Robotic Production of Cancer Cell Sfäroider med en vatten tvåfassystem för drogtestning

Summary

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Abstract

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

Introduction

Cellbaserade analyser ger ett viktigt verktyg för att utveckla och upptäckten av nya läkemedel mot cancer. ^1,2 Historiskt har monolagerodling av cancerceller använts för att undersöka effekten av kandidatföreningar mot vissa typer av cancerceller. Den enkelt underhåll av monolagerkulturer i standardodlingsplattor, kompatibilitet standardplattor med kommersiella robot verktyg för tillsats av reagens och med screening utrustning för nedströms analys av cellulära svar på kemiska föreningar är de stora fördelarna som gör 2D kulturer en attraktiv verktyg för drogtestning. ³ Tyvärr, monolager cellanalyser ofta misslyckas med att förutsäga effekten av föreningar in vivo, vilket gör läkemedelsutveckling och upptäckt en extremt kostsam process. ^4,5 Trots betydande investeringar och insatser av läkemedelsföretag och akademiska enheter, bara ~ 1% av anti-cancer läkemedel i kliniska prövningar godkändesav FDA under de senaste två decennierna. ⁶ Skillnader mellan 2D kulturer och den komplexa 3D-miljö av cancerceller in vivo är en stor brist på monoskikt odlingssystem. ⁷ Därför screening av kandidatföreningar mot tumörceller i en miljö som mer liknar 3D-tumörmiljön kan påskynda utvecklingen av nya cytostatika. ⁸

Cancer Cell sfäroider presentera en relevant 3D tumörmodell in vitro. ^9,10 Sfäroider är kompakta kluster som bildar genom spontan eller inducerad sammansättning av cancerceller på icke-vidhäftande ytor eller i suspension med användning av tekniker såsom spinnkolv, flytande overlay, mikrofabricerad mikro- . väl arrayer, mikrofluidik och hängande droppar ^11-16 Sfäroider härma viktiga funktioner i solida tumörer inklusive geometri och begränsade transporter av syre, näringsämnen och läkemedelssubstanser i den centrala zonen; följaktligen, de närmare regenerera drog response av solida tumörer jämfört med monolagerkulturer. ^17-19 Trots detta markant fördel är spheroids inte rutinmässigt för screening av kemiska föreningar mot cancerceller. Svårighet att producera enhetliga stora spheroids i en standard hög genomströmning inställning som är kompatibel med kommersiellt tillgängliga robotteknik och screening / bildframställning hindrar inkorporering av sfäroid kulturen i läkemedelsutveckling pipeline. Även anpassade material och plattor har nyligen blivit kommersiellt tillgängliga att tillgodose det behovet, kostnadsöverväganden avskräcka en bred användning.

Två större med möjlighet att producera konsekventa stora sfäroider i hög genomströmning använda en ny droppe plattform och mikrofabricerade mikrobrunnar. ^13,16,20 Men båda metoderna kräver speciella plattor och enheter som är dyra att tillverka och obekvämt för endpoint användare i kärn forskningscentra och läkemedelsindustrin, där den mest betydande effästningar för upptäckten av nya anticancerläkemedel görs. Trots vissa förbättringar i stabilitet cellinnehållande droppar med en nyligen utformning av hängande fallplåtar, endast varannan hål i plattan fortfarande används under odling för att undvika spridning / sammanslagning av droppar. ¹⁶ Detta minskar avsevärt experimentell genomströmning. Drog addition och förnyelse är svårt med manuell eller robot pipettering och sfäroider måste överföras till en vanlig platta för biokemisk analys eftersom denna platta konfiguration är inte lätt kan förenas med konventionell screening utrustning såsom plattläsare. ²¹ Mikro brunnar fabricerade använder mjuk litografi också tillåta kontrollerad storlek sfäroid produktionen. ^13,20 emellertid oförenlighet denna plattform med standardpipetteringsverktyg förhindrar behandling av enskilda sfäroider med olika läkemedelssubstanser / koncentrationer, utsätta alla spheroids till en enda behandling tillstånd. Således är inte lämpligt för hög denna metodgenomströmning förening screening som kräver samtidig testning av flera föreningar / koncentrationer.

För att övervinna dessa hinder, har en ny teknik för hög genomströmning produktion av konsekvent stora cancercell spheroids i standard 96-hålsplattor utvecklats. ^22,23 Ansatsen bygger på en polymer vatten tvåfassystem (ATPS) med polyetylenglykol ( PEG) och dextran (DEX) som fasbildande polymerer. ²⁴ ATPSs har nyligen använts i en mångfald av nya cellbiologiska applikationer för att möjliggöra cell micropatterning och lokaliserad leverans av biologiska reagens till celler i höggradigt vattenhaltiga medier. ^25-32 För att bilda en sfäroid, är cancerceller blandas med den vattenhaltiga DEX fasen och en sub-mikroliters droppe av den resulterande suspensionen pipetteras i en brunn innehållande nedsänkning vattenhaltig PEG-fasen lösning. Droppen förblir oblandbar från nedsänkning fasen och begränsar celler för att underlätta bildandet av en sfäroid. Importantly, ger den mycket vattenimmersionsfasen näringsämnen till cellerna i sfäroid och minimerar välkända problemet med medie avdunstning gemensam för några andra analyser som orsakar förändringar i medie osmolalitet och fluktuationer i läkemedelskoncentrationer. Denna teknik möjliggör sfäroid produktion och läkemedelsbehandling endast med användning av kommersiellt tillgängliga reagens och pipetteringsverktyg i standard 96-brunnars plattor. Viktigt är analys av cellulära svar av sfäroider utförs i samma platta med användning av biokemiska standardanalyser och plattläsare. Enkelheten i att arbeta med ATPS och anpassningsförmåga till den inställning till robotvätskehantering gör hög genomströmning generation både monokultur och samodling Sfäroiderna en enkel laboratorieteknik. Denna nya metod kommer att vara ett stort steg framåt mot integration av cancerceller spheroids i läkemedelsutveckling och upptäcktsprocesser med förbättrad testning genomströmning och kostnadseffektivitet (allt fler testade föreningar och reduced reagensförbrukning) och effektivitet (minska hands-on tid).

En detaljerat protokoll för robot produktion av cancercell sfäroider i 96-brunnars plattor med användning av ATPS tillvägagångssätt beskrivs nedan. Dessutom finns uppgifter om läkemedelsbehandling av resulte sfäroider och nedströms analys av cellulära svar med hjälp av en kommersiell biokemisk analys presenteras.

Protocol

1. Beredning av Polymera Vatten tvåfassystem (ATPS) Väg 0,5 g polyetylenglykol (PEG) (molekylvikt: 35.000) och lägga till den i 9,5 ml fullständigt tillväxtmedium i en steril 15 ml koniskt för att framställa 10 ml av 5% (vikt / volym) vattenlösning av PEG-fasen. Obs: Lägga hälften av mediet till den koniska först följt av tillsats av polymeren och sedan resterande mängden medel minimerar vidhäftning av polymeren till de koniska väggar och hjälper polymeren upplösa snabbare. V…

Representative Results

Arbetsstationen hos robot vätskehanterare visas i figur 1. Den pipetteringshuvud och alla stationer som används i robot tryckning av sfäroider i avsnitt 4.6 är märkta. Bilden visar användningen av två olika stationer för spetslådor (en uppsättning tips för blandning och den andra uppsättningen för aspire / dispensering av cellsuspension-vatten DEX fasblandning). Hela installationen är inhyst i en standard biologiska säkerhetsskåp för att upprätthålla sterilitet. Figur 2</stron…

Discussion

Spheroids presentera en realistisk modell för att bättre förstå tumör fysiologi och läkemedlets effektivitet och ge ett användbart verktyg för anti-cancer läkemedel. Sådana tillämpningar skulle ha stor nytta av enkla sfäroid generation och underhållstekniker som bara kräver standardlaboratorieutrustning, flytande verktyg hanterings- och sorteringsutrustning. Användningen av en vattenbaserad tvåfassystem att spontant samlade cancerceller inom droppfasen möjliggör effektiv produktion och underhåll av sf…

Materials

Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, Mw: 35,000	Sigma-Aldrich	94646
Dextran, Mw: 500,000	Pharmacosmos	5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6429
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
Glutamine	Life Technologies	35050-061
Antibiotic	Life Technologies	15240-062
Clacein AM	Life Technologies	C3100MP
Hoechst	Life Technologies	33342
Cisplatin	Spectrum Chemicals	15663-27-1
PrestoBlue	Life Technologies	A-13261
Pluronic F-108	Sigma Aldrich	542342
Disposable Tips (10 µl)	Fluotics	C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)	Fluotics	C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates	Corning	7007
Equipment
Liquid Handler	Agilent Technologies	SRT Bravo
Microplate Reader	Biotek Instruments	Synergy H1M