Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Schaalbare 96 putjes plaat Based iPSC Culture and Production Met een Robotic Liquid Handling System

Published: May 14, 2015 doi: 10.3791/52755
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1InvivoSciences, Inc., 2Gilson, Inc.

Abstract

Vervolg vooruitgang in pluripotente stamcellen cultuur wordt de kloof tussen de bank en bed voor het gebruik van deze cellen in de regeneratieve geneeskunde, drug discovery en het testen van de veiligheid. Om produceren stamcellen afgeleide biofarmaceutica en cellen voor weefselregeneratie en transplantatie, een rendabele cell-productietechnologie noodzakelijk. Onderhoud van pluripotentie en stabiele prestaties van de cellen in downstream-toepassingen (bijvoorbeeld celdifferentiatie) over de tijd is van cruciaal belang voor grootschalige cel productie. Maar die moeilijk te bereiken vooral als cellen handmatig worden gekweekt waarin de exploitant aanzienlijke variabiliteit introduceren en onbetaalbaar duur opschaling. Om high-throughput, grootschalige stamcel productie mogelijk te maken en te verwijderen operator invloed roman stamcellen cultuur protocollen met behulp van een bench-top multi-channel vloeistof handling robot ontwikkeld die minimale technicus betrokkenheid of ervaring nodig. MetDeze protocollen humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) werden gekweekt in voedingsvrije van directe uit een bevroren voorraad en onderhouden in 96-wells platen. Afhankelijk van de cellijn en de gewenste schaal-up rate, kan de operator eenvoudig bepalen wanneer passage gebaseerd op een reeks van beelden met de optimale kolonie dichtheden voor de splitsing. Dan is de noodzakelijke reagentia bereid zijn om een ​​kolonie splitsen om nieuwe platen te voeren zonder centrifugeren stap. Na 20 passages (~ 3 maanden), twee iPSC lijnen gehandhaafd stabiele karyotypes, uitgedrukt stamcel markers en gedifferentieerd in hartspiercellen met een hoog rendement. Het systeem kan daarop high-throughput screening van nieuwe differentiatie protocollen of genetische manipulatie ontworpen voor 96 putjes uitgevoerd. Deze technologie zal de arbeid en technische lasten grote aantallen identieke stamcellen voor een groot aantal toepassingen.

Introduction

Het gebruik van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) heeft sinds hun afleiding aanzienlijk gestegen in 2007 1 voor verbinding testen, regeneratieve geneeskunde en de ziekte modelleren 2-6. Deze eis komt uit iPSC vermogen om grote aantallen van pluripotente cellen die kunnen worden onderscheiden in somatische cellen op een ongekende hoeveelheid verkregen. Zoals geleid differentiatie technieken te verbeteren 7-10 en de ontwikkeling van de menselijke cel of weefsel modelleren en celtherapie verhoogt 11-14, neemt ook de eis voor de massa-productie van hoogwaardige iPSCs. Algemeen wordt aangehaald dat naast andere ziekten, myocardiaal infarct of B-cel functionele vervanging honderden miljoenen verlangen miljarden iPSC afgeleide somatische cellen 15-18. Bovendien, steeds complexere 3D weefsel modellering voor drug discovery en therapy zullen grote aantallen cellen 9,13,19 eisen. In al deze voorbeelden gedefinieerd, uniform en reproduceerbaar iPSCs moet beschikbaar en eenvoudig te produceren.

Om produceren stamcellen afgeleide biofarmaceutica en cellen voor weefselregeneratie en transplantatie, een rendabele cell-productietechnologie noodzakelijk. Geschaalde productie iPSCs is gericht op suspensiekweek 20-25 of suspensie met behulp van microdrager substraten 26-28 mede omdat deze technieken met succes toegepast voor grootschalige, non-iPSC eukaryote gebaseerde productie. Verschillende groepen hebben suspensiecultuur systemen die pluripotente stamcellen 20,21,23,24,29 opbrengst aangetoond. Echter, deze benaderingen te gebruiken dure en complexe systemen niet direct beschikbaar voor onderzoekers ontwikkelen van nieuwe differentiatie programma, rijden tissue engineering en het doen van Laboratory grootschalig onderzoek. Bovendien, schorsing en microdrager iPSC culturen moeten worden aangepast en technieken of chemicaliën niet gevonden in de traditionele aanhangend iPSC cultuur zoals continue gebruik van Rho-kinase remmer, antischuimmiddelen en filtratie om aggregatie te reguleren. Fysieke belasting van de cellen vaker in suspensiekweek, die door mechanisch roeren en tijdens microdrager botsing. Deze problemen beperken de voorspelbaarheid en snelheid waarmee nieuw gegenereerde stamcellijnen kunnen worden gekweekt in suspensie. Anderen hebben plate handling robot systemen die plaat kweektechnieken 30,31 nabootsen ontwikkeld, maar deze platformen vereisen aanzienlijke investeringen voor apparatuur en deskundigheid om in aanvulling op de fundamentele uitdagingen van stamcelcultuur.

De volgende werkzaamheden beschrijft de ontwikkeling en de praktijk van een schaalbaar iPSC cultuur systeem dat een op zichzelf staand, standaard 8-kanaals robot maakt gebruik van vloeibarehandler en 96-well platen. Deze methode werd ontworpen om laboratoriumschaal iPSC cultuur en high-volume iPSC productie te overbruggen (bijvoorbeeld 10 7-1,5 x 10 9 cellen per week per technicus), waardoor die de ontwikkeling van nieuwe technologieën iPSC om eenvoudig opschalen productie zonder grote hardware of arbeid investeringen. Deze werkwijze is betrekkelijk goedkoop te installeren, vereist weinig tot geen stamcelkweek, programmering of techniekervaring, heeft een kleine footprint materiaal zonder dat een specifieke celkweek kap en gebruikt standaard celkweek apparatuur gemiddelde tot hoge doorvoer geautomatiseerde inschakelen cel productie. Het doel was om een ​​systeem dat in staat schaalbare stamcel cultuur die kan worden gebruikt door laboratoria nieuw voor celcultuur voort te ontwikkelen, degenen die vinden handleiding teelt een belemmering voor de ontwikkeling van hun ideeën of degenen die een economisch middel om grote aantallen stamcellen te produceren. De hier gepresenteerde platform verwijdert technicus invloed opstamcel cultuur en normaliseert de voeding en de passage procedures om consistente stamcellen productie mogelijk te maken.

Protocol

De robot vloeistofverwerkingsysteem, waarbij de volgende protocollen was Gilson pipetmaX, vergemakkelijkt geautomatiseerde, schaalbare stamcelkweek en productie behoud traditionele voorwaarden adherente cultuur in de 96-well plaat formaat. Net als de traditionele 6-well plaat cultuur iPSCs gekweekt met dit protocol als monolaag afzonderlijke kolonies maar in de 96-well plaat formaat. Elk goed kan isogene of verschillende zijn en ofwel configuratie kan worden gekweekt in parallel, omdat de robot kunnen houden elkaar goed gescheiden. De typische robot iPSC cultuur routine heeft twee fasen: een voedingsprogramma, waar culturen worden gevoed op een klantgerichte schema en een passage programma waar de gebruiker de dissociatie werkwijze en splitsverhouding daardoor seeding dichtheid en omvang snelheidsregelend kiest. De volgende protocollen beschrijven hoe een nieuwe cultuur wordt gestart, hoe voeding en passage worden bereikt en de aanvullende programma's die iPSC cultuur te vergemakkelijken.

1. Voorbereiden van extracellulaire matrix Gel Coated 96-well platen

  1. Verwijder het verpakkingsmateriaal uit zes nieuwe, RT 96-well platen en plaats ze op de vloeistofverwerking robot bed in de posities 2, 3, 5, 7, 8, 9 (zie Figuur 1A bed posities).
  2. Plaats een pre-gekoelde, 4 ° C 4-goed dieptepunt in bed positie 6.
  3. Load kolom 12 van de punt rek bedpositie 1 met voorgekoeld, 4 ° C 200 pi pipet tips.
  4. Vul het eerste (links meeste) trog goed in bed positie 6 met 25 ml 4 ° C DMEM / F12 door het gieten van een hoeveelheid met behulp van steriele techniek. Alternatief, gebruik dan een pipet om de overdracht te voltooien.
  5. Verwijder de 96-wells plaat deksels en schuif elk in de speciaal ontworpen plaat deksel houden rack (PLHR, zie Figuur 1A). Contact te vermijdenmet binnenkant plaat deksels.
    Opmerking: Behandeling de binnenzijde van een plaat deksel of de plaat stapelen deksels waarbij de binnenkant van een deksel raakt buiten andere een uitstekende route op vervuiling.
  6. Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende reeks knoppen om het goed pre-wetting te starten:
    1. Tik "Voer een protocol".
    2. Selecteer "extracellulaire matrix gel Prewet" en tik op Volgende.
    3. Gebruiker beslissing: Tik "test run" om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma.
      Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, "skip setup" is acceptabel.
    4. Tik op "Run Protocol".
  7. Tijdens de pre-bevochtigende (stap 1,6) voortgaan met stap 1.8.
  8. Dooi op ijs één 4 mg aliquot groeifactor verminderde extracellulaire matrix gel (GFRM) in een 50 mlconische buis bewaard bij -80 ° C. Houd het monster op ijs pas klaar voor gebruik.
    Opmerking: De GFRM stollen indien toegestaan ​​tot kamertemperatuur te komen en niet nuttig.
  9. Resuspendeer de 4 mg GFRM aliquot in 24 ml 4 ° C DMEM / F12 met 25 ml glazen pipet. Bij het overbrengen van de DMEM / F12, pauze voor 2-3 sec om de pipet te koelen voorafgaand aan de GFRM monster resuspenderen.
  10. Wanneer de pre-bevochtiging proces (stap 1.6) is voltooid, verder met stap 1.11.
  11. Breng de 24 ml DMEM / F12 GFRM mengsel aan de vierde bron van de trog in bed positie 6.
  12. Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende reeks knoppen om de extracellulaire matrix gel-coating proces te starten:
    1. Tik "Voer een protocol".
    2. Selecteer "extracellulaire matrix gel monster" en tik op Volgende.
    3. Gebruiker beslissing: Tik "test run" om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma.
      Opmerking: De robot loopt niet, maar Rather de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, "skip setup" is acceptabel.
    4. Tik op "Run Protocol".
  13. Bij stap 1.12 is voltooid, vervangt de plaat deksels.
  14. Breng de extracellulaire matrix gel gecoate 96-well platen met een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator Houd er 24 uur waarna de platen klaar voor gebruik of opgeslagen wordt.
    Opmerking: Onder verzachtende omstandigheden kan de nieuw beklede extracellulaire matrix gel platen worden na 15-30 min incubatie maar O / N bij 24 uur incubatie wordt aanbevolen.
  15. Herhaal protocol stappen 1,1, 1,3, 1,5-1,6, 1,10, en 1,12-14 totdat alle DMEM / F12 met GFRM gebruikt.

2. opslaan extracellulaire matrix Gel Coated 96-well platen

  1. Verwijder extracellulaire matrix gel beklede 96-putjesplaten van de 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator.
  2. Optioneel: Allow de extracellulaire matrix gel gecoate 96-well platen tot kamertemperatuur komen alvorens tot stap 2,3.
    Opmerking: Deze optionele stap vermindert condenswater wanneer de platen worden geplaatst bij 4 ° C.
  3. Plaats de platen op de vloeistofverwerking robot bed in de posities 2, 3, 5, 7, 8, 9 (zie Figuur 1A bed posities).
  4. Load kolom 12 van de tip rek in bed stand 1 met RT 200 ul pipet tips.
  5. Plaats een vier dieptepunt reservoir in bed positie 6.
  6. Vul ook 4 (meest rechtse) van het reservoir met RT DMEM / F12.
  7. Verwijder de 96-well plaat deksel en schuif elk in de PLHR.
  8. Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen:
    1. Tik "Voer een protocol".
    2. Selecteer "extracellulaire matrix gel monster" en tik op Volgende.
    3. Gebruiker beslissing: Tik "test run" om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma.
      Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, "skip setup" is acceptabel.
    4. Tik op "Run Protocol".
  9. Eenmaal voltooid, vervangt de plaat deksels en verwijder de platen uit de machine bed.
  10. Wikkel rond het gehele zijde van elk extracellulaire matrix gel beklede 96 putjes (waarbij het deksel aan de plaat) met een een inch bij 6 inch paraffine film strip. Zorg ervoor dat de paraffine film om een ​​luchtdichte afdichting te creëren rekken.
  11. Optioneel: Label de borden met de datum van de voltooide extracellulaire matrix gel coating, de extracellulaire matrix gel lotnummer, gebruikersnaam en alle andere informatie.
  12. Bewaar de platen bij 4 ° C wanneer ze goed te gebruiken gedurende twee weken niet.
    Opmerking: Platen met succes gebruikt buiten de grens van twee weken, wordt echter niet aanbevolen.

3. Het uitvoeren van een Stem Cell Colony zaaien DichtheidGradiënt in de 96-well plaat formaat van een live of bevroren Cultuur: Hoe te beginnen of herstel van de normale Passage intervallen een stamcellijn

  1. Als beginnend met een bevroren cultuur, ga dan naar stap 3.2. Als beginnend met een live stamcel cultuur al op een bord, begint u bij stap 3.5.
  2. Ontdooi de bevroren cultuur door zwenken de buis in een 37 ° C waterbad tot slechts een klein stuk ijs blijft.
  3. Optioneel: Verdun de ontdooide cellen in 10 ml rt stam celgroei medium (SCGM), centrifugeer gedurende 2 min bij 300 xg, zuig de supernatant media en resuspendeer de pellet stamcellen in 7 ml vers SCGM bevattende 10 uM Y27632.
    Opmerking: Deze stap elimineert overdracht van de bevriezing media.
  4. Ga verder met stap 3.6.
  5. Als ab levende reeds geplateerd stamcellen: passage cellen normaal gebruik van enzymatische of niet-enzymatische dissociatie. Probeer een totaal van 1,5-3.000.000 cellen te oogsten; gewoonlijk een putje van een zes-puts plaat. Centrifugeer de geoogste cellen2 min bij 300 xg, zuig het supernatant media en resuspendeer de stamcellen pellet in 7 ml verse SCGM met 10 uM Y27632. Ga verder met stap 3.6.
  6. Zorg ervoor dat de cellen, ofwel van een bevroren of levende cultuur worden gesuspendeerd in 7 ml RT SCGM met 10 uM Y27632.
  7. Load kolom 12 van de tip rek in bed staat een met RT 200 ul pipet tips.
  8. Plaats een vier dieptepunt reservoir in bed positie 2.
  9. Plaats een nieuwe extracellulaire matrix gel gecoate 96-well plaat voorverwarmd tot 37 ° C in bed positie 5 en verwijder het deksel te plaatsen in de PLHR.
  10. Breng de 7 ml geresuspendeerde cellen om goed 3 van het reservoir door de pipet of steriel giet.
    1. Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen:
    2. Tik "Voer een protocol".
    3. Selecteer "Seeding Density Gradient" en tik op Volgende.
    4. Gebruiker beslissing: Tik "test run" om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test van de selected programma.
      Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, "skip setup" is acceptabel.
  11. Tik op "Run Protocol".
  12. Wanneer de verdunningsreeks voltooid, opnieuw bedekken de plaat en in een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator tot de volgende voeding.
  13. Optioneel: Label de plaat met de datum, de stam gegevens, gebruikersnaam, het type media en andere relevante informatie.
  14. In de komende paar dagen, voeden de 96-well plaat zoals vereist het gebruik van Protocol 4 hieronder.
    Opmerking: Een typische stamcel plaat zal een volledige media verandering nodig eenmaal per 24 uur en de SCGM niet Y27632 voor het voeden bevatten; Alleen tijdens de eerste passage na zaaien. Voorafgaand aan het voeden, controleren de plaat voor vervuiling en kolonie dichtheid. Zie stap 3.16 voor meer over de controle kolonie dichtheid.
  15. In de komende dagen, een aantal kolommen in de buurt van het cinvoeren van de plaat (gewoonlijk kolommen 5-8) een ideale dichtheid voor het doorlaten te benaderen; om deze dichtheid identificeren vergelijken 96-putjesplaat de densiteitbereik figuur 3B de volgende informatie in gedachte:
    1. Passage wanneer de ruimte tussen de meerderheid van de kolonies ongeveer 25% van aangrenzende kolonie diameter.
      Opmerking: De reden om de tijd te identificeren passage is dat een andere cyclus van voederen en groei zou leiden tot kolonies contact maken, moet worden voorkomen.
  16. Om een ​​uniform verdund bord te starten en te beginnen regelmatig cultuur, selecteert u een kolom die is op de ideale dichtheid en passage. Zie Protocol 5 tot passage.

4. Feeding 96 putjes plaat Stem Cell Kolonies

Opmerking: Het volgende protocol beschrijft het voeden van een 96-well stamcellen kolonie plaat. De techniek kan worden opgeschaald tot 6 totale platen parallel tegemoet.

  1. Verwijder de 96-well stem celkolonie plaat boven de 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator.
  2. Controleer de plaat voor vervuiling en celdichtheid. Om te voeden, opdat de kolonie dichtheid dan het ideale passage dichtheid. Zie figuur 3B voor informatie over de dichtheid.
    Opmerking: Besmetting kan als troebele media te presenteren en worden begeleid door een onaangename geur. Kleine, uiteraard niet-iPSC aggregaten kan ook zichtbaar onder microscopische inspectie. Om celdichtheid evalueren, zie stap 3.16.1 hierboven.
  3. Plaats de 96-well stamcellen kolonie plaat in bed positie 3 op een hellend, 37 ° C helling.
  4. Load kolom 12 van de tip rek in bed stand 1 met RT 200 ul pipet tips.
  5. Plaats een 4-goed dal in bed positie 2.
  6. Vul ook 3 van de trog in bed positie 2 met 8 ml verse, RT SCGM zonder Y27632 hetzij door steriele gieten of pipet overdracht.
  7. Verwijder de 96-well stamcellen kolonie plaat deksel te plaatsen in de PLHR.
  8. De ... gebruikenrobot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen:
    1. Tik "Voer een protocol".
    2. Selecteer "Colony Feed One Plate 'en tik op Volgende.
    3. Gebruiker beslissing: tik "test run" om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma.
      Let op, de robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, "skip setup" is acceptabel.
    4. Tik op "Run Protocol".
  9. Wanneer de voeding protocol is voltooid, opnieuw betrekking op de 96-well plaat stamcellen kolonie en terugkeert naar 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator tot de volgende voeding of passage vereist. Dit is meestal nodig na 24 uur.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om het voederen evenement op de plaat deksel met de datum, het type media, gebruikersnaam en andere relevante informatie vast te leggen.

5. Passage 96-well Platen Stem Cell Colonies

  1. Na enkele voeden cycli de 96-well stamcellen kolonie plaat klaar om doorgang zal zijn. Dit protocol beschrijft passage van de ene kolom naar een 96-well plaat, wat een 1:12 splitsingsverhouding. De gebruiker kan de splitsingsverhouding omschrijven en elk aantal putjes of kolommen te splitsen, waaronder het kiezen putten die niet aangrenzend zijn.
  2. Vergelijk de 96-well plaat stamcellen kolonie dichtheid naar figuur 3B te bepalen of passage. De ideale passage dichtheid wanneer de ruimte tussen de meeste kolonies ongeveer 25% van aangrenzende kolonie diameter of latere voederen en daarbij de kolonies groeien tot elkaar.
  3. Onderzoek de 96-well stamcellen kolonie plaat onder een microscoop om te zorgen dat er geen besmetting.
  4. Plaats de 96-well stamcellen kolonie plaat in bed positie 3 op een hellend, 37 ° C helling.
  5. Load kolommen 8-12 in de tip laden rek in bed stand 1 met RT 200 ul pipettips.
  6. Plaats een 4-goed dal in bed positie 2.
  7. Laat trog goed 1 leeg is, zet 8,5 ml SCGM + 10 uM Y27632 in zowel 2, zet 3,5 ml 30% proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens (of EDTA gebaseerd dissociatie reagens) in een goed 3, zet 4,5 ml PBS in een goed 4.
    Opmerking: Alle reagentia kunnen bij kamertemperatuur of 37 ° C. RT proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens bij 30% verdund met PBS werd gebruikt voor de vet- en fibroblast afgeleide iPSC kweek beschreven.
  8. Plaats een nieuwe, voorverwarmd 37 ° C extracellulaire matrix gelgelaagde 96-putjesplaat in bedpositie 5.
  9. Verwijder de 96-well plaat stamcellen kolonie deksel en de nieuwe 96-well plaat deksel en plaats ze zowel de PLHR.
  10. Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen:
    1. Tik "Voer een protocol".
    2. Selecteer "Colony Split 01:12 Column 1" en tik op Volgende.
    3. Gebruiker beslissing: Tik "test run" te gebruikende stap-voor-stap wizard om pre-test het geselecteerde programma.
      Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, "skip setup" is acceptabel.
    4. Tik op "Run Protocol".
  11. Zodra de passage protocol is voltooid, RE-COVER beide platen.
  12. Optioneel: Label de nieuwe plaat met de vereiste informatie (dat wil zeggen, datum, cellijn, passage nummer, het type media, gebruikersnaam etc.).
  13. Terug beide platen naar 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator tot de volgende voeding of passage vereist. Opmerking: De volgende voeding is meestal na 24 uur.
    Opmerking: De cellen en kolonies moet hechten aan de plaat binnen 2-3 hr splitsen en zien er erg verspreid. Dit komt door de aanwezigheid van Rho-kinase remmer en de cellen condenseert en vertonen karakteristieke stamcel morfologie (bijv geplaveide verpakt kolonies with kleincellige volume te grote kern ratio) na de eerste Rho-kinase remmer vrij voeden.

6. Oogst 96-well plaat stamcellen voor productie

Opmerking: Stamcel kolonies kunnen voor gebruik op enig moment tijdens de cultuur worden geoogst. Meestal gebeurt dit wanneer de cellen zijn klaar om passage (zie protocol 5). Dit protocol wordt beschreven hoe elf kolommen oogsten uit een 96-well plaat stamcellen kolonie.

  1. Onderzoek de 96-well stamcellen kolonie plaat onder een microscoop om te zorgen dat er geen besmetting.
  2. Plaats de 96-well stamcellen kolonie plaat in bed positie 3 op een hellend, 37 ° C helling.
  3. Load kolommen 11 en 12 in de top geladen rek in bed stand 1 met RT 200 ul pipet tips.
  4. Plaats een 4-goed dal in bed positie 2.
  5. Laat trog goed 1 leeg is, zet 8,5 ml SCGM in zowel 2, zet 3,5 ml 30% proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens (of EDTA gebaseerd dissociatie reagens) in een goed3, zet 4,5 ml PBS in een goed 4.
    Opmerking: Alle reagentia kunnen bij kamertemperatuur of 37 ° C.
  6. Verwijder de 96-well stamcellen kolonie plaat deksel en plaats in de PLHR.
  7. Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen:
    1. Tik "Voer een protocol".
    2. Selecteer "Colony Harvest Kolommen 2-12" en tik op Volgende.
    3. Gebruiker beslissing: Tik "test run" om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma.
      Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, "skip setup" is acceptabel.
    4. Tik op "Run Protocol".
      Opmerking: Zodra de collectie is voltooid, zullen de cellen in trog goed 2 en klaar voor de inzameling.

Representative Results

Ontwikkeling van een plaat gebaseerde robot stamcellen cultuur platform.

De vraag naar iPSCs groeit als gevolg van hun nut in de ontwikkeling van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. Toch schaalbare productie is gericht op suspensiecultuur 32 in relatief complexe apparatuur die veel onderzoekers uitsluit en afwijkt van gevestigde aanhangend kweekmethoden. Eerder dan bewezen plaat gebaseerd stamcellen celcultuur methoden, zoals overschakelen naar een schorsing cultuur of met behulp van een microdrager drastisch veranderen, hebben we ons gericht op de miniaturisering en het automatiseren van onze bestaande aanhangend iPSC kweektechnieken. Het hoofddoel was automatiseren voeding en passeren van de gehele kweekproces normaliseren. Een platform die snel opschaling bestaande technologie werd ook vereist. Om deze doelstellingen een methode ontwikkeld om de cultuur stamcellen in een 96-well plaat met behulp van een geautomatiseerd vloeistofverwerkingsysteem (figuur 1) te bereiken. De protocols hier ontwikkeld met de liquid handling robot voor het voeden en passage niet een centrifugatiestap of continue controle door een technicus nodig. Deze protocollen werden ontwikkeld met twee voedingsvrije iPSC lijnen; één afgeleid van fibroblasten en de ander van vetcellen 33.

De computergestuurde vloeistofverwerkingsysteem (figuur 1A) bestaat uit een flatbed die voor en achter beweegt. Het bed heeft negen, ongeveer 5 x 3,3 inch genummerde uitsparingen met druk clips behoud van de standaard celkweek platen, vloeibare reservoirs en andere aangepaste hardware te accepteren. De pipet kop beweegt van links naar rechts (loodrecht op bed beweging) en op en neer. Samen met het bed, kan de pipet hoofd worden geprogrammeerd om te verwijderen of te leveren overal op het bed media na het oppakken van pipet tips van een hervulbare rek. Eventueel kan elk van de 96-wells gescheiden gehouden om kruisbesmetting te elimineren. In deze configuratie, 0 tot200 ul van de media kan worden verplaatst door elk punt van de pipet hoofd, maar ook andere volume bereiken zijn mogelijk op basis van tip grootte.

Bij passage stamcellen in standaard platen, enzymatische of chemische dissociatie vereist normaliter incubatie bij 37 ° C. Initiële testen bevestigd dissociatie met proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens of EDTA gebaseerde reagens beter presteerden bij 37 ° C KT zowel de tijd tot dissociatie en homogeniteit van koloniegrootte geproduceerd voor onze twee 96-well iPSC lijnen (gegevens niet getoond). Om de splitsing proces te automatiseren en te voorkomen dat het verplaatsen van platen in en uit een incubator, hellende, temperatuurgecontroleerde hellingen die te accepteren en reproduceerbaar te positioneren standaard kweekplaten werden gebouwd (Figuur 1A). Wanneer de opritten 37 ° C, een proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens of EDTA gebaseerd dissociatie van de iPSCs van 96-well platen werden verhit was vergelijkbaar met platen geplaatst in een 37 ° C incubator (data not getoond). De hellende hellingen werden gebruikt om pipet tips in staat om de inhoud van een hele put (minder dan 5 uL restvolume) verzamelt door het laagste punt van de put terwijl aspiratie bereiken van een vlakke plaat hebben een restvolume van ongeveer 10-15 pl, resulterend in cel verlies. De schuine hellingbaan ook toegestaan ​​de putjes worden gewassen (getritureerd) van het uitwerpen media bovenin de put hellende en te verzamelen op de bodem.

Robotic kweek van stamcellen in de 96-well plaat formaat; voeden en passage.

Cultuur van iPSCs met behulp van de robot liquid handling systeem heeft twee fasen; passage en voeding. Wanneer een kolonie direct passage wordt gesplitst op een vooraf bepaalde verhouding om een nieuwe plaat, die vervolgens wordt toegevoerd regelmatig zaad tot het klaar voor passage opnieuw (Figuur 1B). Bevroren of niet-96-well cultures gestart worden in de 96-well formaat en onmiddellijk in de doorgang / voedingcycle. Cellen die niet worden gebruikt om de kolonie, die de meerderheid van een plaat behouden, geoogst voor andere doeleinden en vertegenwoordigen de productie component van dit systeem.

Feeding 96-well gekweekte iPSCs is volbracht wanneer sommige of alle van de media wordt verwijderd na een periode van cultuur en gestort in een afvalreservoir. Dan verse media hoeveelheden verdeeld op dezelfde plaat. De robot kan nieuwe tips en media dalen gebruiken om elk goed te scheiden voor volledig klantgericht voeden, met inbegrip van het mengen van geconditioneerde media met nieuwe media.

Typische passage van stamcellen is een werkwijze voor dissociatie en vaak centrifugatiestap. De hier beschreven protocollen beoogt dissociatie normaliseren en te elimineren centrifugatie. De passage protocol begint wanneer de robot levert dissociatie reagens 96-well platen gemonteerd op 37 ° C hellende hellingen. Na een vooraf ingestelde tijd, worden de gescheiden cellen verzameld met een wasmachine actie waar de gebruiker heeft control over de positie, de herhaling, volume, en trituratie tarief. Enzyme tijd, aanwrijven rate en het aantal verwrijving herhalingen waren voldoende om los kolonie grootte en homogeniteit (figuur 2) variëren, maar elke parameter is instelbaar aan de eisen van een bepaalde cel lijn past. Deze controle verwijdert variabiliteit geïntroduceerd door technici die pipet met verschillende tarieven, posities, en herhalingen. Zodra de gedissocieerde cellen verzameld en samengevoegd in een reservoir met vers medium, worden ze geleverd aan een nieuwe plaat. Om centrifugeren en zaaien problemen van substraat degradatie of celdood ten gevolge van acties enzym te vermijden, werd dissociatie reagens verdund tot het minimum punt van aanvaardbare dissociatie dat resulteerde in betrouwbare zaaien. Deze techniek was effectief voor een proteolytisch en collagenolytische dissociatie reagens in mTeSR1 medium 34, die een relatief hoog eiwitgehalte heeft, maar ook effectief in lage eiwit media zoals Essentiele-8 35

Beheersing van de seeding dichtheid van stamcellen na passage is van cruciaal belang voor routine en succesvolle stamcel cultuur. Zaaien te laag of hoog kan resulteren in ectopische differentiatie en verlies van pluripotentie in Naast het veroorzaken onregelmatige tussenpozen passage. Typische stamcel cultuur baseert zich op verhouding splitsen waarbij één putje van een 6-wells plaat wordt gebruikt om een ​​hele nieuwe 6-well plaat zaad (een 1: 6 split). Met de vloeistofverwerking robot Deze verhouding kan worden aangepast aan de wensen van de gebruiker aangepast (bijvoorbeeld 1: 6, 1: 9, 1:12, etc.) en het heeft de meeste invloed op de passage interval. De robot kan dan een kolom, een volledige kolom (8 wells), of meer dan één kolom oogsten afhankelijk van de behoeften van de gebruiker, welke empirisch worden bepaald. De vet- en fibroblast afgeleid iPSCs onderhouden een regelmatige driedaagse voeden schema met passage op de vierde dag, toen gesplitst 01:12. In dit geval werd een kolom geoogst en gebruikt voor zaad een nieuwe 96-well plaat, waardoor een 01:12 split met elke cyclus (Figuur 3A). De resterende 11 putjes werden vervolgens beschikbaar voor verdere toepassingen. Om deze 11 productieputten oogsten, werd de passage protocol herhaald, behalve de cellen werden gestort in een trog voor de collectie. Als alternatief kunnen de cellen worden op het bord en direct.

Consistente entdichtheid doorgang naar doorgang een routine splitting schema bereiken zonder te tellen en te onderhouden, onze protocols roepen splitsen hetzelfde voorafbepaald aantal kolommen als de kolonie op een ideale dichtheid voor passage. Om gebruikers de juiste densiteit voor passage een reeks beelden gegenereerd met een reeks van dichtheden een ideale passage dichtheid gemarkeerd (Figuur 3B). Om te bepalen wanneer passage, een technicus onderzoekt hun bord en vergelijkt het met de belichting schaal. Het ideel dichtheid passage werd bepaald uit kweek van de vet- en fibroblast afgeleide iPSCs en gevonden wanneer de ruimte tussen de meeste kolonies was ongeveer 25% van aangrenzende kolonie diameter. Het is belangrijk dat de koloniën homogeen verdeeld. Deze hoeveelheid kolonie scheiding correleert met de maximale wenselijke dichtheid omdat een extra voerbeurt leidt tot kolonies raken, wat een trigger voor ectopische differentiatie.

Een noodzakelijke protocol hier ontwikkeld adressen hoe een cultuur starten in de 96-well formaat en hoe een cultuur resetten na een dichtheid probleem. Wanneer een nieuwe kweek wordt gestart, de beste zaaidichtheid en het aantal voedingscycli vóór passage onbekend. Een bruikbare dichtheid na het zaaien verlenen de robot verspreidt bestaande of ontdooide cellen over een 96-wells plaat in een seriële verdunning (figuur 4A). Voorbeeld resultaten van een dergelijke gradiënt worden getoond in Figuur 4B-E. Na een aantal voedingcycli, een aantal zuilen naderen de ideale dichtheid te splitsen, op welk punt een technicus gebruikt de robot om zaad van een uniform verdund plaat regelmatig cultuur beginnen. Deze dichtheidsgradiënt protocol werd ook toegepast om regelmatig passage tussenpozen kolonie homogeniteit herstellen naar een onregelmatige plaat. Als doorgang wordt vertraagd of gemist, te hoog kolonie dichtheid en grootte te worden, terwijl als passage is te vroeg, kolonie dichtheid is te laag en individuele kolonies te groot geworden zonder gelijkmatig verdeeld over de put. De dichtheidsgradiënt protocol lost deze problemen en stelt de gebruiker opnieuw op te starten door het plukken van een ideaal gezaaid set van putten.

Twee iPSC lijnen bleef pluripotente na 3 maanden robotachtige cultuur.

Onderhoud van stamcellen pluripotency kan negatief worden beïnvloed door kweekomstandigheden 36,37. Om te evalueren of vet- en fibroblast afgeleide iPSC lijnen (a-iPSC, f-iPSC respectievelijk) gehandhaafd pluripotency robot indien gekweekt in 96-well platen gedurende langere tijd, de beide lijnen werden gekweekt op de vloeistofverwerking robot zoals boven beschreven voor 3 maanden en pluripotentie markers onderzocht. Voor deze periode beide lijnen werden gepasseerd door een proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens meer dan 20 maal zonder centrifugeren. Vaste 96-wells platen uit een iPSC en f-iPSC lines gekleurd voor Oct4 en Nanog vertoonden nucleaire accumulatie van deze markers terwijl SSEA-4 werd waargenomen op het celoppervlak (figuur 5A-L). Dit is consistent met eerdere rapporten voor pluripotent iPSCs 38-41. Tegenkleuring met DAPI geen additionele cellen die geen positief voor de drie pluripotentie markers werden ook zien. Chromosomale abnormaliteiten worden vaak waargenomen tijdens stamcelkweek 42,43 maar brengen geen verdeling van pluripotentie markers zoals die getoond in figuur 5A-L. Karyotype analyse bleek zowel robot passage iPSC lijnen had 46 normale chromosomen, wat suggereert dat de robot kweekmethode heb chromosomale instabiliteit dan wat normaal zou kunnen optreden (figuur 5M-N) niet te introduceren.

Om sonde opgericht stamcel genexpressie markers 1,41,44,45 in de robot gekweekte iPSC lijnen, werd totaal RNA verzameld parallel aan vlekken en karyotype analyse. Zowel de 96-well plaat iPSC lijnen had soortgelijke uitdrukking van pluripotentie markers NANOG, POU5F1 en REX1 terwijl hartspiercellen onderscheiden van elke regel niet, noch een aparte lijn van de menselijke huid fibroblasten (HDF) (Figuur 6). De hartspiercellen afgeleid van beide lijnen waren MYL7 positief, terwijl de HDF en stamcellen had MYL7 niet uiten. Beide iPSC lijnen werden onderscheiden in hartspiercellen met de kleine molecule, Wnt-route manipulatie techniek onlangs beschreven 46 (Figuur 7). Differentiatie in cardiomyocyten als de 96-well formaat was succesvol in meer dan 80% van de putjes (data niet getoond). Tezamen suggereren deze gegevens 3 maanden en meer dan 20 passages robotachtige cultuur resulteerde in chromosomaal normale cellen vertonen een transcriptie-programma in overeenstemming met pluripotentie die ook in staat waren differentiatie in hartspiercellen.

Figuur 1
Figuur 1. Overzicht van de robot stamcellen cultuur apparatuur en typische iPSC cultuur routine. (A) Robotic liquid handling systeem getoond met typische bed lay-out voor 96-well stamcellen cultuur. Nieuwe steriele pipet tips (tips), afneembare tip afvalcontainer (Waste), multi-well autoclavable dal te houden vereiste vloeibare reagentia (Liquids), 96-well platen worden gepositioneerd een d ondersteund op een constante temperatuur schuine helling (96-well platen), 8 kanaals pipet robotachtige kop die links / rechts en op / neer (Pipet weg) beweegt. Plate deksel houden rack (PLHR). Bed positie nummers in tabel weergegeven. (B) Robotic iPSC cultuur heeft twee fasen: Voeding en Passage. De cyclus van cel productie begint wanneer een kolonie plaat klaar is om passage. De gebruiker de gewenste verhouding om doorgang kiest op de robot zaden een nieuwe groep van 96-wells platen opnieuw gevoed regelmatig tot klaar voor passage. Wanneer de platen klaar voor passage meeste elke plaat wordt niet gebruikt voor latere kolonie platen zaad en is beschikbaar voor andere toepassingen, waardoor die de productiefase van het systeem. Bevroren of bestaande cellijnen kan op elk moment worden ingevoerd en in stand gehouden in het voer / passage-cyclus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figuur 2
Figuur 2. Robotic vloeistofverwerking parameters kunnen worden gebruikt om iPSC kolonie dissociatie eigenschappen regelen. Elk beeld representatief toont fibroblasten afgeleid iPSCs los nadat de geïndiceerde behandeling, terwijl nog steeds opgeschort in de 96-well. (Top Row, A - C) Enzyme Time, geen wrijven. Fibroblasten afkomstig iPSCs gekweekt in 96-well platen werden blootgesteld aan toenemende tijd van proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens dissociatie en geen robotachtige tritureren werd uitgevoerd. (Midden-Row, D - F) Triturering tarief, 3 minuten enzym. De cellen werden blootgesteld aan drie minuten van proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens behandeling en vervolgens 175 ul groeimedium werd toegepast en elk goed op en neer ooit gepipetteerd op de aangegeven snelheid. gl / sec = microliter per tweede. (Onderste rij, G - I) Triturering Herhalingen, 3 minuten enzym, 160 ul / sec. De cellen werden blootgesteld aan proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens voor 3 minuten werd 175 ul groeimedia toegepast, dan aangewreven bij 160 pl / sec voor het aangegeven aantal herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Typische vet- en fibroblast iPSC kolonie onderhoudsschema en een reeks beelden kolonie dichtheid te bepalen wanneer overgang naar een normale voeding / passage-cyclus te handhaven. (A) Beginnend met een vet of fibroblast 96 putjes iPSC kolonie direct passage, een kolom cellen werd gepasseerd over de robot zonder centrifugatie en verdund12 nieuwe kolommen die gevoed werden op specifieke tijdstippen daarna tot de plaat was klaar om passage opnieuw. Voor celproductie, werden de kolommen niet gebruikt om de kolonie handhaven gepasseerd en verzameld voor verder gebruik. Elk aantal kolommen kan worden gepasseerd expansie te regelen. (B) om te bepalen wanneer passage, een serie beelden dichtheid gevangen elke 24 uur werd verstrekt aan de gebruikers. In de bovenste rode doos (binnen 72 uur na de eerste zaaien) de kolonie is niet dicht genoeg om de doorgang en moeten worden gevoed. Wanneer de dichtheid overeenkomt met de gegevens in de groene box (bij ~ 96 uur), de kolonie op een ideale dichtheid voor passage. Door 120 uur, de kolonie te dicht om passage en dit scenario moet worden vermeden. De laatste kan worden opgelost met een helling seeding dichtheid maar routine cultuur in deze dichtheid wordt sterk afgeraden. Witte balk is gelijk aan 200 uM. Klik hier om een grotere versi bekijkenop van dit cijfer.

Figuur 4
Figuur 4. 96-well robot kweeksysteem kunnen gebruikers cultures gaan van bevroren of actieve cellijnen en voer een seeding gradiënt. (A) Een cel wordt bereid door de gebruiker uit een bevroren cel stock of na het oogsten van een actieve cultuur gebracht op de robot. Het robotsysteem voert vervolgens een seriële verdunning protocol bij de aanvankelijke celoplossing langs de 96-well plaat met de dichtheidsgradiënt gedistribueerd door kolom- verdelen. (B - E) Voorbeelden van celdichtheid van vier van de twaalf kolommen van A, 48 uur na de dichtheidsgradiënt zaaien protocol. Witte lijnen gelijk aan 225 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.

Figuur 5
Figuur 5. Pluripotentie wordt gedurende vet- en fibroblast afgeleide iPSC lijnen in 96-well robot cultuur 22 (vet) en 23 (fibroblast) doorgangen (~ 3 maanden). (A - L) vet- en fibroblast afgeleide iPSC cellijnen waren robotically gevoed en gepasseerd zoals beschreven in de tekst zonder centrifugatie in 96-well platen voor 22 of 23 passages vervolgens gefixeerd en gekleurd voor pluripotentie markers Oct4, Nanog of Ssea4 met DAPI tegenkleuring. Witte balk is gelijk aan 100 micrometer. (M - N). Parallel culturen met die in A beschreven werden ingediend voor karyotype analyse die een normale complement van 46 chromosomen onthuld Klik hier om een grotere versie te bekijken of dit cijfer.

Figuur 6
Figuur 6. Vetweefsel (96-A) en fibroblast (96-F) afgeleide iPSCs gekweekt gedurende meer dan 20 passages in de 96-well formaat, waarin robot pluripotentie genexpressie en onderscheiden in hartspiercellen. Totaal mRNA werd geëxtraheerd uit met robot gekweekte iPSC lines alsmede cardiomyocyten onderscheiden van beide lijnen (CM-A = adipose iPSC afgeleide cardiomyocyten, CM-F = fibroblast iPSC afgeleide cardiomyocyten, verzameld 14 dagen na differentiatie inductie) en gebruikt voor RT-PCR om pluripotentie markers NANOG, POU5F1, REX1 probe, cardiomyocyte marker MYL7 en laden controle GAPDH. Menselijke dermale fibroblasten (HDF) werden ook verzameld en gebruikt als een niet-iPSC, niet-cardiomyocyt control. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. Fibroblasten en vetweefsel afgeleide iPSCs behouden het vermogen om te differentiëren in cardiomyocyten na langdurige 96 putjes robotic kweek (A - H). Adipose en fibroblast iPSCs gekweekt in 96-well format robot meer dan 20 passages werden gedifferentieerd tot cardiomyocyten . 14 dagen na de differentiatie inductie, werden 96-well plaat gebonden hartspiercellen los en opnieuw uitgeplaat bij een lage dichtheid op glas dia's voor immunokleuring van troponine T (rood), F-actine (groen) en kernen (blauw). Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.

p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/>
Figuur 8. Opschaling 96-well plaat stamcelkweek. Opwaardering van stamcelproductie afhankelijk van het aantal gebruikte platen naar de volgende groep platen zaad. De gebruiker kan een productieniveau hetzij handhaven door passage van hetzelfde aantal platen bij elke splitsing gelegenheid of uitbreiden productie met zaaien meer platen. Bijvoorbeeld, in cyclus 0, is een 96-putjesplaat gepasseerd twaalf nieuwe platen (cyclus 1), waardoor een 12-voudige expansie. Dit percentage kan worden gehandhaafd als één van de twaalf platen wordt gepasseerd om een ​​nieuwe set van twaalf platen (Cyclus 1-2), of uitgebreid door passage van meerdere platen (Cyclus 2-3). Tijdens passage kentekenplaten niet gebruikt om de kolonie handhaven vindt verdere toepassingen. Daarom passage 12 platen routinematig kunnen wel 144 platen op in twee passages: 12 voor colony onderhouds- en 132 voor andere toepassingen."> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9
Figuur 9. Doelmatigheid van 96-well plaat gebaseerde cultuur celproductie ruim overtreft manuele cultivatie. Zoals in figuur 8, kan een plaat worden gepasseerd twaalf platen, die vervolgens kunnen worden gepasseerd om 144 platen zaad. Deze expansiesnelheid kan op twee gesplitste mogelijkheden. Een technicus vereist ongeveer 3,5 minuten te voeden een 6-wells plaat terwijl ze besteden ongeveer 30 seconden met een 96-wells plaat te onderzoeken op de microscoop en plaats het op de robot. Als de technicus draagt ​​144 platen, zullen ze ongeveer 1,2 uur hanteren platen besteden bij het ​​voeren met de robot, terwijl handleiding cultuur zal een speciale 8 uur te voeden nodig. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.

Discussion

In de huidige studie ontwikkelden we een methode robotachtige cultuur iPSC productie die miniaturizes en automatiseert het voeden en passage in een 96-well plaat formaat, terwijl ook mogelijk efficiënte schaal omhoog. Een vloeibare handlingrobot werd gebruikt om routinematig voeden iPSC koloniën en passage ze op regelmatige tijdstippen door enzymatische dissociatie. De robot werd geprogrammeerd om extracellulaire matrix gel-beklede platen produceren en uitvoeren van een gradiënt entdichtheid. Wanneer fibroblasten en vetweefsel afgeleide iPSCs werden gekweekt in dit systeem meer dan 20 passages, ongeveer 3 maanden, werd pluripotentie behouden, net als stabiel karyotype. Beide cellijnen waren in staat differentiatie in hartspiercellen. Samen, het verzamelen van protocollen hier beschreven stelt gebruikers in staat met zeer weinig stamcellen cultuur ervaring, of beperkte toegang tot gespecialiseerde apparatuur cultuur, de cultuur van stamcellen en het bereiken van een hoge cel productie of multi-line behandeling met minimale arbeid en kosten.

44,47 - 49 tot pluripotentie behouden. Terwijl andere formaten van schaalbare stamcellen kweken opbrengst pluripotente cellen 20,23,29 deze plaat gebaseerde methode vereist in wezen geen verandering in de cultuur-formaat, zoals aanpassing aan schorsing, het gebruik van anti- chemicaliën of langdurig gebruik van Rho-kinase remmer 20. Deze plaat gebaseerde methode kan dus snel en voorspelbaar, geschikt voor nieuwe lijnen, omdat de kweekomstandigheden zijn vergelijkbaar. Aangezien het gebruik van iPSCs voor ziektemodel verhoogt 4,6,19,50 worden nieuwe iPSC lijnen doorlopend wordt. De hier beschreven technieken zijn het meest geschikt voor de cultuur nieuwe lijnen in middelgrote tot grote volumes en doorzet, omdat de barrière om de overgang naar het formaat is low. Dit geldt ook voor de arbeid en apparatuur nodig om de koloniën. Tenslotte, omdat het formaat en de behandeling zijn vergelijkbaar met de gehanteerd om en bevestig iPSC lijnen, cultuur prestaties, zoals voorgeschreven differentiatie omgeving, waarschijnlijk meer voorspelbaar.

Figuur 8 illustreert een strategie voor opschaling van stamcelproductie in 96-wells platen. Eén plaat (cyclus 0) wordt gebruikt om een ​​robot zaad 12 nieuwe platen, een 12 voudige toename (cyclus 0-1). Na enkele dagen voeren, één van de twaalf platen passage naar een andere set van twaalf platen (cyclus 1 tot Cyclus 2) zaad. De overige elf platen zijn nu beschikbaar voor andere doeleinden en vertegenwoordigen de produktie component van het systeem. In dit tempo zal passage van een plaat bieden 11 platen elke cyclus, of om de 3-4 dagen. Deze methode kan verder worden opgeschaald wanneer meerdere platen worden doorgekweekt zoals in de overgang van cyclus 2 tot cyclus 3. Cyclus 3, twee platenaltijd gebruikt om de kolonie te behouden en zaden 24 nieuwe platen. De resterende 22 platen zijn dan beschikbaar voor gebruik na elke passage cyclus. Op elk punt in het onderhoud cyclus kan de gebruiker zaad meer platen te verhogen. Een voorbeeld zou zijn om passage elke kolom voor twee groei cycli. De eerste doorgang geconverteerd plaat in twaalf platen en elk van de twaalf platen gebruikt 144 schotels zaad. In dit geval kan een gebruiker begint met één plaat en na twee passages, of ongeveer 1,5-2 weken kweken, heeft 144 schotels. Bijvoorbeeld, de fibroblast en vetweefsel iPSC lijnen op ongeveer 25-75000000 cellen per 96-well plaat als u klaar bent om de doorgang. 144 platen kan dus vertegenwoordigen ongeveer 4-7 x 10 9 cellen.

Welke arbeidslast voor het dragen 144 96-putjesplaten robotically? Eén van de doelen van dit werk was schaalbare stamcelproductie dat arbeid verminderd in vergelijking met traditionele (dwz 6-well plaat) stamcelcultuur. De robot accomplishes dit door het verlichten van de noodzaak om fysiek te behandelen elke plaat tijdens het voeden en passage. Terwijl 96-well plaat productie schalen lineair dat het traditionele 6-well platen, de tijd doorbrengt een technicus die met de platen aanzienlijk minder middels robotic cultuur. De productie-efficiëntie robotachtige cultuur afgeleid van deze verschillen (figuur 9). Het werd gevonden technici zou een 6-wells plaat uit de incubator te verwijderen, controleren op de microscoop, dan zuigen en voeden de plaat in ongeveer 3,5 minuten. Ter vergelijking, technici brengen ongeveer 30 sec verwijderen van een 96-well plaat uit de incubator en inspecteren het op de microscoop voor dichtheid en vervuiling voordat zij het in de robot. Met een uitgezette voeding protocol vergelijkbaar met de hierboven beschreven, kunnen zes 96-putjesplaten worden geladen en gevoed, die ongeveer 21 min, of 3,5 min per plaat draait. De totale verstreken tijd om een ​​plaat te voeden is vergelijkbaar tussen robotic en handmatige methoden, maar om de hand-feed 6 platen een technicus is vereist voor alle 21 min, terwijl de technicus besteedt slechts 3 min behandeling van de zes platen voor de robot (30 sec inspectie per plaat). Zoals figuur 9 laat zien, de tijd dat een technicus besteedt de behandeling 144 platen met behulp van de robot is ongeveer 1,2 uur, in tegenstelling tot 8 uur met de hand en de robot zal nooit een fout maakt het hanteren van de platen of de overdracht van vloeistoffen.

De 96-well iPSC kweekmethoden hier beschreven bieden een handelbaar platform voor complexe screening taken. Omdat elk putje genetisch identiek en gezaaid met dezelfde dichtheid van dezelfde oorspronkelijke pool kan variabelen over de plaat worden gedistribueerd en onderhouden door de robot met commercieel verkrijgbaar reservoirs voorwaarden scheiden. Dit zou nuttig zijn voor experimenten zoals groei stamcellen media ontwikkeling 34,35,47, substraat of cultuur conditie testen en toxicologisch onderzoek met behulp van stamcellen51. Aangezien elke stamcellijn is uniek in termen van optimale kolonie grootte en passage eisen, kan men dit systeem gebruiken om te zaaien dichtheid, het voeden van de frequentie en de passage handling moduleren door het manipuleren van de geoogste kolommen, de mechanische agitatie tijdens passage en het voederen frequentie. Itereren door middel van deze variabelen kan de gebruiker in staat om snel een reeks voorwaarden die geschikt zijn voor de cultuur van een nieuwe lijn of een nieuwe cultuur technieken te ontwikkelen. Het robotsysteem Ook kan handhaven 96 parallel maar onafhankelijk stamcel kolonies. Wanneer iPSC zijn afgeleid uit somatische cellen of gekloneerd na genetische manipulatie zijn vele parallelle klonen gescreend op potentiële iPSC lijnen opleveren. Zodra enkele cellen worden gezaaid in 96-well platen, kan dit systeem voeden en de doorgang 96-well platen houdt elke kolonie gescheiden. Dit maakt een zeer hoge doorvoersnelheid bij het selecteren van potentiële klonen en elimineert de moeilijkheid in fysiek kweken 96 parallelle lijnen. Deze werkwijze ookllows opgeschaald productie van elke kloon, zodat materiaal is beschikbaar voor parallelle analyse. Tenslotte, voor ogen we integratie van deze kweek technieken een robot plate handel systeem levert platen en naar de incubator zodat volautomatische cultuur. Dit kan worden bereikt met complexere robotica die zorgen voor een grotere uitzetting bestaan ​​omdat de protocollen die beschreven zijn overdraagbaar naar andere plaat gebaseerde systemen.

De eerste kritische stappen aan te pakken in de protocollen zijn degenen die te voorkomen en te controleren op vervuiling, zoals de stappen 1.5 en 4.2. Verontreinigingen, zoals hierboven besproken, kunnen met succes worden vermeden als goede steriele techniek en gezond verstand worden gebruikt. Het is noodzakelijk, ongeacht de stamcel cultuur-formaat, dat de exploitant controle op vervuiling en te doen in dit protocol op de aangegeven stappen aanzienlijk het risico op besmetting te verminderen. Juiste extracellulaire matrix gel applicatie is een tweede esstiële stap naar de algehele succes van dit protocol. Zonder juiste coaten van de 96-well platen, zal de stamcellen niet groeien. Een veel voorkomend probleem is incompleet goed coating. De ervaring leert dat luchtbellen, elektrostatische aantrekking en capillaire werking belemmeren volledig goed coating. De vooraf bevochtigen stap (1,6) ontwikkeld om een ​​aanzienlijke verbetering wellbodem bekleding en mag niet worden overgeslagen. Deze pre-bevochtigingsstap lijkt de schijnbare hydrofobiciteit van het plastic 96-well plaat verminderen zodat wanneer de extracellulaire matrix gel coating aangebracht wordt gelijkmatig verdeeld over de putbodem en zijkanten. Het wordt ook aangeraden om voorzichtig tik op de 96-well platen tegen een schone hand eens gecoat om zelfs extracellulaire matrix gel oplossing distributie zorgen. De dissociatie parameters zijn ook belangrijk voor het optimaliseren. Verlengde incubatie met enzym of EDTA gebaseerd dissociatie reagens resulteert in afzonderlijke cellen die al dan niet het doel tijdens passage. Daarom is de operatormoet speciale aandacht besteden aan hoe dissociatie tijd, trituratie kracht en wassen herhalingen beïnvloeden kolonie morfologie en gezondheid en dienovereenkomstig aan te passen.

Inzicht in de beperkingen van de hier beschreven technieken zijn van cruciaal belang voor een goede werking. Zoals bij elke andere celcultuur instelling het gebruik van 96-well platen vormt een relatief hoog risico besmetting. Zoals hierboven is beschreven, een technicus stapelaars elke plaat tijdens het voeden en passage; bijvoorbeeld, bij het openen, waardoor de plaat op de robot bed, en het controleren van de plaat op de microscoop. Daarom, zoals waargenomen na stap 1,5, is het noodzakelijk de binnenzijde van elke plaat deksel niet aanraakt of dit deel geven mogelijk besmette oppervlak blootgesteld, zoals de schuine verwarmingsblokken of verticale pinnen op het bed. Tijdens protocol ontwikkeling werd deze beperking ontdekt en was de aanzet tot een rek te plaat deksels houden om de steriliteit te behouden te ontwikkelen. Ook de trog reservoirs, pipet tips en other levert op de liquid handling robot bed zijn potentiële bronnen van verontreiniging, omdat ze open zijn voor het milieu en behandeld door de technicus. Daarom moet een goede steriele techniek zodanig worden toegepast zoals het verminderen van bewegingen overbelicht cultuur materialen of geopend vloeistoffen. Een andere beperking is dat wanneer het protocol wordt opgeschaald, visuele controle van elk putje van> 100 96-well platen is omslachtig. Dit kan worden behandeld door visuele inspectie van de gehele plaat op tekenen van besmetting, zoals troebele media, verdachte bronnen te identificeren. Voor toekomstige schaal, zal het gebruik van een geautomatiseerde microscoop en indicator van de celgroei en potentiële verontreiniging worden opgenomen.

Samengevat, de high-throughput 96 putjes gebaseerde platform hier beschreven biedt een reproduceerbare high fidelity werkwijze voor stamcelkweek en productie in een plaatformaat. Deze methode vermindert de nodige ervaring, apparatuur die nodig is en arbeid tijd gewijd aan stamcel cultuur terwijlbehoud van de voordelen van de traditionele hechtende kweek.

Disclosures

De auteurs MKC, MJG, EEB, NJD en RO zijn of waren ten tijde van de ontwikkeling van medewerkers InvivoSciences, INC die bedacht en ontwikkelde de robot protocollen beschreven. TW is de CSO voor InvivoSciences INC. SH is een werknemer van Gilson INC.

Acknowledgments

Dit werk werd mede ondersteund door NIH subsidies, R44 en R01 GM087784 HL109505. Auteurs danken de technische en OEM-team van Gilson, INC voor uitgebreide technische ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34 (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111 (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4 (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5 (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11 (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8 (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6 (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18 (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16 (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6 (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77 (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451 (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113 (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3 (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30 (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105 (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. , (2014).

Tags

Developmental Biology iPSC high-throughput robot vloeistof-handling schaalbare stamcel geautomatiseerde stamcel cultuur 96-well
Schaalbare 96 putjes plaat Based iPSC Culture and Production Met een Robotic Liquid Handling System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, … More

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter