The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.
Fortsat fremgang i pluripotente stamcelle kultur lukker hullet mellem bænk og bedside for at bruge disse celler i regenerativ medicin, lægemiddelforskning og sikkerhed test. For at fremstille stamceller afledt Biopharmaceutics og celler til vævsmanipulering og transplantation, en omkostningseffektiv celle-produktionsteknologi er afgørende. Vedligeholdelse af pluripotens og stabile præstationer af celler i downstream-applikationer (f.eks celledifferentiering) over tid er altafgørende for stor skala celle produktion. Men det kan være vanskeligt at opnå, især hvis celler dyrkes manuelt, hvor operatøren kan introducere betydelig variabilitet samt være uoverkommeligt dyrt at skalere op. At muliggøre high-throughput, storstilet stamcelle produktion og fjern operatør påvirkende roman stamcelle kultur protokoller ved anvendelse af en bench-top multi-kanal væske håndteringsrobot blev udviklet, der kræver minimal tekniker involvering eller erfaring. Meddisse protokoller humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) blev dyrket i fødefri betingelser direkte fra en frossen stamopløsning og opretholdt i 96-brønds plader. Afhængig af cellelinje og ønskede skala-up rate, kan operatøren nemt bestemme, hvornår de skal passage baseret på en serie af billeder, der viser de optimale koloni tætheder for opdelingen. Så de nødvendige reagenser er parat til at udføre en koloni split til nye plader uden centrifugering. Efter 20 passager (~ 3 måneder), vedligeholdes to IPSC linjer stabile karyotyper udtrykt stamceller markører, og differentieret i cardiomyocytter med høj effektivitet. Systemet kan udføre efterfølgende high-throughput screening af nye differentiering protokoller eller genetisk manipulation designet til plader med 96 brønde. Denne teknologi vil reducere arbejdskraft og teknisk byrde at producere store antal af identiske stamceller til et utal af applikationer.
Anvendelse af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er steget betydeligt siden deres afledning i 2007 1 Ved afprøvning regenerativ medicin og sygdom modellering 2 – 6. Denne efterspørgsel kommer fra iPSC evne til at give et stort antal pluripotente celler, der kan opdeles i somatiske celler ved en enestående mængde. Som rettet differentiering teknikker forbedrer 7-10 og udvikling af menneskelig celle eller væv modellering og celleterapi stiger 11-14, så gør kravet om masseproduktion af kvalitets iPSCs høj. Det er almindeligt citeret, at blandt andre sygdomme, vil myokardieinfarkt eller b-celle funktionel udskiftning kræver hundreder af millioner til milliarder af iPSC afledte somatiske celler 15-18. Desuden mere komplekse 3D væv modellering for lægemiddelforskning og therapy vil kræve et stort antal celler 9,13,19. I alle disse eksempler, defineret, ensartet og reproducerbare iPSCs skal være tilgængelig og let at producere.
For at fremstille stamceller afledt Biopharmaceutics og celler til vævsmanipulering og transplantation, en omkostningseffektiv celle-produktionsteknologi er afgørende. Skaleret produktion af iPSCs har fokuseret på suspensionskultur 20-25 eller suspension ved anvendelse af mikrobærersystemer substrater 26 – 28 dels fordi disse teknikker med succes er indsat for stor skala, ikke-iPSC, eukaryot baseret produktion. Flere grupper har vist suspension dyrkningssystemer, der giver pluripotente stamceller 20,21,23,24,29. Men disse tilgange udnytter dyre og komplekse systemer ikke let tilgængelige for forskere udvikler nye differentiering programmer, kørsel tissue engineering og gør laboratory skala forskning. Desuden suspension og microcarrier IPSC kulturer kræver tilpasning og teknikker eller kemikalier, som ikke findes i traditionelle klæbende iPSC kultur såsom kontinuerlig brug af Rho-kinase inhibitor, antiskummidler og filtrering at regulere sammenlægning. Fysisk stress til cellerne er mere udbredt i suspensionskultur, blev indført ved mekanisk omrøring såvel som under mikrobærer kollision. Disse spørgsmål begrænser forudsigelighed og hastigheden, hvormed nyligt genererede stamcellelinjer kan dyrkes i suspension. Andre har udviklet robot plade håndteringssystemer, der efterligner plade dyrkningsteknikker 30,31, men disse platforme kræver betydelige investeringer for udstyr og ekspertise til at fungere som supplement til de grundlæggende udfordringer i forbindelse med stamceller kultur.
Følgende arbejde beskriver udviklingen og praksis en skalerbar iPSC kultur, der udnytter en selvstændig, standard 8-kanals robot væskeHandler og plader med 96 brønde. Denne metode er designet til at bygge bro laboratorieskala iPSC kultur og høj volumen iPSC produktion (fx 10 7-1,5 x 10 9 celler pr uge pr tekniker) muliggør dem at udvikle nye IPSC teknologier til nemt skalere op produktion uden store hardware eller arbejdskraft investeringer. Denne fremgangsmåde er relativt billig at sætte op, kræver lidt at ingen stamceller kultur, programmering eller ingeniørmæssig erfaring, har et lille fodaftryk udstyr uden behov for et dedikeret cellekultur hætte, og udnytter standard cellekultur udstyr, således medium til højt gennemløb automatiseret celleproduktion. Målet var at udvikle et system, der kan skalerbar stamceller kultur, der kan udnyttes af laboratorier nye at dæmme cellekultur, dem, der finder manuel dyrkning en barriere for at udvikle deres ideer eller dem, der ønsker en økonomisk overkommelig metode til at producere store mængder af stamceller. Platformen præsenteres her fjerner tekniker indflydelse påstamcelle kultur og normaliserer fodring og passage procedurer for at muliggøre ensartet produktion stamcelle.
I den foreliggende undersøgelse har vi udviklet en fremgangsmåde til robot kultur for iPSC produktion, der miniaturizes og automatiserer fodring og passage i en 96-brønds plade-format og samtidig muliggør effektiv opskalering. En flydende håndtering robot blev brugt til rutinemæssigt fodre IPSC kolonier og passage dem med jævne mellemrum af enzymatisk dissociation. Robotten blev også programmeret til at frembringe ekstracellulær matrix gel overtrukne plader og udføre en seeding densitetsgradient. Når fibroblast og adipøst afledte iPSCs blev dyrket i dette system i mere end 20 passager, omkring 3 måneder, blev pluripotens vedligeholdt, som var stabile karyotyper. Begge cellelinier var i stand til differentiering til cardiomyocytter. Sammen indsamling af protokoller beskrevet her giver brugere med meget lidt stamceller kultur erfaring eller begrænset adgang til specialiseret kultur udstyr til kultur stamceller og opnå en høj produktion celle eller flere linjer håndtering med minimal arbejdskraft og omkostninger.
<p class = "jove_content"> Den robot protokoller beskrevet her tilvejebringe en fremgangsmåde til økonomisk opskalering af iPSC produktion og håndtering. En fordel er skalerbar stamcelle kultur i et etableret plade baseret format demonstreret her og tidligere 44,47 – 49 for at opretholde pluripotens. Mens andre formater af skalerbar stamceller kultur udbytte pluripotente celler 20,23,29 denne plade baseret metode kræver væsentlige ingen ændring i kultur-format, ligesom tilpasning til suspension, brug af skumdæmpende kemikalier eller langvarig brug af Rho-kinase inhibitor 20. Denne plade baseret metode kan derfor hurtigt og forudsigeligt, rumme nye linjer, fordi de dyrkningsbetingelser er ens. Da anvendelsen af iPSCs for sygdomsmodeller øger 4,6,19,50, nye IPSC linjer kontinuerligt genereres. De her beskrevne teknikker er bedst egnet til kultur nye linjer i medium til høj lydstyrke og gennemløb, fordi barriere for overgangen på formatet er low. Dette er også sandt for arbejdskraft og udstyr er nødvendigt for at opretholde kolonierne. Endelig, fordi formatet og håndtering ligner miljøet anvendes til at udlede og validere IPSC linjer, kultur ydeevne, såsom dirigeret differentiering, vil sandsynligvis være mere forudsigelig.Figur 8 illustrerer en strategi for opskalering af stamceller produktion i plader med 96 brønde. Én plade (cyklus 0) anvendes til robotersvejsede pode 12 nye plader, en 12 gange forøgelse (cyklus fra 0 til 1). Efter flere dages fodring, en af de tolv plader er dyrket i flere passager at pode et andet sæt af tolv plader (cyklus 1 til cyklus 2). De resterende elleve plader er nu tilgængelige til andre anvendelsesformål og repræsenterer produktionen komponent i systemet. På denne sats, vil passage af en plade giver 11 plader hver cyklus eller hver 3-4 dage. Denne metodologi kan skaleres mere når flere plader passeres som vist i overgangen fra cyklus 2 til cyklus 3. I cyklus 3, to plader eraltid anvendes til at opretholde kolonien og frø 24 nye plader. De resterende 22 plader er derefter klar til brug efter hver passage cyklus. På ethvert tidspunkt i vedligeholdelsescyklus brugeren kan frø flere plader til at øge produktionen. Et eksempel kunne være at passage hver kolonne for to vækst- cykler. Den første passage omdanner én plade i tolv plader, og hver af de tolv plader anvendes til at pode 144 plader. I dette tilfælde en bruger starter med en plade, og efter to passager, eller omkring 1,5-2 ugers dyrkning, har 144 plader. For eksempel fibroblast og adipose IPSC linjer udbytte ca. 25 til 75.000.000 celler pr plade med 96 brønde når de er klar til passage. 144 plader kunne derfor repræsentere ca. 4-7 x 10 9 celler.
Hvad er arbejdskraft byrde for udførelse 144 96 brønde robot? Et af målene for dette arbejde var skalerbar stamcelle produktion, der reducerede arbejdskraft sammenlignet med traditionel (dvs. 6-brønds plade) stamcelle kultur. Robotten accomplishes dette ved at lette behovet for fysisk at håndtere hver plade under fodring og passage. Mens 96-brønds plade produktions- skalaer lineært ligesom det ville i traditionelle plader med 6 brønde, den tid en tekniker tilbringer arbejde med pladerne er betydeligt mindre ved anvendelse robot kultur. Produktionseffektiviteten af robot kultur er afledt af denne forskel (figur 9). Det blev fundet teknikere kunne fjerne en 6-brønds plade fra inkubatoren, tjek det på mikroskopet, så suge og foder pladen i ca. 3,5 minutter. Til sammenligning teknikere tilbringer ca. 30 sek at fjerne en 96-brønds plade fra inkubatoren og inspicere det på mikroskopet for tæthed og forurening før placere den på robotten. Med et udvidet fodring protokol svarende til den ovenfor beskrevne, kan seks plader med 96 brønde læsses og fodres, som tager ca. 21 min eller 3,5 min pr plade. Den samlede forløbne tid til at fodre en plade er sammenlignelig mellem robotic og manuelle metoder, men til hånd foder 6 plader en tekniker er påkrævet for alle 21 minutter mens teknikeren bruger kun 3 min håndtering af seks plader til robotten (en 30 sek inspektion per plade). Som figur 9 viser, den tid, en tekniker tilbringer håndterer 144 plader ved hjælp af robotten er ca. 1,2 time i modsætning til 8 timer manuelt, og robotten vil aldrig lave en fejl håndtering af pladerne eller overførsel af væsker.
De 96 brønde IPSC dyrkningsmetoder beskrevet her giver en medgørlige platform for komplekse screening opgaver. Da hver brønd er genetisk identisk og podes ved samme densitet fra samme oprindelige pulje, kan variabler fordeles hen over pladen og vedligeholdes af robotten med kommercielt tilgængelige reservoirer at adskille betingelser. Det ville være nyttigt for eksperimenter, såsom vækst stamceller medieudvikling 34,35,47, substrat eller kultur tilstand test og toksicitetsundersøgelser udnytte stamceller51. Da hver stamcellelinje er unik i forhold til optimale koloni størrelse og passage krav, kan man bruge dette system til at modulere podningstæthed, fodring frekvens og håndtering passage ved at manipulere kolonnerne høstet, den mekaniske agitation under passage og fodring frekvens. Iteration gennem disse variabler vil gøre det muligt for brugeren at hurtigt at finde en række betingelser, der er egnede til dyrkning af en ny linje eller udvikle nye dyrkningsteknikker. Robotsystemet er også i stand til at opretholde 96 parallelle men uafhængige stamcellekolonier. Når iPSC er afledt fra somatiske celler eller klonet efter genetisk manipulation, er mange parallelle kloner screenes for at give potentielle IPSC linjer. Når enkeltceller podes i 96-brønds plader, kan dette system foder og passage af de 96-brønds plader holder hver koloni adskilt. Dette muliggør meget højt gennemløb ved valg potentielle kloner og eliminerer vanskelighederne ved fysisk dyrkning 96 parallelle linier. Denne metode også enllows opskaleret produktion af hver klon, således at materialet er let tilgængelige for parallel analyse. Endelig forestiller vi integrere disse dyrkningsteknikker med et robotsystem trafficking plade, der leverer plader til og fra inkubatoren muliggør fuldautomatisk kultur. Dette kunne udføres med mere komplekse robotter der giver mulighed for større ekspansion da de grundlæggende protokoller beskrevet her kan overføres til andre plade baserede systemer.
De første kritiske skridt til at løse i protokollerne er dem, der forhindrer og check for forurening, såsom trin 1,5 og 4,2. Kontaminering, som diskuteret ovenfor, med held kan undgås, hvis god steril teknik og sund fornuft er udnyttet. Det er bydende nødvendigt, uanset stamceller kultur format, at operatøren check for forurening og gør det i denne protokol på de angivne trin vil reducere risikoen for forurening. Korrekt ekstracellulær matrix gel ansøgning er en anden essrentielle skridt til den samlede succes af denne protokol. Uden korrekt overtrækning af plader med 96 brønde, vil stamcellerne ikke vokse. Et fælles problem er ufuldstændig godt overtræk. Erfaringen viser, at luftbobler, elektrostatisk tiltrækning og kapillarvirkning hindre komplet godt belægning. Trinnet forudgående befugtning (1,6) blev udviklet til en væsentlig forbedring brøndbund belægning og bør ikke springes over. Denne præ-befugtende trin synes at reducere den tilsyneladende hydrofobicitet plast plade med 96 brønde, således at når den ekstracellulære matrix gel coating påføres det er jævnt fordelt over godt bund og sider. Det anbefales også at forsigtigt trykke på 96-brønds plader mod en ren hånd engang belagt for at sikre en jævn ekstracellulær matrix gelopløsning distribution. Dissociationen parametre er også vigtigt at optimere. Forlænget inkubation med enzym eller EDTA baseret dissociation reagens vil resultere i enkelte celler, som måske eller måske ikke er målet under passage. Derfor operatørenbør være særlig opmærksom på, hvordan dissociation tid, findeling kraft, og vask gentagelser påvirker koloni morfologi og sundhed og justere i overensstemmelse hermed.
Forståelse af de begrænsninger de teknikker der er beskrevet her, er altafgørende for en vellykket operation. Som i enhver anden cellekultur indstilling, anvendelse af 96-brønds plader viser en relativt høj risiko forurening. Som beskrevet ovenfor er en tekniker er håndtering hver plade under fodring og passage; for eksempel, når du åbner låget, at sætte pladen på robotten seng, og kontrol af pladen på mikroskopet. Som bemærket efter trin 1.5, er derfor bydende nødvendigt ikke at røre indersiden af enhver plade låg eller udsætte denne del til en potentielt kontamineret overflade såsom de skrå varme blokke eller lodrette ben på sengen. Under protokol udvikling denne begrænsning blev opdaget og var drivkraften til at udvikle et rack til at holde plade låg for at opretholde sterilitet. Ligeledes trough reservoirer, pipettespidser og other forsyninger på væskehåndtering robot seng er potentielle kilder til forurening, fordi de er åbne over for miljø og håndteres af teknikeren. Derfor bør god steril teknik anvendes såsom at reducere bevægelser i løbet af eksponerede kultur materialer eller åbne væsker. En anden begrænsning er, at når protokollen er opskaleres, visuelt kontrollere hver brønd i> 100 plader med 96 brønde er besværlig. Dette kan behandles ved visuelt at inspicere hele pladen for tegn på forurening, såsom uklare medier, for at identificere mistænkelige brønde. Til fremtidig opskalering, vil anvendelse af et automatiseret mikroskop og indikator for cellevækst og potentiel kontaminering inkorporeres.
Sammenfattende high-throughput 96-brønds baseret platform her beskrevne tilbyder en reproducerbar, high fidelity fremgangsmåde til stamcelle kultur og produktion i en plade format. Denne metode reducerer den nødvendige erfaring, nødvendige udstyr og arbejdstid dedikeret til stamceller kultur, mensfastholde fordelene ved traditionelle klæbende kultur.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er delvist understøttet af NIH tilskud, R44 GM087784 og R01 HL109505. Forfatterne takker de tekniske og OEM team på Gilson, INC for udvidet teknisk support.
96-well plates | Corning | 3596 | 96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped |
Seahorse Trough | SeahorseBio | 201308-100 | Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs |
Gilson Tips | Gilson | F167023 | 10 racks gilson 96tips D200 tips |
DMEM/F12 | Life Technologies | 12500062 | DMEM/F12 powder. Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter. |
Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 354230 | Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 mL |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 5857 | mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance. |
E8 Media | StemCell Technologies | 5940 | TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance |
Y27632 | AdooQ BioScience | A11001-50 | Rock inhinitor Y-27632 2HCI |
Accutase | Innovative Cell Technologies | ACCUTASE | Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 mL sterile cell solution |
PBS | Fisher | SH30256FS | PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk |
Gilson PIPETMAX | Gilson | PIPETMAX | http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk |