformément aux directives des National Institutes of Health et avec l’approbation spécifique du Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université Stanford.

1. Génération et caractérisation de mastocytes cultivés dérivés de la moelle osseuse (BMCMC).

Remarque : Les BMCMC donneurs doivent être générés à partir de cellules de moelle osseuse du même fond génétique que les souris mc-déficientes réceptrices. Les BMCMC de donneurs d’origine mâle ne conviennent pas à la greffe de souris femelles. les BMCMC donneurs d’origine féminine se grefferont avec succès dans les receveurs masculins et féminins.

  1. Extraction de la moelle osseuse.
    1. Verser une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une plaque de culture de 6 puits (1 puits par souris) et la placer sur de la glace.
    2. Trempez les instruments de dissection dans de l’éthanol à 70% pour la stérilisation.
    3. Euthanasier les souris donneuses par inhalation de dioxyde de carbone (CO2)suivie d’une luxation cervicale, puis vaporiser de l’éthanol à 70% sur les sites de manipulation.
    4. Utilisez des instruments de dissection stériles pour extraire les os du fémur, du tibia et du péroné sans couper les épiphyses osseuses.
    5. Tout en fixant les os avec une pince, grattez tout le tissu des os (et jetez le péroné) à l’aide de ciseaux stériles (ou de lames de scalpel). Placer les os dans le PBS sur de la glace jusqu’à ce que tous les os soient recueillis.
    6. Effectuez toutes les étapes restantes dans la hotte de culture de tissus stériles. À l’aide d’instruments stériles, fixez les os avec une pince et coupez les deux épiphyses pour exposer la cavité médullaire.
    7. À l’aide de seringues de 3 ml et d’aiguilles de 30 G, et d’un milieu de rinçage à froid (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] complété par 10 % de sérum de veau fœtal [FCS, inactivé par la chaleur], de L-glutamine à 2 mM, de solution antibiotique-antimycostique à 1 %, de 50 μM de B-mercaptoéthanol), rincer la moelle osseuse rouge dans une boîte de Petri.
    8. Utilisez la même seringue pour dissocier les grappes de cellules de moelle osseuse rincées par aspiration douce répétée et éjection.
    9. Regrouper la moelle osseuse fémorale et tibiale de chaque souris dans un tube de centrifugation de 15 ml. Remplissez le tube d’un milieu de rinçage à froid pour laver les cellules de la moelle osseuse et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
  2. Culture BMCMC.
    1. Enlever le surnageant et récupérer les cellules granulées de la moelle osseuse dans 10 ml de milieu de culture (DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal [FCS, inactivé par la chaleur], 2 mM de L-glutamine, 1 % de solution antibiotique-antimycotique, 50 μM de B-mercaptoéthanol et 20 % de milieu cellulaire WEHI-3 [comme source d’IL-3; utilisez alternativement l’IL-3 recombinant de souris à 10 ng/ml]).
    2. Placer les cellules dans une fiole de culture tissulaire de taille appropriée(p. ex.T25 pour 1 souris, T75 pour 2 souris, etc.).
    3. 1 à 2 jours après le placage des cellules, transférer le milieu et les cellules de suspension (laissant les débris et les cellules adhérentes coller au fond du ballon) dans une nouvelle fiole et ajouter du milieu de culture frais (10 ml/souris).
    4. Au cours des semaines suivantes, les cellules d’alimentation tous les 3-4 jours (ajouter 10 ml de milieu de culture par souris). Maintenir la densité cellulaire entre 2,5 x 105-1 x 106 cellules/ml. Transférer les cellules non adhérentes dans une nouvelle fiole une fois par semaine jusqu’à ce qu’aucune cellule adhérente ne soit présente dans la fiole de culture. Tester la maturité des cellules (voir ci-dessous) avant utilisation pour des essais in vitro ou une greffe chez des souris déficientes en MC.
      REMARQUE: La différenciation complète des BMCMC prendra 4-6 semaines.
  3. Évaluation de la maturité de la BMCMC.
    1. Utilisation de la cytométrie de flux.
      1. Cellules de lavage (5 x 104-5 x 105 cellules/condition) avec tampon FACS glacé (PBS, 0,5% FCS) dans un tube de fond rond en polystyrène de 5 ml. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Surnageant aspiré.
      2. Diluer les anticorps monoclonaux anti-souris CD16/32 (clone 93 ou 2.4G2) 1:200 (2,5 μg/ml) dans le tampon FACS. Ajouter 10 μl à chaque pastille et la remise en suspension par un bref vortex. Incuber 5 min sur la glace pour bloquer la liaison Fc.
        Remarque : Protégez les échantillons de la lumière directe pour toutes les étapes restantes.
      3. Diluer la phycoérythrine (PE) conjuguée anti-souris Fc εRI α (clone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) et isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjuguée contre la souris KIT (CD117; clone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) (« solution de coloration »), ou les anticorps de contrôle d’isotype marqués respectifs dans le tampon FACS (« solution de contrôle d’isotype »).
      4. Diviser la moitié des cellules bloquées de l’étape 1.3.1.2) dans un tube de fond rond supplémentaire en polystyrène et ajouter 20 μl de « solution de coloration » dans un tube et 20 μl de « solution de contrôle d’isotype » dans l’autre tube. Incuber 30 min sur la glace.
      5. Ajouter 3 ml de tampon FACS glacé et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et le ressusciter dans un tampon FACS de 300 μl contenant 1 μg/ml d’iodure de propidium (IP, pour l’identification des cellules mortes). Procéder à l’analyse de cytométrie de flux (voir figure 2A).
    2. Utilisation de coloration bleue à la toluidine.
      1. Laver 1 x 105 cellules une fois avec du PBS par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à température ambiante, puis aspirer et ressusciter les cellules dans 200 μl de PBS.
      2. Transférer la suspension cellulaire dans un cytofunnel préparé attaché à une lame de microscope et procéder à la cyto-centrifugation à l’aide d’une cytocentrifugation (40 x g pendant 5 min).
      3. Lames sèches à l’air pendant 10 min et dessinez un cercle de cire autour des cellules à l’aide d’un stylo PAP. Ajouter 0,1% de solution bleue de toluidine pour couvrir les cellules. Incuber pendant 1 min. Lavez les lames dans l’eau courante du robinet pendant 1 min, puis les toboggans secs à l’air pendant 10 min.
      4. Cellules de lamelle de couverture utilisant un support de montage. Procéder à l’analyse au microscope optique (voir figure 2B)

2. Greffe de souris mastocytaires déficientes avec BMCMC.

  1. Greffe d’oreille par injection intradermique (i.d.).
    REMARQUE: Pour le transfert adoptif de BMCMC dans les pennes d’oreille de souris déficientes en MC, nous vous recommandons d’effectuer deux injections de 1 x10 6 cellules chacune (pour un total de 2 x 106 cellules) par penne d’oreille. L’engraftment intradermique de BMCMC dans les pennes d’oreille de souris mc-déficientes a été employé par de nombreux investigateurs dans plusieurs modèles, y compris des modèles d’anaphylaxie cutanée passive (PCA)24,27, défense de l’hôte contre des venins28, et des réactions d’hypersensibilité chronique (CHS)29,30.
    1. Compter et ressusciter les cellules à 4 x 107 BMCMC/ml (1 x 106 BMCMC/25 μl) dans le DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 30 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.
    2. Anesthésier des souris MC-déficientes de 4 à 6 semaines à l’aide d’isoflurane (2,5 % v/v). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par pincement des pieds, ajustez l’isoflurane si cela est indiqué et continuez à surveiller la respiration et la réponse au pincement des pieds tout au long de la procédure. Appliquez une pommade ophtalmique avec un Q-tip pour prévenir la sécheresse des yeux.
    3. Avec l’index, créez une pression verticale sur la face dorsale du penne de l’oreille pour exposer et étirer la face ventrale.
    4. Effectuer deux injections de 25 μl i.d. de solution BMCMC dans deux sites différents de la face ventrale du penne de l’oreille, la première injection au milieu de l’oreille et la deuxième injection vers l’extrémité du penne de l’oreille. Attendez 4-6 semaines après la greffe d’i.d. avant d’effectuer des expériences in vivo.
      Remarque: Dans notre expérience, à ce moment-là, le nombre de MCs/mm2 de derme dans la partie centrale du penne de l’oreille est généralement similaire à celui de l’emplacement correspondant chez les souris de type sauvage, tandis que le nombre de MCs/mm2 dans la périphérie des pennes de l’oreille sont généralement sensiblement inférieurs à ceux des souris de type sauvage correspondantes 27,28. Ceci devrait être gardé à l’esprit lors de la conception des expériences avec de telles souris MC-greffées(par exemple,des agents avec des effets possibles sur la fonction mc devraient être injectés dans la partie centrale des pennes d’oreille, et l’analyse des effets de tels traitements devrait également se concentrer sur cette zone).
  2. Engraftment péritonéal de cavité par l’injection intrapéritonéale (i.p.).
    REMARQUE: Le transfert adoptif de BMCMC dans la cavité péritonéale des souris déficientes en MC nécessitera une injection de 2 x 106 cellules par souris. De telles injections i.p. de BMCMC chez des souris déficientes en MC ont été utilisées par de nombreux groupes pour étudier les rôles des MC dans divers modèles, y compris des modèles de défense de l’hôte contre les venins31 ou la septicémie bactérienne32,33.
    1. Comptez le nombre approprié de cellules et ressuscitez à 1 x 107 BMCMC/ml (2 x 106 BMCMC/200 μl) dans du DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 25 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.
    2. Effectuer 1 injection de solution bmcmc de 200 μl dans la cavité péritonéale de souris déficientes en MC de 4 à 6 semaines. Attendez 4-6 semaines après la greffe d’i.p. avant d’effectuer des expériences in vivo.
  3. Greffe par injection intraveineuse (i.v.).
    REMARQUE: Le transfert adoptif de BMCMC par injection i.v. dans des souris déficientes en MC nécessitera une injection de 5 x 106 cellules par souris. Des injections intraveineuses (i.v.) de BMCMC chez des souris déficientes en MC ont été utilisées par de nombreux groupes pour étudier les rôles des MC dans divers modèles de maladies, y compris les modèles d’infection de la vessie34,d’asthme35,de fibrose pulmonaire36et d’arthrite médiée par les anticorps37.
    1. Comptez le nombre approprié de cellules et ressuscitez à 2,5 x 107 BMCMC/ml (5 x 106 BMCMC/200 μl) dans le DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 30 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.
    2. Anesthésier des souris MC-déficientes de 4 à 6 semaines à l’aide d’isoflurane (2,5 % v/v). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par pincement des pieds, ajustez l’isoflurane si cela est indiqué et continuez à surveiller la respiration et la réponse au pincement des pieds tout au long de la procédure. Appliquez une pommade ophtalmique avec un Q-tip pour prévenir la sécheresse des yeux.
    3. Effectuer une injection de 200 μl de solution BMCMC dans la veine caudale (ou, alternativement, la veine rétro-orbitale) d’une souris déficiente en MC. Attendez 12 semaines après la greffe d’i.v. avant d’effectuer des expériences in vivo.

3. Analyse des souris déficientes en mastocytes greffées.

  1. Analyse d’engraftment d’oreille.
    1. À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale.
    2. Isoler les pennes de l’oreille et fixer dans 10 % (vol/vol) de forcine tamponnée pendant la nuit à 4 °C. Incorporez des pennes d’oreille fixes dans de la paraffine, coupez des sections de pennes d’oreille de 4 μm et montez sur des lames de verre.
    3. Colorer les lames avec une solution bleue de toluidine à 0,1% pendant 1 min à température ambiante. Lavez les lames à l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air pendant 10 min à température ambiante.
    4. Lames de couverture à l’aide d’un support de montage, puis comptez le nombre de MC greffés par sections de pennes à l’aide d’un microscope optique. Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage et la distribution des MC dans la peau de l’oreille des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.
  2. Analyse péritonéale d’engraftment de cavité.
    1. Évaluation du nombre de mastocytes dans la cavité péritonéale.
      1. À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale. Retirez soigneusement la peau ventrale des souris sans casser la cavité péritonéale.
      2. Injecter 5 ml de PBS froid ou à température ambiante dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 5 ml équipée d’une aiguille de 25 G. Utilisez le PBS froid pour réduire le risque d’activation des cellules péritonéales (ceci est très important lors de l’évaluation de la dégnulation péritonéale de MC ou des niveaux de certains produits dérivés de MC dans le liquide de lavage péritonéal). Effectuez un massage de l’abdomen pendant 20 secondes pour récolter les cellules péritonéales.
      3. Aspirer lentement le lavage péritonéal à l’aide d’une seringue de 5 ml équipée d’une aiguille de 22 G. Enregistrer le volume de lavage aspiré (attendez-vous à récupérer jusqu’à 80% du volume injecté).
      4. Transférer le liquide de lavage péritonéal dans un tube de fond rond en polystyrène de 5 ml et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Surnageant aspiré. Récupérer la pastille dans du PBS froid de 400 μl.
      5. Comptez le nombre total de cellules péritonéales à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre. Utiliser la moitié de la suspension cellulaire pour une analyse cytométrique en flux (comme décrit à l’étape 1.3.1), afin d’évaluer le pourcentage et l’expression marqueur des MC greffés dans la cavité péritonéale. Multipliez le nombre total de cellules péritonéales par le pourcentage de MC pour obtenir le nombre absolu de MC péritonéaux.
      6. Effectuer une cytocentrifugation avec les cellules restantes comme décrit à l’étape 1.3.2.2. Sécher à l’air les lames pendant 10 min à température ambiante et dessiner un cercle de cire autour des cellules à l’aide d’un stylo PAP.
      7. Couvrir les cellules avec une solution de coloration May-Grünwald non diluée pendant 5 min, suivie d’un lavage en PBS pendant 5 min, les deux à température ambiante. Couvrir les cellules avec la tache giemsa diluée 1:20 avec de l’eau désionisée et incuber 20 min à température ambiante. Lavez les lames 2 fois dans l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air.
      8. Cellules de lamelle à l’aide d’un support de montage, et calculer le pourcentage de MC greffés à l’aide d’un microscope optique (en comptant au moins 400 cellules totales). Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage de MC dans le lavage péritonéal des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.
    2. Évaluation des mastocytes dans les fenêtres mésentériques.
      1. Suite au lavage péritonéal décrit à l’étape 3.2.1, ouvrir la membrane péritonéale pour exposer le tractus intestinal des souris. Disposez 4 à 5 fenêtres mésentériques par souris sur une diapositive.
      2. Fixer les lames pendant 1 heure dans une solution de carnoy (3:2:1 vol/vol/vol d’éthanol, de chloroforme et d’acide acétique glacial) à température ambiante. Sécher à l’air les lames et enlever l’intestin (les fenêtres mésentériques fixes resteront attachées aux lames).
      3. Colorer les préparations pendant 20 min à température ambiante avec la solution de coloration Csaba (bleu Alcian/Safranin O).
        1. Pour faire 500 ml de coloration Csaba, préparer 500 ml de tampon acétate en mélangeant 100 ml de solution d’acétate de sodium 1 M avec 120 ml de HCl 1 M. Porter jusqu’à 500 ml avec de l’eau désionisée et ajuster le pH à 1,42. Ensuite, dissoudre 90 mg de Safranin [identifie les « MC matures » en rouge], 1,8 g de bleu d’Alcian [identifie les « MC immatures » en bleu] et 2,4 g de sulfate d’ammonium ferriqueNH4Fe(SO(SO)2dans 500 ml de tampon acétate.
      4. Lames de couverture à l’aide d’un support de montage, puis comptez le nombre de MC greffés par fenêtre mésentérique à l’aide d’un microscope optique. Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage et la distribution des MC dans les fenêtres mésentériques des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.
  3. Analyse de l’engraftment I.v.
    1. À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale, et prélever les tissus d’intérêt(par exemple, poumon, peau ou rate) et fixer pendant la nuit dans 10 % (vol/vol) de fortérine tamponnée à 4 °C.
    2. Incorporez des tissus fixes dans de la paraffine, coupez des sections de 4 μm et montez sur des lames de verre. Colorer les lames avec une solution bleue de toluidine à 0,1% pendant 1 min à température ambiante. Lavez les lames à l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air pendant 10 min.
    3. Lames de couverture utilisant le support de montage et évaluer le nombre et la distribution de MCs greffés par sections de tissu utilisant un microscope de lumière.

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Representative Results

Un aperçu de l’approche del’enramationdes mastocytes est montré à la figure 1,et comprend la génération de BMCMC, le nombre de cellules qui devraient être greffées i.p., i.d. ou i.v. dans des souris déficientes en MC (le nombre peut être varié si indiqué en fonction de la conception expérimentale) et l’intervalle entre la greffe et l’expérience en fonction du site d’injection (cet intervalle peut également varier, si indiqué; par exemple,le contenu des médiateurs stockés dans les granules cytoplasmiques MC augmente régulièrement avec le temps38). La figure 2 montre des analyses de cytométrie en flux représentatif et une coloration au bleu de toluidine des BMCMC après 1, 15 et 45 jours de culture en milieu DMEM contenant dans 20% de milieu wehi-3 conditionné par les cellules comme source d’IL-3. Notez que les BMCMC cultivés pendant 45 jours sont purs à 95%, contiennent un nombre élevé de granules cytoplasmiques et peuvent être utilisés pour des expériences de greffe, tandis que les cellules cultivées pendant 15 jours ne conviennent pas à la greffe. La figure 3 montre une greffe réussie représentative dans les pennes de l’oreille 4 semaines après la greffe d’i.d.(figure 3A),dans les fenêtres mésentériques(figure 3B)et la cavité péritonéale(figure 3C)6 semaines après la greffe d’i.p., et dans le poumon(figure 3D)12 semaines après la greffe d’i.v.

Figure 1
Figure 1: Modèlemurin deknock-inde mastocytes pour les analyses des fonctions MC in vivo. Les MC cultivés de type sauvage ou mutant dérivé de la moelle osseuse (BMCMC) sont générés en cultivant des cellules de moelle osseuse pendant au moins 4 à 6 semaines dans un milieu à 20 % WEHI-3 conditionné par les cellules comme source d’IL-3 (ou alternativement dans un milieu contenant 10 ng/ml d’IL-3 recombinant de souris). Ces BMCMC peuvent ensuite être greffés en souris déficientes en MC pour créer des souris dites «mastocytaires knock-in». Bmcmccs peut être injecté par différentes voies (intraveineuse [i.v.], intrapéritonéal [i.p.] ou intradermique [i.d.]) pour la reconstitution locale (i.d., i.p.) ou systémique (i.v.) de diverses populations de MC. La ou les fonctions mc dans diverses réponses biologiques peuvent ensuite être analysées en comparant les réponses chez les souris de type sauvage, les souris déficientes en MC et les sourisknock-in de mastocytes. La contribution(s) de produits MC spécifiques peut être analysée en comparant les réponses des sourisknock-inde mastocytes greffées avec des BMCMC de type sauvage ou des BMCMC dérivés de souris qui n’ont pas, ou expriment des formes génétiquement modifiées de tels produits. (Il s’agit d’une version modifiée de la figure 1 de la réf.12).

Figure 2
Figure 2 : Évaluation de la pureté des préparations bmcmc par cytométrie en flux et microscopie. (A) Analyses représentatives de cytométrie en flux de FcεRIα et de KIT (CD117) expression sur la surface de 1 jour (panneau gauche), 15 jours (panneau central) et 45 jours (panneau droit) anciens BMCMC. Les cellules mortes positives à l’iodure de propidium (PI) ont été exclues de l’analyse (non montré). Les chiffres indiquent le pourcentage de FcεRIα+KIT+ BMCMC gated dans le carré bleu. (B) Des images représentatives de BMCMC teintées de bleu toluidine, le panneau inférieur est un grossissement des régions du panneau supérieur définies en pointillés noirs. Barres = 10 μm.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de l’efficacité de la greffe de MC à divers sites anatomiques. (A) Images représentatives de sections de pennes d’oreille de 4 μm colorées de bleu de toluidine. (B) Des images représentatives de fenêtres mésentériques tachées de safranin/bleu d’Acian (tache « Csaba »). (C) Images représentatives de cellules présentes dans les fluides de lavage péritonéaux et colorées avec May-Grünwald Giemsa (MGG). (D) Images représentatives de sections pulmonaires de 4 μm colorées avec du bleu de toluidine. Barres = 50 μm(A, B et D)ou 20 μm(C). Les images proviennent de souris de type sauvage C57BL/6 (panneau supérieur), de souris KitW-sh/W-sh déficientes en MC (panneau central) et de souris déficientes en MC greffées avec des BMCMC de type sauvage : BMCMC KitW-sh/W-sh (panneau inférieur). Les MC sont indiqués par des flèches.

souris Contextes disponibles Numéros MC
(état d’équilibre)		 Autres phénotypes (examinés dans9,10,13) Greffes signalées avec bmcmccs
KitW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1
(Laboratoires Jackson –
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Absence de MCs de tissu conjonctif et muqueux Anémie, réduction du nombre de basophiles et de neutrophiles, déficiences en mélanocytes et cellules interstitielles de Cajal, stérile, etc. i.v.35,37; i.p.31,62; i.d.28,29; i.c.50,51; i.a.49; fp.i. 63 ans
KitW-sh/W-sh C57BL/6
(Laboratoires Jackson –
B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) L’analyse du polymorphisme mononucléotidique effectuée dans les laboratoires Jackson montre que ces souris ne sont que ~ 87% C57BL / 6-fond génétique.		 Absence de MCs de tissu conjonctif et muqueux Augmentation modérée du nombre de basophiles et de neutrophiles, augmentation du nombre de cellules suppressrices dérivées de myéloïdes64, déficiences en mélanocytes et cellules interstitielles de Cajal i.v.23,34-36; i.p.31,62; i.d.28,29; i.a.49
C57BL/6J62
(Laboratoires Jackson –
B6. Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) Ces souris ont été rétrocroisée >11 fois sur le fond C57BL/6J.
BALB/c65
(C.B6-KitW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)		 Réductions marquées du péritoine (98 %) et la peau (89-96,5%) MC, MC muqueuses peu susceptibles d’être épuisées Présence probable de MC muqueuses; des souris reporters révèlent une délétion médiée par cre de transgènes YFP « floxed » dans les cellules NK de la rate ~ 30%66 aucun
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3(icre)Hrr)		 Absence de MCs de tissu conjonctif et muqueux Cpa3 exprimé dans d’autres types de cellules; réduction du nombre de basophiles i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 Absence de MCs de tissu conjonctif et muqueux Cpa3 exprimé dans d’autres types de cellules; augmentation des neutrophiles de rate &anémie légère;
réduction du nombre de basophiles		 i.d.24;
i.a.49
i.v. (nos données inédites)

Tableau 1 : Souches de souris présentant des déficiences constitutives en MC. Plusieurs souches de souris avec c-kit-dependent ou c-kit-independent constitutive MCficiency sont disponibles. En principe, toutes ces souches peuvent être utilisées pour générer des sourisknock-inde mastocytes (bien que, à notre connaissance, cela n’ait pas encore été rapporté pour Mcpt5-Cre; Souris R-DTA). Cependant, chacune de ces souches présente d’autres anomalies phénotypiques et limitations qui doivent être gardées à l’esprit lors de l’interprétation des résultats obtenus avec ces souris. Quelques exemples de greffe réussie de MC peuvent être trouvés dans les références. (Il s’agit d’une version modifiée et mise à jour du tableau 1 de la réf.9).

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Discussion

Près de 30 ans après sa description initiale38, l’approche «mastocyte knock-in» continue de fournir des informations précieuses sur ce que les MC peuvent faire ou ne peuvent pas faire in vivo. Les fonctions de MCs ont été longtemps pensées pour être limitées à leur rôle dans l’allergie. Les données générées à l’aide de l’approche «mastocyte knock-in» ont changé ce point de vue, en fournissant des preuves que les MC peuvent, entre autres fonctions, jouer des rôles critiques dans la défense de l’hôte contre certains agents pathogènes4,39 ou venins28,31, ou peut même supprimer certaines réponses immunitaires29,34,40.

Dans notre description de protocole, nous avons décidé de nous concentrer sur la génération et l’engraftment de MCs cultivés moelle-dérivés (BMCMCs), parce qu’un grand nombre de ces cellules peuvent être générées in vitro à partir de la moelle de souris sauvages de type sauvage ou mutant. Cependant, les MC peuvent également être cultivés directement à partir de cellules souches embryonnaires (MCS cultivés dérivés de cellules souches embryonnaires [ESCMC])41 et, lorsqu’elles sont génétiquement compatibles, ces cellules peuvent également être utilisées pour la greffe dans des souris déficientes en MC. Cette approche alternative est particulièrement intéressante pour étudier le rôle d’une protéine dont la carence induit la létalité embryonnaire chez la souris, et donc pour laquelle les BMCMC déficients pour cette protéine ne peuvent pas être générés. Les BMCMC et les ESCMC peuvent également être transduites in vitro avec des lentivirus codant pour des gènes d’intérêt ou shRNA pour faire taire les gènes d’intérêt, avant greffe de ces cellules en souris déficientes en MC31,33.

Nous utilisons habituellement 20% de milieu WEHI-3-conditionné comme source d’IL-3 pour la culture des BMCMC. Cependant, l’IL-3 recombinant (10 ng/ml, comme décrit à l’étape 1.2.1) peut également être utilisé, et l’ajout de facteur de cellules souches recombinantes (SCF) au milieu de culture peut augmenter considérablement le nombre de BMCMC générés42,43. Selon l’étude, 10 à 100 ng/ml de SCF recombinant ont été utilisés, en plus de l’IL-3, pour générer des BMCMC36,44,45. Il faut garder à l’esprit que les préparations murines recombinantes de SCF disponibles dans le commerce auprès de différents fournisseurs peuvent différer dans leur puissance en influençant le développement des BMCMC. Il est également important de reconnaître que les détails de l’approche utilisée pour générer des BMCMC (comme si l’on ajoute le SCF recombinant au milieu contenant de l’IL-3, la durée de la période de culture, etc.)peuvent influencer le phénotype et la fonction de ces cellules. Par exemple, il a été rapporté que les BMCMC exposés de manière chronique au SCF ont augmenté les niveaux d’histamine et de certaines protéases44,46, mais présentent une atténuation marquée de la dégranulation médiée par fcεRI et de la production de cytokines in vitro45. Enfin, en plus de l’IL-3, le milieu WEHI-3-conditionné contient de nombreuses molécules biologiquement actives qui peuvent affecter les fonctions MC. Les BMCMC obtenus avec un milieu conditionné WEHI-3 sont donc susceptibles de différer des BMCMC obtenus avec de l’IL-3 recombinant (ou avec de l’IL-3 recombinant plus SCF). Il y a eu peu d’études de si ou pour combien de temps de telles différences dans les phénotypes de BMCMC générés dans différents types de milieu de culture sont conservées après l’engraftment des cellules dans différents sites anatomiques in vivo,et des études supplémentaires de ce type peuvent être d’intérêt. Cependant, quelles que soient les conditions de culture choisies, la même recette de milieu de culture doit être utilisée pour générer tous les BMCMC à utiliser pour la greffe dans des expériences à partir desquelles les résultats seront regroupés pour analyse. De plus, les MC doivent être cultivés pendant au moins 4 à 6 semaines avant leur greffe chez des souris déficientes en MC, afin d’atteindre une pureté de 95 à 98%(Figure 2). Il s’agit de réduire la possibilité que la présence, dans les « populations BMCMC », de cellules hématopoïétiques autres que celles engagées dans la lignée des mastocytes (qui sont présentes dans les cultures à des intervalles précoces après la mise en place des cellules de moelle osseuse in vitro)puisse entraîner l’apparition de cellules dérivées du donneur en plus des CM chez les sourisknock-in de mastocytes.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour engrafting les souris MC-déficientes avec le type sauvage ou le mutant BMCMCs intrapéritonéalement (i.p.), en intraveineuse (i.v.) ou intradermiquement (i.d.) dans le penne d’oreille, puisque ces artères de l’injection ont été employées par beaucoup d’investigateurs. Cependant, les BMCMC ont également été greffés avec succès dans la peau du dos47,dans le footpad48,intra-articulaire49 ou intra-crânienne50,51. Le nombre de BMCMC à greffer, ainsi que l’intervalle entre la greffe et l’expérience, peuvent varier en fonction de la voie d’injection et de l’organe ciblé à greffer (Figure 1). Il est très important de respecter de tels intervalles après avoir englouti les BMCMC avant de commencer l’expérience afin de laisser suffisamment de temps aux BMCMC (qui ne sont pas des MC entièrement matures) pour devenir plus matures in vivo. Puisque le contenu des médiateurs stockés dans les granules cytoplasmiques du MC peut continuer à augmenter au cours de la durée de vie de la cellule38,52, pour certaines expériences on peut souhaiter augmenter l’intervalle entre l’engraftment de MC et le déclenchement de l’expérience pour évaluer la fonction de MC.

Selon la voie d’injection et/ou le nombre de BMCMC injectés, le nombre et/ou la distribution anatomique des MC transférés de manière adoptive peuvent différer de ceux des populations de MC natives correspondantes chez les souris de type sauvage12,23,53,54. Les souris déficientes en MC greffées i.p. ou i.d. avec BMCMC peuvent avoir à peu près le même nombre et la même distribution de MC que la population indigène de MC chez les souris de type sauvage, dans la cavité péritonéale et le mésentère et dans le derme, respectivement lorsqu’elles sont évaluées 4 à 8 semaines après le transfert de MC12,23. Le transfert intraveineux de BMCMC ne mène pas aux nombres normaux de MC et/ou à la distribution dans la plupart des tissus. Par exemple, on ne trouve pas ou très peu de MC dans la peau de ces sourisknock-inde mastocytes greffées. À 4-28 semaines après l’injection d’i.v. de BMCMCs dans les souris MC-déficientes, les nombres de MCs dans la trachée sont sensiblement inférieurs à ceux dans les souris de type sauvage correspondantes. En revanche, le nombre de MC dans la périphérie du poumon est généralement supérieur à ceux des souris de type sauvage correspondantes12,23,53,55. Le transfert i.v. de BMCMC se traduit également par des niveaux élevés de MC dans la rate, alors que très peu de MC natifs se trouvent généralement dans cet organe chez les souris de type sauvage23,56. Il est important de faire, les rapports précédents ont démontré que l’injection i.v. de BMCMC chez les souris déficientes en MC n’entraîne pas la greffe des populations de MC dans des sites anatomiques spécifiques tels que la moelle épinière, les ganglions lymphatiques ou le cœur54,57. Plusieurs groupes ont également noté qu’une telle greffe d’i.v. n’a pas comme conséquence l’engraftment de la population muqueuse intestinale de MC (MMC)23,58-60. De telles différences dans le nombre de MC et/ou la distribution des MC transférés de manière adoptive par rapport aux MC natifs doivent être prises en compte lors de l’interprétation des données obtenues à l’aide du modèle9demastocytes knock-inde MC.

Il existe plusieurs souches de souris déficientes en MC, et il est important de choisir celle ou celles à utiliser dans un projet particulier. Les souris déficientes en MC mutantes enkit, telles que les souris KitW/W-v ou KitW-sh/W-sh, ont été traditionnellement utilisées par de nombreux chercheurs. Cependant, ces souris souffrent de nombreuses anomalies phénotypiques liées auc- kiten plus de leur profonde carence en MC (Tableau 1). Ces dernières années, plusieurs souches de souris présentant un déficit constitutif indépendant de mc de c-kitont été rapportées24-26. Certaines de ces souris présentent également d’autres anomalies phénotypiques en plus de leur déficit en MC (tableau 1), et d’autres anomalies pourraient également être découvertes car le phénotype de ces souches nouvellement décrites est toujours à l’étude. Toutes ces souris et quelques nouveaux types supplémentaires de souris déficientes en MC ont été récemment examinés en détail9,10,13.

Compte tenu des limites de chacune des souches déficientes en MC actuellement disponibles, nous vous recommandons d’essayer de tester les hypothèses sur la fonction MC en utilisant plus d’un modèle de déficience en MC9. Dans notre laboratoire, nous effectuons généralement des expériences pilotes en KitW-sh/W-sh et Cpa3-Cre ; Mcl-1souris fl/fl. Si nous obtenons des résultats concordants dans les deux types de souris MC-déficientes, nous procédons alors aux expériences d’engraftment pour déterminer le rôle des MCs et évaluer les rôles potentiels de certains produits MC-dérivés. Enfin, il convient de noter que plusieurs souches permettant l’épuisement inductible des MCs ou la suppression par cre recombinase-négociée des gènes « floxed » dans les MCs ont également été récemment décrites25,49,61. Ces souches ont été examinées en détail ailleurs9,10,13 et représentent des approches alternatives - ou complémentaires - prometteuses pour étudier les fonctions MC in vivo.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

N.G. est récipiendaire de bourses de la Français Fondation pour la Recherche Médicale FRM et de la Fondation Philipp ; R.S. est soutenu par la Fondation Lucile Packard pour la santé des enfants et le numéro de prix CTSA nih/NCRR de Stanford UL1 RR025744; P.S. est soutenu par une bourse Max Kade de la Fondation Max Kade et de l’Académie autrichienne des sciences et une bourse Schroedinger du Fonds autrichien pour la science (FWF): J3399-B21; S.J.G. remercie le soutien des national institutes of health subventions U19 AI104209, NS 080062 et du programme de recherche sur les maladies liées au tabac de l’Université de Californie; L.L.R. reconnaît le soutien de la Fondation nationale de la recherche sur l’arthrite (ANRF) et de la subvention K99AI110645 des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

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Immunologie et infection numéro 99,c-kit facteur de cellules souches FcεRI immunoglobuline E modèle murin transfert adoptif immunologie allergie
Analyse des fonctions des mastocytes <em>in vivo</em> à l’aide de souris<em>knock-in</em>de mastocytes
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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

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