Introduction
Saggi cellulari forniscono uno strumento importante per lo sviluppo e la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. 1,2 Storicamente, colture monostrato di cellule tumorali sono stati impiegati per studiare l'efficacia di composti candidati contro particolari tipi di cellule tumorali. La facilità di manutenzione delle colture monostrato in piastre di coltura standard, la compatibilità di piatti standard con strumenti robotici commerciali per l'aggiunta dei reagenti, e con attrezzature di screening per l'analisi a valle di risposte cellulari a composti chimici sono i principali vantaggi che rendono le culture 2D uno strumento interessante per test anti-droga. 3 Purtroppo, saggi cellulari monostrato spesso non riescono a prevedere l'efficacia di composti in vivo, rendendo lo sviluppo di farmaci e la scoperta di un processo estremamente costoso. 4,5 Nonostante investimento significativo e lo sforzo da aziende farmaceutiche e unità accademiche, solo ~ 1% di anti-cancro sono stati approvati i farmaci negli studi clinicidalla FDA negli ultimi due decenni. 6 Disparità tra culture 2D e l'ambiente 3D complesso di cellule tumorali in vivo è una grave lacuna di sistemi di coltura monostrato. 7 Pertanto, lo screening di composti candidati contro le cellule tumorali in un ambiente che assomiglia più da vicino l'ambiente tumore 3D potrebbe accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci chemioterapici. 8
Sferoidi di cellule di cancro presentano un rilevante modello di tumore 3D in vitro. 9,10 Spheroids sono gruppi compatti che si formano attraverso l'assemblaggio spontanea o indotta delle cellule tumorali su superfici non aderenti o in sospensione utilizzando tecniche come pallone filatore, overlay liquido, micro- microfabbricazione . ben array, microfluidica, e gocce appesi 11-16 Spheroids imitano le caratteristiche principali di tumori solidi, tra cui la geometria e il trasporto limitata di ossigeno, sostanze nutritive, e composti di droga nella zona centrale; di conseguenza, hanno più da vicino rigenerano respon drogase di tumori solidi rispetto a colture monostrato. 17-19 Nonostante questo notevole vantaggio, sferoidi non sono comunemente usate per lo screening di composti chimici contro le cellule tumorali. Difficoltà di produrre sferoidi uniformi dimensioni in un ambiente standard elevato rendimento che è compatibile con la robotica disponibili in commercio e strumenti di screening / immagini impedisce l'incorporazione della cultura sferoide in pipeline di sviluppo di farmaci. Anche se i materiali personalizzati e piastre hanno recentemente resi disponibili in commercio per rispondere a questa esigenza, le considerazioni sui costi scoraggiare il loro uso diffuso.
Due importanti tecniche con la capacità di produrre sferoidi dimensioni consistenti in un throughput elevato utilizzare una nuova piattaforma goccia pendente e microfabbricati micro-pozzetti. 13,16,20 Tuttavia, entrambi gli approcci richiedono piatti e dispositivi che sono costosi da produrre e scomodo per gli utenti endpoint speciali in centri di ricerca di base e le industrie farmaceutiche, dove la più grande efforti per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro sono fatti. Nonostante alcuni miglioramenti nella stabilità di gocce di cellule contenenti un recente disegno di appendere piastre goccia, solo ogni foro della piastra è ancora usato durante la coltura per evitare la diffusione / fusione di gocce. 16 Ciò riduce significativamente il throughput sperimentale. Inoltre e rinnovamento della droga è difficile con manuale o robotizzato pipettaggio e sferoidi devono essere trasferiti in una piastra standard per l'analisi biochimica, perché questa configurazione targa non è facilmente compatibile con gli apparecchi tradizionali, come lettori di piastre. 21 micro-pozzetti fabbricati usando litografia soft anche consentire dimensione controllata produzione sferoide. 13,20 Tuttavia, l'incompatibilità di questa piattaforma con strumenti di pipettaggio standard di trattamento impedisce di sferoidi individuali con composti farmacologici / concentrazioni diverse, esponendo tutti sferoidi a una sola condizione di trattamento. Così, questo metodo non è appropriato per altalo screening composti rendimento che richiede il test simultaneo di più composti / concentrazioni.
Per superare questi ostacoli, è stata sviluppata una nuova tecnica per la produzione ad alta velocità di costantemente dimensioni sferoidi di cellule di cancro in piastre a 96 pozzetti standard. 22,23 L'approccio si basa su un sistema polimerico acquoso bifase (ATPS) con polietilene glicole ( PEG) e destrano (DEX) polimeri in fase di formatura. 24 ATPSs sono state recentemente utilizzato in una varietà di applicazioni biologiche romanzo cellulari per consentire micropatterning cellulare e localizzata consegna dei reagenti biologici alle cellule in mezzi acquosi altamente. 25-32 Per formare un sferoide, le cellule tumorali sono mescolati con la fase acquosa DEX e un calo sub-microlitri della sospensione risultante viene pipettato in una immersione soluzione fase PEG acquosa contenente bene. La goccia rimane immiscibile dalla fase di immersione e cellule limita a facilitare la formazione di uno sferoide. Diavolettoortantly, la fase di immersione molto acquosa fornisce sostanze nutritive alle cellule della sferoide e minimizza il problema ben noto dei media evaporazione comune ad alcuni altri test che causano i cambiamenti nei mezzi osmolalità e le fluttuazioni delle concentrazioni di droga. Questa tecnica permette la produzione sferoide e trattamento farmacologico solo utilizzando reagenti disponibili in commercio e strumenti di dispensazione in piastre da 96 pozzetti standard. È importante sottolineare che l'analisi delle risposte cellulari di sferoidi viene eseguita nella stessa piastra utilizzando saggi biochimici standard e lettori di piastre. La facilità di lavorare con ATPS e adattabilità del approccio alla gestione dei liquidi robotizzato fa generazione ad alto rendimento sia mono-cultura e di co-coltura sferoidi una tecnica di laboratorio semplice. Questo nuovo approccio sarà un importante passo avanti verso l'integrazione di sferoidi di cellule di cancro nei processi di sviluppo di farmaci e di scoperta con una migliore velocità di test e di costo-efficacia (un numero crescente di composti e Redu testaticonsumo di reagente ced) e l'efficienza (riduzione hands-on tempo).
Un protocollo dettagliato per la produzione robotizzata di sferoidi di cellule di cancro in piastre da 96 pozzetti utilizzando l'approccio ATPS è descritto di seguito. Inoltre, i dettagli di trattamento farmacologico di sferoidi conseguenti e analisi a valle delle risposte cellulari utilizzando un test biochimico commerciale sono presentati.
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Protocol
1. Preparazione di polimerici acquosa Due sistema Phase (ATPS)
- Pesare 0,5 g di polietilene glicole (PEG) (MW: 35.000) e aggiungerlo al 9,5 ml di terreno di coltura completo in una sterile 15 ml conica per preparare 10 ml di 5% (w / v) di fase acquosa PEG.
Nota: Aggiungendo la metà del mezzo alla conica per prima, seguita dalla aggiunta il polimero e quindi la quantità rimanente di supporto minimizza l'adesione del polimero alle pareti coniche e aiuta il polimero sciogliere velocemente. - Pesare 0,128 g di destrano (DEX) (MW: 500.000) e aggiungerlo al 0,872 ml di terreno di coltura completo in una provetta sterile da 1,5 ml microcentrifuga per preparare 1 ml del 12,8% (w / v) fase DEX acquosa.
- Soluzioni Vortex entrambi per circa 1 minuto per sciogliere i polimeri nel mezzo.
- Tenere entrambe le soluzioni in un bagno d'acqua a 37 ° C per 1 ora per assicurare dissoluzione e miscele omogenee. Tenere i tappi sopra il livello dell'acqua per evitare la possibilità di contaminazione delle soluzioni dal bagnoacqua.
- Caricare la soluzione fase PEG in una sterile, siringa di plastica e farla passare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron dimensione dei pori per rimuovere le impurità.
Nota: Riempire la siringa con la soluzione di PEG, posizionarlo nell'inserto del filtro sopra un tubo conico e usando la forza, spingere lentamente la soluzione attraverso il filtro. È normale che si verifichi resistenza contro il movimento dello stantuffo della siringa. Minor perdita della soluzione polimerica si verifica come parte della soluzione rimarrà nel filtro, ma la concentrazione di polimero non cambierà. - Pipettare 10 microlitri della soluzione di fase DEX e diluire a 10 ml di mezzo in un tubo separato per provocare 6,4% (w / v) di fase DEX. Aspirare 100 ml di soluzione di fase PEG e versare in una capsula di Petri.
- Pipettare 0,5 ml di 6,4% (w / v) di fase nella soluzione di DEX fase di PEG. Visivamente confermare successo formazione ATPS osservando una goccia DEX al microscopio. Il confine gocciadovrebbe rimanere visibile, indicando la presenza di due fasi, distinte acquose stabili.
- Conservare lo stock acquosa PEG e soluzioni di fase DEX a 4 ° C fino al momento dell'uso.
Nota: Si raccomanda di soluzioni polimeriche sono preparati freschi prima di ogni esperimento e utilizzati entro 24 ore di archiviazione.
2. Preparazione per la stampa di cancro Spheroids Cellulari
- Crescere le cellule tumorali di interesse (ad esempio, le cellule MDA-MB-157 cancro al seno) per un 90% -100% confluenti monostrato. Per MDA-MB-157 cellule, usare un mezzo costituito di DMEM contenente 10% FBS, 1% glutammina e 1% di antibiotici.
- Celle di raccolta con un tampone di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore) e caricare la sospensione in una conica da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 173,3 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura completo.
- Le celle di carico su un emocitometro e contare di calcolare il numero richiestodi cellule per una densità cellulare sferoidale desiderato. Un monostrato confluente di MDA-MB-157 cellule cresciute in un pallone T75 solito dà ~ 7 x 10 6 cellule.
Nota:. Densità cellulare Richiesto per un volume di goccia per generare un singolo sferoide dipenderà dal tipo cellulare 22 Per esempio, una densità di 1,5 x 10 4 o maggiore per MDA-MB-157 cellule è raccomandato in 0,3 ml di fase DEX drop garantire la formazione di un unico sferoide. - Cellule di centrifugazione per una seconda volta per 5 minuti a 173,3 xg e risospendere in un volume adeguato di terreno di crescita per concentrare la sospensione ad una densità cellulare desiderata.
Nota: Ad esempio, se sono state raccolte 7 x 10 6 cellule tumorali, il volume totale della sospensione cellulare richiesta per formare uno sferoide di densità di 1,5 x 10 4 cellule in 0,3 ml DEX fase goccia sarà di 140 microlitri. Tuttavia a causa della diluizione con soluzione di fase DEX nella fase successiva, utilizzare solo 70 ml di mezzo di coltura cellulare per risospendere le cellule. - Mescolare bene la sospensione cellulare per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e miscelazione di soluzione DEX. Pipettando su e giù dovrebbe essere fatto con delicatezza per evitare la formazione di bolle.
3. Preparazione per la stampa di Spheroids Co-coltura
- Crescere cellule tumorali (per esempio, MDA-MB-157 cellule di cancro al seno umano) e le cellule di supporto (ad esempio, fibroblasti umani) ad un 90% -100% confluenti monostrato. Raccogliere ogni tipo di cellula con un buffer di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore).
- Caricare ogni sospensione in un conica 15 ml, li centrifugare per 5 min a 173,3 xg, e aspirare il surnatante da ciascun conica. Risospendere le cellule di ogni conica in 1 ml di completo grescita media.
Nota: Coloranti fluorescenti come calceina AM (macchia cellule vive) e coloranti nucleari (Hoechst) possono essere utilizzati per distinguere i due tipi di cellule.
- Caricare ogni sospensione in un conica 15 ml, li centrifugare per 5 min a 173,3 xg, e aspirare il surnatante da ciascun conica. Risospendere le cellule di ogni conica in 1 ml di completo grescita media.
- Caricare ciascun tipo di cellula separatamente su un emocitometro e contarli per calcolare il numero di ciascun tipo di cellula per un rapporto desiderato di cellule tumorali di cellule di supporto in sferoidi co-coltura. Monostrati confluenti di MDA-MB-157 cellule e fibroblasti coltivate in fiasche T75 solito danno ~ 7 x 10 6 e ~ 6 x 10 6 cellule, rispettivamente.
- Aggiungere il volume corretto dalla sospensione di cellule di supporto alle cellule tumorali sospensione invia un rapporto desiderato del numero di due tipi di cellule. Ad esempio, utilizzare un rapporto di 50 cellule tumorali a 1 fibroblasti.
- Centrifugare la conica contenente la sospensione cellulare mista per 5 min a 173,3 XG e risospendere le cellule in un volume adeguato al risultato della densità finale comprendente dei volumi uguali di mezzo di crescita e l'12,8% (w / v) DEX acquosaSoluzione fase (preparato in 1.2).
- Pipettare delicatamente la sospensione cellulare risultante su e giù per assicurare l'omogeneità della sospensione.
4. La stampa di Spheroids tumorali in una piastra a 96 pozzetti
- Un giorno prima esperimenti, cappotto lastre non trattate, a fondo tondo da 96 pozzetti con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C per 24 ore. Questo rivestimento impedisce l'adesione delle cellule durante il periodo della cultura.
- Pipettare 50 ml di filtrato 5% (w / v) fase acquosa PEG in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (piastra di destinazione).
- Utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare (preparata al punto 2 o 3 step per mono e co-coltura, rispettivamente) e aggiungere 20 ml di sospensione di ogni altro bene da una colonna di una piastra 384 pozzetti (targa fonte) .
- Accendere il gestore liquido e "casa" il capo di pipettaggio per registrare le coordinate. Quindi compilare un protocollo già definito (di seguito in 4.6) al fine di garantire da laboratorio e parametri sono definiti correttoly. Questo passo "homing" può essere diverso per i diversi gestori di liquidi.
Nota: Il flusso del protocollo, mostrato passo-passo di seguito in 4.6, sarà simile a prescindere dal gestore liquido robotica utilizzato; Tuttavia, l'interfaccia di programmazione può differire a causa dell'uso di diversi software. - Posizionare la piastra di origine, la piastra di destinazione, e scatole di tip pipetta in posizioni definite sulla workstation del gestore liquido come mostrato in Figura 1.
- Eseguire il protocollo che prevede le seguenti fasi:
- Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio del gestore liquido con miscelazione punte per pipette (8 punte) dalla stazione di lavoro (Figura 1).
- Mescolare la sospensione cellulare in pozzetti della piastra di sorgente (Figura 1). Selezionare un volume di miscelazione inferiore al volume di sospensione cellulare in pozzetti per evitare la formazione di bolle.
- Espellere punte in una scatola discariche vuota (Figura 1). Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio con 10 microlitri di erogazione punte per pipette (Figura 1).
- Aspirare 0,3 ml di sospensione cellulare dalla piastra sorgente (Figura 1) in ciascuna punta della pipetta.
- Distribuire la sospensione cellulare nei pozzetti di una colonna della piastra di destinazione (Figura 1). Utilizzare un'altezza erogazione di 0,5 mm e una portata di erogazione inferiore a 1 ml / sec.
- Ripetere i passaggi attraverso 4.6.1 4.6.6 finché la stampa di colonna per colonna nella intera piastra destinazione è completa.
- Rimuovere con cautela la piastra di destinazione dalla superficie workstation e collocarlo in un incubatore umido a 37 ° C e 5% di CO 2. Mantenere la piastra orizzontale durante il trasporto in incubatrice per evitare di interrompere di DEX gocce fase contenenti cellule.
- Incubare la piastra per 24 ore per permettere l'aggregazione di cellule in uno sferoide all'interno della goccia fase DEX.
Si noti che il seguente protocollo è per un trattamento farmacologico 4 giorni e comprende un rinnovamento con farmaco fresco dopo giorno 2. Può essere modificato per altri periodi di trattamento.
- Confermare visivamente formazione sferoide in piastre da 96 pozzetti dopo 24 ore. Se necessario, pozzi di immagine per la misurazione di dimensioni di sferoidi dalla media dei diametri più piccoli e più grandi di ogni sferoide.
- Preparare la soluzione madre di un farmaco desiderato sciogliendolo in un solvente raccomandato dal costruttore, ad una concentrazione di solubilità predeterminata. Ad esempio, sciogliere cisplatino in acqua a 2 mg / ml.
Nota: Proteggere la soluzione madre del farmaco dalla luce, se il farmaco è sensibile alla luce. - Utilizzando la tecnica di diluizione in serie, preparare concentrazioni di farmaco diluito con mezzo di coltura cellulare dalla soluzione madre preparata nella fase precedente. Ogni diluizione dovrebbe essere fatta due volte la concentrazione desiderata. DilRapporti ution variano a seconda della concentrazione della partenza e desiderata concentrazione di lavoro.
- Aggiungere 50 ml di soluzione medicinale preparata nella fase precedente in ciascun pozzetto. Questo può essere fatto tramite macchina o pipettando manuale.
Nota: Ogni concentrazione farmaco sarà diluito in mezzo alla concentrazione voluta dal 50 microlitri acquosa fase PEG già in ciascun pozzetto.- Utilizzare sferoidi da due colonne di una piastra a 96 pozzetti (n = 16) per ciascuna concentrazione.
- In pozzetti di controllo, aggiungere solo 50 ml di terreno di coltura fresco alle attuali 50 microlitri della fase acquosa PEG.
- Incubare sferoidi con il farmaco per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce.
- Dopo 48 h di incubazione, preparare diluizioni fresche del farmaco, alle concentrazioni desiderate e rinnovare farmaco aggiungendo 50 ml di soluzione medicinale fresca a ciascun pozzetto.
Nota: I pozzi contengono già la concentrazione del farmaco desiderato dal primo farmaco tRATTAMENTO. Pertanto in questa fase di rinnovo, ciascuna concentrazione viene preparata alla concentrazione desiderata in quanto si verificherà alcuna diluizione. - Incubare sferoidi con il farmaco per un altro 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce.
6. Analisi della Cellular Viabilità in Spheroids
- Dopo 48 ore di incubazione con rinnovata farmaco (cioè, il tempo totale del trattamento di sferoidi con un farmaco è 4 giorni), misurare il volume totale del mezzo in un pozzetto pipettando manuale.
Nota: il volume tipico in un bene è ~ 140 microlitri (un piccolo calo si verifica a causa di evaporazione). - Calcolare il volume della cella di reagente vitalità (ad esempio, PrestoBlue) come concentrazione del 10% del volume totale bene. Aggiungere questo volume di reagente vitalità cellulare in ciascun pozzetto.
Nota: Con un volume di supporto esistente di 140 microlitri in un pozzo, un volume di 15,6 microlitri è necessaria per ottenere una concentrazione del 10% del totale bene. Questo è calcolatodividendo il volume del supporto esistente 9 (140 ml / 9 = 15,6 ml). - Incubare la piastra con il reagente vitalità cellulare aggiunti a ciascun pozzetto per 6 ore a 37 ° C, al riparo dalla luce.
- Porre la piastra in un lettore di micropiastra e leggere il segnale di fluorescenza a 560 nm e 590 nm di eccitazione e di emissione, rispettivamente.
- Calcolare la vitalità percentuale di cellule in sferoidi normalizzando il segnale fluorescente da pozzi trattati a quella di pozzetti di controllo dopo la media dei valori delle stesse condizioni di trattamento.
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Representative Results
La workstation del gestore liquido robotizzato è mostrato in Figura 1. La testa di pipettaggio e tutte le stazioni utilizzati nella stampa robotico di sferoidi nella sezione 4.6 sono etichettati. L'immagine mostra l'uso di due diverse stazioni per scatole di tip (una serie di punte per la miscelazione e la seconda serie di aspirazione / erogazione di cellula miscela fase DEX sospensione acquosa). L'intera configurazione è alloggiato all'interno di un armadio standard di sicurezza biologica per mantenere la sterilità. La figura 2 illustra uno schema del processo di "stampa" con il sistema a due fasi acquosa. Un puntale caricato con la sospensione cellulare nella fase acquosa DEX (blu, fase patterning) si abbassa in un pozzo fondo rotondo di una piastra a 96 pozzetti contenente la fase acquosa PEG (rosa, fase di immersione) per erogare il contenuto vicino a fondo del pozzetto. La fase risultante calo DEX limita le cellule tumorali di dispersione e incoraggia le interazioni cellula-cellula che provocanoaggregazione delle cellule e formazione sferoide. Formazione Spheroid è spontanea ed avviene entro 24 h di incubazione, come mostrato nella figura sperimentale di figura 2. In pratica, stampa sferoidale viene eseguita colonna per colonna in piastre da 96 pozzetti. Dopo formano sferoidi, mezzo di coltura viene rinnovato mediante aggiunta diretta di terreno fresco, convertendo il sistema a due fasi ad una singola fase acquosa. Questa transizione è dovuto alla riduzione delle concentrazioni di PEG e DEX di sotto di una soglia di concentrazione necessaria per la separazione di fasi acquose PEG e DEX.
Erogazione di un meccanismo di spostamento d'aria pipettaggio convenzionale del liquid handler è stato ottimizzato in modo parametrico e si è constatato che l'altezza di erogazione di 0,5 mm, una portata di erogazione del minore di 1 ml / sec seguita da erogare 0,2 ml di pre-aspirato volume d'aria produce la dimensione più consistente di DEX acquosa gocce, e quindi sferoidi. 23 Figura dis 3agioca la distribuzione del diametro di 96 sferoidi da una piastra con un diametro medio di 332 ± 31 micron. L'esperienza precedente mostra che questo approccio genera tipicamente sferoidi con l'8% -10% errore standard intorno al diametro medio. Figura 3b mostra la distribuzione della frequenza di diametro sferoidi della stessa piastra come in figura 3a, dimostrando che i diametri sono distribuiti normalmente.
Successivamente, il potenziale di questo approccio per lo screening composti in piastre da 96 pozzetti standard e analisi delle risposte cellulari nelle stesse piastre, senza necessità di trasferire sferoidi alle nuove piastre è stata dimostrata. La Figura 4 mostra uno studio di dose-dipendente della redditività di MDA -MB-157 seno sferoidi di cellule di cancro trattati con un farmaco chemioterapico clinico, cisplatino. Sferoidi droga trattati e di controllo sono state incubate con un reagente PrestoBlue commerciale (cellule viabilità reattivo). Cellule enzimaticamente attivi ridotto il reagent e comportato un cambiamento del colore del supporto e un cambiamento nel segnale fluorescente. Il cambiamento di segnale era grande con cellule vive (ad esempio, in sferoidi di controllo). La vitalità delle cellule tumorali in sferoidi è diminuita con l'aumentare della concentrazione di farmaco superiore a 1 micron. Questa prova ha determinato una concentrazione di farmaco dose letale 50% di LD50 = 4.67 mM.
Questa tecnologia sistema bifasico acquosa per cultura 3D permette la produzione diretta di modelli tumorali più realistici includendo altri componenti di microambienti cellulari come supporto cellule stromali. E 'stato dimostrato in precedenza che comprese le cellule stromali in culture 3D modula la crescita, la proliferazione e l'invasione delle cellule tumorali. 33-35 come un proof-of-concept sferoidi esperimento, co-coltura sono stati generati dalla combinazione di MDA-MB-157 materno le cellule tumorali e fibroblasti umani a un rapporto di 50:. 1 36 Prima di esperimenti, le cellule MDA-MB-157 e fibroblasti erano macchiaticon un colorante nucleare (blu) e colorante cellule vive (verde), rispettivamente, per consentire il rilevamento di immagini in cellule fluorescenti. Figura 5a mostra immagini fluorescenti e fase di sferoidi co-coltura con una densità di 1,5 x 10 4 cellule e 50 :. 1 rapporto tra cellule tumorali e fibroblasti Figura 5b mostra sferoidi di controllo MDA-MB-157 cellule per il confronto. Questo approccio consentirà valutare l'effetto delle cellule stromali su vari fenotipi di cellule tumorali.
Piattaforma Manipolazione Figura 1. Liquid. Il gestore liquido è costituito da stazioni in cui miscelazione suggerimenti, consigli di erogazione, di dialogo suggerimenti rifiuti, piatto di origine, e le posizioni piastra destinazione sono collocati. La posizione di ciascuna stazione è definito nel protocollo. Punte di miscelazione vengono caricati su una colonna della testa di pipettaggio e utilizzati per miscelare la soluzione della fase acquosa DEX contenente cellule nella piastra di origine. Questi suggerimenti vengono poi smaltiti nella casella discariche e le punte di erogazione sono inseriti sulla stessa colonna della testa pipettaggio. Questi suggerimenti aspirare 0,3 ml della fase acquosa contenente DEX cellule dalla piastra sorgente e dispensare nella piastra di destinazione per formare gocce di cellule contenenti della fase DEX all'interno fase già nei pozzetti della piastra di destinazione immersione PEG. Infine questi suggerimenti sono smaltiti in scatola discariche per completare un ciclo di stampa.
Figura 2. La formazione Spheroid. Il gestore liquido eroga 0,3 ml di fase acquosa DEX (blu) contenente cellule (verde) in un pozzetto contenente la soluzione acquosa di PEG (rosa). Ciò provoca la formazione di uno sferoide dopo 24 ore di incubazione, come illustrato nell'immagine a destra. Scale bar 200 micron.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Spheroid Coerenza dei dati. (A) Distribuzione di diametro di sferoidi misurati da una piastra a 96 pozzetti, ogni punto rappresenta uno sferoide. (B) la distribuzione di frequenza dei diametri mostra normale distribuzione dei dati.
Figura 4. Drug Risposta Spheroids. La vitalità delle cellule MDA-MB-157 sferoidi di cellule di cancro al seno riduce con aumento della concentrazione di cisplatino oltre 1 nM-200 gamma mM. La linea tratteggiata è una misura sigmoidale ai dati redditività.
Figura 5. Co-Cultura Spheroids (a) fluorescente (a sinistra) e contrasto di fase (a destra) le immagini di sferoidi di MDA-MB-157 cellule del cancro al seno (blu) co-coltura con fibroblasti (verde) a 50:. 1 Rapporto. (B) Spheroids di MDA-MB-157 cellule sono mostrati per il confronto. Bar Scala 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Spheroids presentano un modello realistico per capire meglio la fisiologia del tumore e l'efficacia dei farmaci e di fornire uno strumento utile per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. Tali applicazioni potrebbero trarre grandi vantaggi da semplici tecniche di generazione e di manutenzione sferoidale che richiedono solo da laboratorio standard strumenti di gestione dei liquidi e vagliatura. L'uso di un sistema a due fasi acquosa cellule tumorali di aggregati spontaneamente entro la fase goccia permette una produzione efficiente e manutenzione di sferoidi con gestori liquidi robotici, in trattamento farmacologico situ ed analisi finale delle risposte cellulari con reagenti e strumenti commerciali. Così, questa tecnologia è un grande vantaggio rispetto agli approcci esistenti di 3D colture di cellule di cancro e presenta una piattaforma di screening per accelerare la scoperta di farmaci.
Generazione sferoidi uniformi dimensioni all'interno di una piastra micro-bene è fondamentale per le applicazioni di screening ad elevata capacità di garantire un ac cellulare di base similelivello tività in tutti sferoidi. Utilizzando gestori liquidi con un meccanismo di spostamento d'aria pipettaggio, è importante per ottimizzare il processo di erogazione attraverso la quantificazione degli effetti dei parametri di trattamento liquido chiave (erogare altezza, erogare portata, e pre-volume di aria aspirata) sul erogazione della fase acquosa DEX . Questa ottimizzazione consente la testa pipettaggio per spazzare la soluzione fase DEX viscosa e le cellule tumorali nei pozzetti e producono sferoidi omogenei. Anche se i quantitativi specifici per questi tre parametri sono stati determinati nel protocollo per il gestore di liquido SRT Bravo, un approccio analogo dovrebbe essere impiegato con altri gestori di liquidi per determinare le condizioni ottimali di erogazione che si traducono in formato goccia fase DEX coerente erogato nella fase di immersione PEG. Inoltre, è possibile utilizzare 96 puntali e stampare simultaneamente sferoidi in tutti i 96 pozzetti. Ciò tuttavia aumenta notevolmente il numero di cellule necessario per riempire la piastra sorgente con ilfase acquosa contenente cellule DEX. Indipendentemente selezionando approcci stampa colonna-saggio o tutta-piastra, è fondamentale per mescolare il contenuto della piastra sorgente prima della fase di aspirazione. Questo assicura che la sospensione cellulare in fase densa DEX è omogenea e riduce le variazioni nelle dimensioni delle sferoidi.
Diversi studi dimostrano che sferoidi di cellule di cancro imitano diverse proprietà chiave di tumori avascolari quali morfologia e diffusione limitazioni di reagenti; di conseguenza, essi presentano un modello fisiologicamente rilevanti per valutare l'efficacia di nuovi composti e convenzionali contro le cellule tumorali rispetto a colture cellulari monostrato tradizionali. 8,17,18,21,23,37 Si dimostra che l'approccio sistema bifase acquosa per produrre sferoidi permette comodamente screening di farmaci nello stesso piatto, semplicemente aggiunta e il rinnovo di un composto di droga in momenti desiderati e lo screening automatizzato di vitalità cellulare utilizzando un lettore di micro-piastra standard. Questoè un grande vantaggio rispetto tecniche come gocce appesi che richiederebbero trasferimento sferoidi ad una piastra standard per l'analisi delle risposte cellulari ai farmaci. 21 Inoltre, è noto che le cellule di supporto nel microambiente tumorale e le loro interazioni con le cellule tumorali sono implicati in diversi fenotipi di cellule tumorali maligne. 33-35,38,39 quindi la capacità di generare sferoidi co-coltura di cancro e cellule stromali utilizzando la tecnologia acquosa a due fasi sarà aiutare a valutare l'influenza delle cellule di supporto del microambiente tumorale sulle risposte di cancro cellule a vari trattamenti. L'esperimento co-coltura eseguita in questo studio serve come concetto prova di che questa tecnologia può generare successo sferoidi contenenti cellule tumorali e cellule stromali. Studi futuri potranno sfruttare questa capacità e indagare le caratteristiche differenziali di sferoidi mono e co-coltura come la proliferazione e droga risposte. Inoltre, questoLa tecnologia offre una piattaforma per imitare più da vicino l'in vivo microambiente tumorale includendo altri componenti stromali del modello di tumore. 40
In sintesi, questo protocollo permette formazione spontanea di sferoidi in piastre a 96 pozzetti senza usare qualsiasi forza esterna. Adattare la tecnica per un gestore liquido robotica migliora la velocità e l'efficienza della produzione sferoide in un formato standard elevato throughput. La compatibilità della tecnologia di imaging con commerciale e saggio analizza piattaforme permette di utilizzare diversi strumenti disponibili in laboratori accademici e industriali. Per le applicazioni future, questo protocollo razionalizzerà screening di farmaci con colture di cellule di cancro 3D una tecnica di routine. Inoltre, questo approccio può essere facilmente modificato per formare sferoidi di diverse dimensioni, diversi tipi di cellule differenti combinazioni di cellule tumorali e stromali in sferoidi co-coltura, e essere scalata a resa maggiore piastre micro pozzetti to accelerare ulteriormente lo screening farmaco anti-cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
References
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
