The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.
स्टेम सेल संस्कृति में निरंतर उन्नति पुनर्योजी दवा, दवाओं की खोज और सुरक्षा का परीक्षण में इन कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए बेंच और बिस्तर के बीच की खाई को बंद हो रहा है। ऊतक इंजीनियरिंग और प्रत्यारोपण के लिए सेल व्युत्पन्न biopharmaceutics और स्टेम सेल का उत्पादन करने के लिए, एक लागत प्रभावी सेल विनिर्माण प्रौद्योगिकी आवश्यक है। Pluripotency और समय के साथ बहाव के अनुप्रयोगों (जैसे, सेल भेदभाव) में कोशिकाओं के स्थिर प्रदर्शन के रखरखाव के लिए बड़े पैमाने पर कोशिकाओं के उत्पादन के लिए सर्वोपरि है। अभी तक कि ऑपरेटर महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता परिचय के साथ ही बड़े पैमाने अप करने के लिए बेहद महंगा हो सकता है, जहां कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से संवर्धित कर रहे हैं विशेष रूप से अगर हासिल करना मुश्किल हो सकता है। न्यूनतम तकनीशियन भागीदारी या अनुभव की आवश्यकता होती है कि तरल रोबोट से निपटने के लिए विकसित किए गए मल्टी चैनल एक बेंच शीर्ष का उपयोग ऑपरेटर प्रभाव उपन्यास स्टेम सेल संस्कृति प्रोटोकॉल उच्च throughput, बड़े पैमाने पर स्टेम कोशिका के उत्पादन में सक्षम है और निकालने के लिए। साथइन प्रोटोकॉल मानव प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) सीधे एक जमे हुए स्टॉक से फीडर मुक्त परिस्थितियों में सुसंस्कृत थे और 96 अच्छी तरह से प्लेट में बनाए रखा। जब पारित होने के लिए सेल लाइन और वांछित पैमाने अप दर पर निर्भर करता है, ऑपरेटर आसानी से बंटवारे के लिए इष्टतम कॉलोनी घनत्व दिखा छवियों की एक श्रृंखला के आधार पर निर्धारित कर सकते हैं। उसके बाद आवश्यक अभिकर्मकों एक centrifugation कदम के बिना नई प्लेटों के लिए एक कॉलोनी विभाजन प्रदर्शन करने के लिए तैयार हैं। 20 मार्ग (~ 3 महीने) के बाद, दो IPSC लाइनों, स्थिर karyotypes बनाए रखा स्टेम सेल मार्कर व्यक्त की, और उच्च दक्षता के साथ cardiomyocytes में विभेदित। प्रणाली 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए बनाया गया नया भेदभाव प्रोटोकॉल या आनुवंशिक हेरफेर के बाद के उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रदर्शन कर सकते हैं। इस प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के असंख्य के लिए समान स्टेम कोशिकाओं की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए श्रम और तकनीकी बोझ कम हो जाएगा।
6 – मानव प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) के उपयोग यौगिक परीक्षण, पुनर्योजी चिकित्सा और रोग मॉडलिंग 2 के लिए 2007 1 में उनके व्युत्पत्ति के बाद से काफी बढ़ गया है। इस मांग को एक अद्वितीय मात्रा में दैहिक कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है कि pluripotent कोशिकाओं की बड़ी संख्या को उपज के लिए IPSC की क्षमता से आता है। निर्देशित भेदभाव तकनीक 7 में सुधार के रूप में – तो उच्च गुणवत्ता IPSCs का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए आवश्यकता करता है, 14 – 10 और मानव कोशिका या ऊतक मॉडलिंग और सेल थेरेपी के विकास के 11 से बढ़ जाती है। 18 – यह व्यापक रूप से अन्य बुराइयों के बीच में, रोधगलन या बी सेल कार्यात्मक प्रतिस्थापन IPSC के अरबों के लिए लाखों लोगों के सैकड़ों की आवश्यकता होती है दैहिक कोशिकाओं 15 व्युत्पन्न है कि उद्धृत किया जाता है। दवाओं की खोज और टी के लिए इसके अलावा, तेजी से जटिल 3 डी ऊतक मॉडलिंगherapy कोशिकाओं 9,13,19 की बड़ी संख्या की मांग करेंगे। इन सभी उदाहरणों में, परिभाषित वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य IPSCs उपलब्ध है और निर्माण करने के लिए सरल होना चाहिए।
ऊतक इंजीनियरिंग और प्रत्यारोपण के लिए सेल व्युत्पन्न biopharmaceutics और स्टेम सेल का उत्पादन करने के लिए, एक लागत प्रभावी सेल विनिर्माण प्रौद्योगिकी आवश्यक है। इन तकनीकों को सफलतापूर्वक बड़े पैमाने पर गैर-IPSC, यूकेरियोटिक आधारित उत्पादन के लिए तैनात किए गए हैं, आंशिक रूप क्योंकि 28 – microcarrier substrates के 26 के उपयोग के साथ 25 या निलंबन – IPSCs की स्केल्ड उत्पादन निलंबन संस्कृति 20 पर ध्यान केंद्रित किया है। कई समूहों स्टेम सेल 20,21,23,24,29 निकलेगा कि निलंबन संस्कृति प्रणालियों का प्रदर्शन किया है। हालांकि, इन तरीकों ऊतक इंजीनियरिंग ड्राइविंग और Laborat कर रही है, उपन्यास भेदभाव कार्यक्रमों के विकास के शोधकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं महंगा और जटिल प्रणालियों का उपयोगory पैमाने पर अनुसंधान। इसके अलावा, निलंबन और microcarrier IPSC संस्कृतियों एकत्रीकरण को विनियमित करने के लिए अनुकूलन और तकनीक या इस तरह रो-kinase अवरोध के लगातार प्रयोग के रूप में पारंपरिक पक्षपाती IPSC संस्कृति में नहीं मिला रसायन, antifoaming एजेंटों और निस्पंदन की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को शारीरिक तनाव यांत्रिक आंदोलन से और साथ ही microcarrier टक्कर के दौरान शुरू की, निलंबन संस्कृति में अधिक प्रचलित है। इन मुद्दों को सेल लाइनों निलंबन में संवर्धित किया जा सकता नव स्टेम उत्पन्न जिस पर predictability और गति सीमा। दूसरों की थाली कल्चर तकनीक 30,31 कि नकल रोबोट थाली हैंडलिंग सिस्टम विकसित किया है लेकिन इन प्लेटफार्मों उपकरण और स्टेम सेल संस्कृति के साथ जुड़े मौलिक चुनौतियों के अलावा संचालित करने के लिए विशेषज्ञता के लिए महत्वपूर्ण निवेश की मांग।
निम्नलिखित काम एक घुन्ना, मानक 8 चैनल रोबोट तरल इस्तेमाल करता है कि विकास और एक स्केलेबल IPSC संस्कृति प्रणाली के अभ्यास का वर्णनहैंडलर और 96 अच्छी तरह प्लेटें। इस विधि प्रयोगशाला पैमाने IPSC संस्कृति और उच्च मात्रा IPSC उत्पादन को पाटने के लिए डिजाइन किया गया था (जैसे, 10 7 – तकनीशियन प्रति सप्ताह 1.5 एक्स 10 9 कोशिकाओं) नई IPSC प्रौद्योगिकियों के विकास के उन सक्रिय करने के आसानी से बड़ी हार्डवेयर या श्रम निवेश के बिना उत्पादन को पैमाने पर करने के लिए। इस विधि को स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती है कोई स्टेम सेल संस्कृति, प्रोग्रामिंग या इंजीनियरिंग अनुभव करने के लिए थोड़ा की आवश्यकता है, एक समर्पित सेल संस्कृति हुड के लिए आवश्यकता के बिना एक छोटा सा उपकरण निशान है, और स्वचालित उच्च throughput के लिए मध्यम सक्षम करने के लिए मानक सेल संस्कृति उपकरण का इस्तेमाल सेल उत्पादन। उद्देश्य सेल संस्कृति स्टेम करने के लिए नई प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जा सकता है कि स्केलेबल स्टेम सेल संस्कृति में सक्षम प्रणाली विकसित करने के लिए किया गया था, मैनुअल खेती उनके विचारों को विकसित करने या स्टेम कोशिकाओं की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए एक किफायती साधन चाहने वालों के लिए एक बाधा लगता है जो लोग। यहाँ प्रस्तुत मंच पर तकनीशियन प्रभाव को हटासेल संस्कृति स्टेम और लगातार स्टेम कोशिका के उत्पादन को सक्षम करने के लिए भोजन और पारित होने प्रक्रियाओं normalizes।
वर्तमान अध्ययन में हम miniaturizes और भी कुशल पैमाने को सक्षम करते हुए एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में खिलाने और पारित होने के automates कि IPSC उत्पादन के लिए रोबोट संस्कृति की एक विधि विकसित की है। एक तरल से निपटने रोबोट नियमित एंजाइमी हदबंदी द्वारा नियमित अंतराल पर IPSC कालोनियों और बीतने उन्हें खिलाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। रोबोट भी बाह्य मैट्रिक्स जेल लेपित प्लेटों का उत्पादन और एक बोने घनत्व ढाल प्रदर्शन करने के लिए प्रोग्राम था। तंतुप्रसू और वसा व्युत्पन्न IPSCs अधिक से अधिक से अधिक 20 मार्ग, के बारे में 3 महीने के लिए इस प्रणाली में सुसंस्कृत थे जब स्थिर karyotypes थे, pluripotency, बनाए रखा गया था। दोनों सेल लाइनों cardiomyocytes में भेदभाव करने में सक्षम थे। साथ में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का संग्रह संस्कृति स्टेम कोशिकाओं के लिए, बहुत कम स्टेम सेल संस्कृति का अनुभव है, या विशेष संस्कृति उपकरण तक ही सीमित पहुँच के साथ उपयोगकर्ताओं को सक्षम बनाता है और उच्च सेल उत्पादन या कम से कम श्रम और लागत के साथ निपटने के लिए बहु-लाइन प्राप्त करने के।
<p clasएस = "jove_content"> यहाँ विस्तृत रोबोट प्रोटोकॉल IPSC उत्पादन और हैंडलिंग की आर्थिक पैमाने अप के लिए एक विधि प्रदान करते हैं। एक लाभ यह यहाँ का प्रदर्शन एक की स्थापना की थाली आधारित प्रारूप में स्केलेबल स्टेम सेल संस्कृति है और पहले से 44,47 – 49 pluripotency बनाए रखने के लिए। स्केलेबल स्टेम सेल संस्कृति उपज pluripotent कोशिकाओं के अन्य प्रारूपों 20,23,29 इस प्लेट आधारित विधि रूपांतरण की तरह निलंबन के लिए संस्कृति प्रारूप में अनिवार्य रूप से कोई परिवर्तन नहीं, रसायन या रो-kinase अवरोध 20 के लंबे समय तक इस्तेमाल antifoaming के उपयोग की आवश्यकता है। संस्कृति की स्थिति के समान हैं क्योंकि यह प्लेट आधारित विधि इसलिए तेजी से, और जाहिर है, नई लाइनों को समायोजित कर सकते हैं। रोग मॉडलिंग के लिए IPSCs का उपयोग 4,6,19,50 बढ़ जाती है, नए IPSC लाइनों लगातार उत्पन्न कर रहे हैं। प्रारूप पर स्थानांतरण करने के लिए बाधा एल है क्योंकि यहाँ वर्णित तकनीक उच्च मात्रा और प्रवाह में के माध्यम में संस्कृति नई लाइनों के लिए सबसे उपयुक्त हैंओउ। यह भी कालोनियों बनाए रखने के लिए आवश्यक श्रम और उपकरणों के लिए सच है। प्रारूप और हैंडलिंग निकाले जाते हैं और इस तरह का निर्देश भेदभाव के रूप में IPSC लाइनों, संस्कृति प्रदर्शन, मान्य किया पर्यावरण के लिए समान हैं, क्योंकि अंत में, अधिक पूर्वानुमान होने की संभावना है।8 चित्रा 96 अच्छी तरह से प्लेट में स्टेम सेल उत्पादन का स्तर ऊपर के लिए एक रणनीति को दिखाता है। एक प्लेट (साइकिल 0) रोबोट 12 नए प्लेटें, एक 12 गुना वृद्धि (1 चक्र 0) बीज के लिए प्रयोग किया जाता है। खिलाने के कई दिनों के बाद, बारह प्लेटों में से एक बारह प्लेट (चक्र 2 चक्र 1) का एक और सेट बीज के लिए passaged है। शेष ग्यारह प्लेटों अन्य उपयोगों के लिए अब उपलब्ध हैं और इस प्रणाली के उत्पादन घटक का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस दर पर, एक थाली के पारित होने के 11 प्लेटें हर चक्र, या हर 3-4 दिनों प्रदान करेगा। चक्र 3 में साइकिल 3. चक्र 2 से संक्रमण के रूप में दिखाया गया है कई प्लेटें passaged कर रहे हैं जब इस पद्धति अधिक बढ़ाया जा सकता है, दो प्लेटें हैंहमेशा कॉलोनी को बनाए रखने और 24 नए प्लेटों बीज के लिए इस्तेमाल किया। शेष 22 प्लेटें हर बीतने के चक्र के बाद उपयोग के लिए तो उपलब्ध हैं। रखरखाव चक्र में किसी भी बिंदु पर उपयोगकर्ता उत्पादन को बढ़ाने के लिए और अधिक प्लेटों बीज सकते हैं। एक उदाहरण के पारित होने के लिए दो विकास चक्र के लिए हर स्तंभ होगा। पहले पारित होने के बारह प्लेटों में एक प्लेट बदल देता है, और बारह प्लेटों के प्रत्येक 144 प्लेटें बीज के लिए प्रयोग किया जाता है। इस मामले में, एक यूजर को एक थाली के साथ शुरू होता है और दो मार्ग हैं, या संस्कृति के बारे में 1.5-2 सप्ताह के बाद, 144 प्लेटें है। उदाहरण के लिए, तंतुप्रसू और वसा IPSC लाइनों पारित होने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली के अनुसार लगभग 25-75,000,000 कोशिकाओं तैयार जब निकलेगा। 144 प्लेटें इसलिए बारे में 4-7 एक्स 10 9 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करेगा।
रोबोट 144 96 अच्छी तरह प्लेटें ले जाने के लिए श्रम बोझ क्या है? इस काम के लिए लक्ष्यों में से एक सेल संस्कृति स्टेम पारंपरिक (यानी, 6 अच्छी तरह से थाली) की तुलना में श्रम कम है कि स्केलेबल स्टेम कोशिका के उत्पादन किया गया था। रोबोट एसीसीomplishes इस शारीरिक रूप से खिलाने और passaging के दौरान प्रत्येक थाली को संभालने की जरूरत को समाप्त करने से। रैखिक की तरह यह 96 अच्छी तरह से थाली उत्पादन तराजू पारंपरिक 6 अच्छी तरह प्लेटें, एक तकनीशियन प्लेटों के साथ काम कर खर्च करता है समय रोबोट संस्कृति का उपयोग करने में काफी कम है होता है। रोबोट संस्कृति की उत्पादन क्षमता में इस अंतर (9 चित्रा) से ली गई है। यह तकनीशियनों में थाली लगभग 3.5 मिनट, इनक्यूबेटर से 6 अच्छी तरह से थाली हटा माइक्रोस्कोप पर यह जांच, फिर महाप्राण और खिला सकता पाया गया था। इसकी तुलना में, तकनीशियनों लगभग 30 सेकंड इनक्यूबेटर से एक 96 अच्छी तरह से थाली को दूर करने और रोबोट पर रखने से पहले घनत्व और प्रदूषण के लिए माइक्रोस्कोप पर यह निरीक्षण खर्च करते हैं। ऊपर वर्णित एक करने के लिए इसी तरह की एक विस्तारित खिला प्रोटोकॉल के साथ छह 96 अच्छी तरह प्लेटें लगभग 21 मिनट, या प्रति प्लेट 3.5 मिनट लगते हैं, जो भरी हुई है और खिलाया जा सकता है। एक प्लेट को खिलाने के लिए कुल गुजरे समय रोबोट के बीच तुलनीय हैतकनीशियन रोबोट के लिए छह प्लेट (प्लेट प्रति एक 30 सेकंड निरीक्षण) से निपटने के लिए केवल 3 मिनट खर्च करता है, जबकि आईसी और मैनुअल तरीके, लेकिन हाथ फ़ीड करने के लिए 6 प्लेटें एक तकनीशियन के सभी 21 मिनट के लिए आवश्यक है। मैन्युअल रूप से 8 घण्टे करने का विरोध किया और रोबोट एक गलती प्लेटों से निपटने या तरल पदार्थ स्थानांतरित कर कभी नहीं होगा के रूप में 9 चित्रा से पता चलता है के रूप में, एक तकनीशियन रोबोट का उपयोग कर 144 प्लेटों से निपटने खर्च करता है समय के बारे में 1.2 घंटा है।
यहाँ वर्णित 96 अच्छी तरह से IPSC संस्कृति तरीकों जटिल स्क्रीनिंग कार्यों के लिए एक विनयशील मंच प्रदान करते हैं। प्रत्येक अच्छी तरह से आनुवंशिक रूप से समान है और एक ही प्रारंभिक पूल से एक ही घनत्व पर वरीयता प्राप्त है, क्योंकि चर थाली भर में वितरित और शर्तों को अलग करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जलाशयों के साथ रोबोट द्वारा बनाए रखा जा सकता है। यह एक ऐसी स्टेम सेल के विकास के मीडिया विकास 34,35,47, सब्सट्रेट या संस्कृति हालत परीक्षण और स्टेम कोशिकाओं का उपयोग विषाक्तता अध्ययन के रूप में प्रयोगों के लिए उपयोगी होगाप्रत्येक स्टेम सेल लाइन इष्टतम कॉलोनी आकार और पारित होने जरूरतों के संदर्भ में अद्वितीय है के बाद से 51।, एक काटा कॉलम, पारित होने के दौरान यांत्रिक आंदोलन और खिला आवृत्ति जोड़ तोड़ द्वारा बोने घनत्व, खिला आवृत्ति और पारित होने से निपटने मिलाना करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग कर सकते हैं। इन चर के बीच से गुजरती उपयोगकर्ता जल्दी से एक नई लाइन की संस्कृति के लिए उपयुक्त परिस्थितियों का एक सेट खोजने के लिए या नई संस्कृति तकनीक विकसित करने के लिए अनुमति देगा। रोबोट प्रणाली भी 96 समानांतर लेकिन स्वतंत्र स्टेम सेल कालोनियों को बनाए रखने में सक्षम है। IPSC दैहिक कोशिकाओं से व्युत्पन्न या आनुवंशिक हेरफेर के बाद क्लोन कर रहे हैं, कई समानांतर क्लोन संभावित IPSC लाइनों उपज के लिए जांच कर रहे हैं। एकल कक्षों 96 अच्छी तरह प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, इस प्रणाली खिला सकते हैं और प्रत्येक कॉलोनी रखने के पारित होने के 96 अच्छी तरह प्लेटें अलग। इस संभावित क्लोन का चयन करते समय बहुत उच्च throughput सक्षम बनाता है और शारीरिक रूप से 96 समानांतर लाइनों के संवर्धन में कठिनाई समाप्त। इस विधि को भी एकसामग्री है कि समानांतर विश्लेषण के लिए आसानी से उपलब्ध है तो llows प्रत्येक क्लोन के उत्पादन को बढ़ाया। अंत में, हम करने के लिए और पूरी तरह से स्वचालित संस्कृति को सक्षम करने इनक्यूबेटर से प्लेटें बचाता है कि एक रोबोट की थाली की तस्करी प्रणाली के साथ इन कल्चर तकनीक को एकीकृत कल्पना। यह यहां वर्णित बुनियादी प्रोटोकॉल अन्य थाली आधारित प्रणालियों के लिए हस्तांतरणीय हैं के बाद से अधिक से अधिक विस्तार के लिए अनुमति है कि और अधिक जटिल रोबोटिक्स के साथ पूरा किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में पता करने के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम को रोकने और 1.5 और 4.2 कदमों जैसे संदूषण के लिए जाँच कर रहे हैं। ऊपर चर्चा के रूप में अच्छा बाँझ तकनीक और सामान्य ज्ञान का उपयोग कर रहे हैं अगर संदूषण, सफलतापूर्वक बचा जा सकता है। यह संकेत दिया चरणों में प्रदूषण और इस प्रोटोकॉल में ऐसा करने के लिए ऑपरेटर की जांच में काफी प्रदूषण के लिए जोखिम कम हो जाएगा कि, भले ही स्टेम सेल संस्कृति प्रारूप की, आवश्यक है। उचित बाह्य मैट्रिक्स जेल आवेदन एक दूसरे ईएसएस हैइस प्रोटोकॉल के समग्र सफलता के लिए ential कदम है। ठीक से 96 अच्छी तरह प्लेटें बिना कोटिंग, स्टेम कोशिकाओं को बढ़ने नहीं दिया जाएगा। एक आम मुद्दा अधूरा अच्छी तरह से कोटिंग है। अनुभव हवा के बुलबुले, electrostatic आकर्षण और केशिका क्रिया को पूरा अच्छी तरह से कोटिंग में बाधा दिखाया है। पूर्व गीला कदम (1.6) काफी अच्छी तरह से नीचे कोटिंग सुधार करने के लिए विकसित किया गया था और छोड़ नहीं होना चाहिए। बाह्य मैट्रिक्स जेल कोटिंग यह समान रूप से अच्छी तरह से नीचे और पक्षों भर में वितरित किया जाता है लागू किया जाता है जब इस पूर्व गीला कदम कि इस तरह के प्लास्टिक के 96 अच्छी तरह से थाली के स्पष्ट hydrophobicity कम करने के लिए प्रकट होता है। यह भी धीरे एक बार भी बाह्य मैट्रिक्स जेल समाधान वितरण सुनिश्चित करने के लिए लेपित एक साफ हाथ के खिलाफ 96 अच्छी तरह प्लेटें दोहन करने के लिए सिफारिश की है। हदबंदी मानकों को भी अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एंजाइम या EDTA आधारित हदबंदी अभिकर्मक के साथ विस्तारित ऊष्मायन या पारित होने के दौरान लक्ष्य नहीं हो सकता है जो एकल कक्षों में परिणाम होगा। इसलिए, ऑपरेटरहदबंदी समय, विचूर्णन बल, और धोने पुनरावृत्ति कॉलोनी आकृति विज्ञान और स्वास्थ्य को प्रभावित और तदनुसार समायोजित कैसे करने के लिए विशेष ध्यान देना चाहिए।
यहाँ वर्णित तकनीकों के लिए सीमाओं को समझना सफल संचालन के लिए सर्वोपरि हैं। किसी भी अन्य सेल संस्कृति की स्थापना में के रूप में, 96 अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग के एक अपेक्षाकृत उच्च संदूषण जोखिम प्रस्तुत करता है। ऊपर वर्णित के रूप में, एक तकनीशियन खिलाने और passaging के दौरान प्रत्येक थाली से निपटने है; उदाहरण के लिए, ढक्कन खोलने रोबोट बिस्तर पर प्लेट डाल, और माइक्रोस्कोप पर थाली जब जाँच। 1.5 कदम के बाद के रूप में विख्यात इसलिए, यह इस तरह के बिस्तर पर sloped हीटिंग ब्लॉक या खड़ी पिन के रूप में किसी भी थाली ढक्कन के अंदर छूने या किसी भी संभावित दूषित सतह के लिए इस हिस्से को बेनकाब करने के लिए नहीं जरूरी है। प्रोटोकॉल के विकास के दौरान इस सीमा की खोज की और बाँझपन बनाए रखने के लिए थाली lids धारण करने के लिए एक रैक को विकसित करने के लिए प्रोत्साहन था। इसी तरह, गर्त जलाशयों, pipet सुझावों और ओवे पर्यावरण के लिए खुला है और तकनीशियन द्वारा नियंत्रित किया जाता है क्योंकि तरल से निपटने रोबोट बिस्तर पर वहाँ की आपूर्ति संदूषण के संभावित स्रोत हैं। इसलिए, अच्छा बाँझ तकनीक से अवगत कराया संस्कृति सामग्री या खुले तरल पदार्थ भर में आंदोलनों को कम करने के रूप में इस तरह लागू किया जाना चाहिए। एक और सीमा प्रोटोकॉल नेत्रहीन> 100 96 अच्छी तरह से प्लेटों की हर अच्छी तरह से जाँच के लिए बढ़ाया गया है जब बोझिल है। यह संदिग्ध कुओं की पहचान करने के लिए, नेत्रहीन ऐसे पंकिल मीडिया के रूप में संदूषण के संकेत के लिए पूरी थाली के निरीक्षण से निपटा जा सकता है। भविष्य पैमाने अप के लिए, एक स्वचालित माइक्रोस्कोप और सेल के विकास और संभावित प्रदूषण की सूचक का उपयोग शामिल किया जाएगा।
सारांश में, यहाँ वर्णित उच्च throughput 96 अच्छी तरह से आधारित प्लेटफॉर्म एक थाली प्रारूप में स्टेम सेल संस्कृति और उत्पादन के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, उच्च निष्ठा तरीका प्रदान करता है। इस विधि सेल संस्कृति, जबकि स्टेम करने के लिए समर्पित अपेक्षित अनुभव, उपकरण आवश्यक है और श्रम समय कम कर देता हैपारंपरिक पक्षपाती संस्कृति के लाभों को बनाए रखने।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच अनुदान, R44 GM087784 और R01 HL109505 में भाग द्वारा समर्थित किया गया है। लेखक विस्तारित तकनीकी सहायता के लिए, गिल्सन पर कांग्रेस तकनीकी और OEM टीम को धन्यवाद।
96-well plates | Corning | 3596 | 96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped |
Seahorse Trough | SeahorseBio | 201308-100 | Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs |
Gilson Tips | Gilson | F167023 | 10 racks gilson 96tips D200 tips |
DMEM/F12 | Life Technologies | 12500062 | DMEM/F12 powder. Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter. |
Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 354230 | Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 mL |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 5857 | mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance. |
E8 Media | StemCell Technologies | 5940 | TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance |
Y27632 | AdooQ BioScience | A11001-50 | Rock inhinitor Y-27632 2HCI |
Accutase | Innovative Cell Technologies | ACCUTASE | Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 mL sterile cell solution |
PBS | Fisher | SH30256FS | PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk |
Gilson PIPETMAX | Gilson | PIPETMAX | http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk |