Abstract
Avanzamento continua in coltura di cellule staminali pluripotenti sta chiudendo il gap tra panchina e comodino per l'utilizzo di queste cellule nella medicina rigenerativa, scoperta di nuovi farmaci e test di sicurezza. Per produrre staminali cellule derivate biofarmaceutica e cellule per l'ingegneria dei tessuti e trapianti, una tecnologia delle celle di produzione-costo-efficacia è essenziale. Manutenzione di pluripotenza e prestazioni stabili delle cellule in applicazioni a valle (ad esempio, la differenziazione cellulare) nel tempo è fondamentale per la produzione di cellule su larga scala. Tuttavia che può essere difficile da raggiungere, soprattutto se le cellule sono coltivate manualmente quando l'operatore può introdurre una significativa variabilità così come essere proibitivo in scala-up. Per abilitare high-throughput, su larga scala la produzione di cellule staminali e rimuovere l'influenza dell'operatore protocolli di coltura cellulare romanzo staminali utilizzando un banco multicanale movimentazione robot liquido sono stati sviluppati che richiedono il coinvolgimento tecnico minima o esperienza. Conqueste cellule staminali pluripotenti indotte umane protocolli (iPSCs) sono state coltivate in condizioni di assenza di alimentazione direttamente da un magazzino congelati e conservati in piastre da 96 pozzetti. A seconda linea cellulare e tasso scale-up desiderato, l'operatore può facilmente determinare quando il passaggio sulla base di una serie di immagini che mostrano le densità colonia ottimali per spaccare. Poi i reagenti necessari sono pronti per eseguire una colonia divisione di nuove piastre senza una fase di centrifugazione. Dopo 20 passaggi (~ 3 mesi), due linee IPSC mantenuto cariotipi stabili, hanno espresso marcatori di cellule staminali, e differenziate in cardiomiociti ad alta efficienza. Il sistema può effettuare la successiva high-throughput screening di nuovi protocolli di differenziazione o la manipolazione genetica progettati per piastre a 96 pozzetti. Questa tecnologia consentirà di ridurre il carico di lavoro e tecniche per la produzione di un gran numero di cellule staminali identiche per una miriade di applicazioni.
Introduction
L'uso di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) è aumentato in modo significativo dal loro derivazione nel 2007 1 per il test composto, medicina rigenerativa e modellazione malattia 2-6. Questa richiesta viene dalla capacità di IPSC per produrre un gran numero di cellule pluripotenti che possono essere differenziate in cellule somatiche in una quantità senza precedenti. Poiché le tecniche di differenziazione dirette migliorano 7-10 e lo sviluppo di cellule umane o di modellazione dei tessuti e terapia cellulare aumenta 11-14, così fa la richiesta di produzione di massa di iPSCs di alta qualità. E 'ampiamente citato che tra le altre malattie, l'infarto miocardico o la sostituzione funzionale b-cellule richiederanno centinaia di milioni di miliardi di IPSC derivate cellule somatiche 15 - 18. Modellazione 3D dei tessuti, inoltre, sempre più complesso per la scoperta di farmaci e therapy chiederemo gran numero di cellule 9,13,19. In tutti questi esempi, definiti, uniforme e iPSCs riproducibili devono essere disponibili e semplice da produrre.
Per produrre staminali cellule derivate biofarmaceutica e cellule per l'ingegneria dei tessuti e trapianti, una tecnologia delle celle di produzione-costo-efficacia è essenziale. La produzione in scala di iPSCs si è concentrata sulla coltura in sospensione 20 - 25 o sospensione con l'utilizzo di substrati microcarrier 26-28 anche perché queste tecniche vengono distribuiti con successo su larga scala, non IPSC, produzione con sede eucarioti. Diversi gruppi hanno dimostrato sistemi di coltura sospensione che producono cellule staminali pluripotenti 20,21,23,24,29. Tuttavia, questi approcci utilizzano sistemi costosi e complessi non immediatamente disponibili ai ricercatori in via di sviluppo programmi di differenziazione romanzo, guidando l'ingegneria dei tessuti e facendo laboratricerca ory scala. Inoltre, sospensione e microcarrier IPSC culture richiedono un adeguamento e di tecniche o prodotti chimici che non si trovano in cultura tradizionale aderente iPSC come l'uso continuo di inibitore di Rho-chinasi, agenti antischiuma e filtrazione per regolare aggregazione. Lo stress fisico alle cellule è più prevalente in coltura in sospensione, introdotto mediante agitazione meccanica e durante microcarrier collisione. Questi problemi limitano la prevedibilità e la velocità con cui appena generato linee di cellule staminali possono essere coltivate in sospensione. Altri hanno sviluppato sistemi di movimentazione piastra robotici che imitano piastra tecniche di coltura 30,31 ma queste piattaforme richiedono significativi investimenti per attrezzature e competenze per operare in aggiunta alle sfide fondamentali associati alla cultura di cellule staminali.
Il seguente lavoro descrive lo sviluppo e la pratica di una soluzione scalabile sistema di coltura IPSC che utilizza un liquido robotica 8 canali standard di self-containedpiastre gestore e 96 pozzetti. Questo metodo è stato progettato per colmare scala di laboratorio cultura IPSC e ad alto volume di produzione IPSC (ad esempio, 10 7-1,5 x 10 9 cellule per settimana a tecnico) che permettono quelle sviluppo di nuove tecnologie IPSC di scalare facilmente la produzione senza grandi investimenti hardware o di lavoro. Questo metodo è relativamente poco costoso da installare, richiede poco o nessun coltura di cellule staminali, programmazione o ingegneria esperienza, ha un ingombro apparecchiatura senza la necessità di una cappa di coltura cellulare dedicato, e utilizza attrezzature di coltura cellulare standard per consentire medio ad alto rendimento automatizzato la produzione di cellule. L'obiettivo era quello di sviluppare un sistema in grado di coltura di cellule staminali scalabile che può essere utilizzato da laboratori nuovi per arginare coltura cellulare, coloro che trovano la coltivazione manuale una barriera per sviluppare le proprie idee o coloro che desiderano un mezzo economico per la produzione di un gran numero di cellule staminali. La piattaforma presentata qui rimuove influenza tecnico sustaminali coltura cellulare e normalizza le modalità di alimentazione e di passaggio per consentire la produzione di cellule staminali coerente.
Protocol
Il sistema di gestione dei liquidi robotizzato, che per i seguenti protocolli era pipetmaX di Gilson, facilita automatizzato, coltura di cellule staminali scalabile e di produzione, pur mantenendo condizioni tradizionali di coltura aderente nel formato piastra a 96 pozzetti. Come cultura tradizionale 6 pozzetti, iPSCs sono coltivati con questo protocollo come un monostrato di colonie distinte ma nel formato piastra a 96 pozzetti. Ogni bene può essere isogenico o distinte e sia la configurazione può essere coltivato in parallelo dal momento che il robot può mantenere ogni bene segregata. Il tipico robot iPSC cultura di routine ha due fasi: un programma di alimentazione in cui le culture vengono alimentate su un programma personalizzabile ed un programma di passaggio in cui l'utente sceglie il metodo di dissociazione e rapporto di divisione controllando così la densità di semina e il tasso di scala. I seguenti protocolli descrivono le modalità di avvio di una nuova cultura, come si compiono alimentazione e di passaggio e dei programmi complementari che favoriscono la cultura IPSC.
1. Preparazione matrice extracellulare Gel piastre rivestito da 96 pozzetti
- Rimuovere l'imballaggio di sei nuove, RT piastre da 96 pozzetti e metterli sulla gestione base del robot nelle posizioni 2, 3, 5, 7, 8, 9 (vedi Figura 1 A per le posizioni di letto) liquido.
- Posizionare un pre-raffreddata, a 4 ° C attraverso 4 bene in posizione letto 6.
- Carico di colonna 12 del rack punta in posizione 1 letto con pre-refrigerati, 4 ° C a 200 consigli microlitri pipetta.
- Riempite la vasca prima (a sinistra più) bene in posizione letto 6 con 25 ml a 4 ° C DMEM / F12 versando un'aliquota con tecnica sterile. In alternativa, utilizzare una pipetta per completare il trasferimento.
- Rimuovere i coperchi piastra a 96 pozzetti e far scorrere ogni all'interno del rack tenendo coperchio piatto appositamente progettato (PLHR, vedi Figura 1A). Evitare il contattocon l'interno dei coperchi piastra.
Nota: movimentazione all'interno di un coperchio piatto o impilare i coperchi piastra in cui l'interno di un coperchio tocca la parte esterna di un altro è un percorso eccellente per contaminazione. - Utilizzando il robot di controllo touch pad, premere la seguente serie di pulsanti per avviare il processo di pre-bagnare bene:
- Toccare "Esegui un protocollo".
- Selezionare "extracellulare gel matrice Bagnare tempestivamente" e tocca accanto.
- Decisione Utente: Toccare "giro di prova" per utilizzare la procedura guidata passo-passo per pre-testare il programma selezionato.
Nota: Il robot non ma piuttosto il software verifica il protocollo per problemi di software. Con protocolli stabiliti, maschiatura, "salta setup" è accettabile. - Toccare "Run Protocol".
- Durante il processo di pre-bagnatura (passo 1,6) passare al punto 1.8.
- Scongelare su ghiaccio una 4 mg un'aliquota del fattore di crescita ridotto gel matrice extracellulare (GFRM) contenuto in un 50 mltubo conico conservato a -80 ° C. Mantenere la aliquota in ghiaccio fino al momento dell'uso.
Nota: Il GFRM rafforzerà se il permesso di venire a RT e non sarà utile. - Risospendere il 4 mg GFRM aliquota in 24 ml 4 ° C DMEM / F12 con un bicchiere pipetta 25 ml. Quando si trasferisce il DMEM / F12, mettere in pausa per 2-3 secondi per consentire alla pipetta raffreddare prima di risospendere l'aliquota GFRM.
- Quando il processo di pre-bagnatura (passo 1,6) è stata completata, passare al punto 1.11.
- Trasferire 24 ml di miscela di GFRM DMEM / F12 al quarto pozzo del canale in posizione letto 6.
- Utilizzando il robot di controllo touch pad, premere la seguente serie di pulsanti per avviare il processo di rivestimento extracellulare gel matrice:
- Toccare "Esegui un protocollo".
- Selezionare "extracellulare aliquota gel matrice" e tocca accanto.
- Decisione Utente: Toccare "giro di prova" per utilizzare la procedura guidata passo-passo per pre-testare il programma selezionato.
Nota: Il robot non funziona ma rather il software test il protocollo per problemi di software. Con protocolli stabiliti, maschiatura, "salta setup" è accettabile. - Toccare "Run Protocol".
- Quando passo 1.12 è completo, sostituire i coperchi piastra.
- Trasferire i gel spalmato piastre a 96 pozzetti matrice extracellulare a 37 ° C, 5% di CO 2, incubatore umidificato e tenere lì per 24 ore a questo punto i piatti saranno pronti per l'uso o memorizzati.
Nota: In circostanze attenuanti, le lastre al gel matrice extracellulare nuova rivestiti possono essere utilizzati dopo 15-30 minuti di incubazione, ma O / N a 24 ore di incubazione è raccomandato. - Protocollo Ripetere i passaggi 1.1, 1.3, 1.5-1.6, 1.10, e 1,12-14 finché tutte le DMEM / F12 con GFRM viene utilizzato.
2. Memorizzazione matrice extracellulare Gel rivestite piastre con 96 pozzetti
- Rimuovere gel matrice rivestite piastre a 96 pozzetti extracellulari dalla 37 ° C, 5% CO 2, incubatore umidificato.
- Optional: Allow la matrice extracellulare piastre da 96 pozzetti di gel rivestito per venire a RT prima di procedere alla fase 2.3.
Nota: Questa operazione facoltativa ridurre la condensa costruire quando le piastre sono posizionati a 4 ° C. - Posizionare le piastre sul trattamento bed robot liquido nelle posizioni 2, 3, 5, 7, 8, 9 (vedi figura 1A per le posizioni letto).
- Carico di colonna 12 del rack punta in posizione 1 letto con RT 200 punte microlitri pipetta.
- Mettere un serbatoio quattro trogolo in posizione letto 6.
- Riempire ben 4 (destra) del serbatoio con RT DMEM / F12.
- Rimuovere i coperchi piastra a 96 pozzetti e far scorrere ogni nella PLHR.
- Utilizzando il robot di controllo touch pad, premere la seguente combinazione di tasti:
- Toccare "Esegui un protocollo".
- Selezionare "extracellulare aliquota gel matrice" e tocca accanto.
- Decisione Utente: Toccare "giro di prova" per utilizzare la procedura guidata passo-passo per pre-testare il programma selezionato.
Nota: Il robot non viene eseguito, ma piuttosto il software mette alla prova il protocollo per problemi di software. Con protocolli stabiliti, maschiatura, "salta setup" è accettabile. - Toccare "Run Protocol".
- Una volta completato, sostituire i coperchi piastra e rimuovere le piastre dal basamento della macchina.
- Avvolgere intorno all'intero lato di ciascun gel matrice extracellulare rivestito piastra a 96 pozzetti (dove il coperchio incontra piatto) con un pollice dalla striscia parafilm 6 pollici. Assicurati di allungare la pellicola di paraffina per creare una chiusura ermetica.
- Opzionale: Etichettare i piatti con la data di completamento del rivestimento in gel matrice extracellulare, il numero extracellulare gel matrice molto, il nome utente e qualsiasi altra informazione.
- Conservare le piastre a 4 ° C dove saranno buoni da utilizzare per un massimo di due settimane.
Nota: Piastre sono state usate con successo oltre il limite di due settimana, tuttavia, non è consigliabile.
3. Esecuzione di una colonia di cellule staminali Seeding DensitàGradiente nel 96 pozzetti Formato Da un piatto cultura Live o congelati: come avviare o ripristinare intervalli Passage normali a una linea di cellule staminali
- Oppure con la cultura congelato, passare al punto 3.2. Se a partire da una coltura di cellule staminali dal vivo già su un piatto, iniziare dal passaggio 3.5.
- Scongelare la cultura congelato agitando il tubo in un bagno di 37 ° C fino allo rimane solo un piccolo pezzo di ghiaccio.
- Opzionale: Diluire le cellule scongelate in 10 ml di RT staminali supporti la crescita cellulare (SCGM), centrifugare per 2 minuti a 300 xg, aspirare i media surnatante e risospendere il pellet di cellule staminali in 7 ml SCGM fresco contenente 10 micron Y27632.
Nota: Questo passaggio elimina riporto dei mezzi di comunicazione di congelamento. - Passare al punto 3.6.
- Se a cominciare dal vivo, già placcato le cellule staminali: le cellule di passaggio come al solito con la dissociazione enzimatica o non enzimatico. Cercate di raccogliere un totale di 1,5-3.000.000 cellule; di solito un pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Centrifugare le cellule raccolte per2 min a 300 xg, aspirare i media surnatante e risospendere il pellet di cellule staminali in 7 ml SCGM fresco contenente 10 micron Y27632. Passare al punto 3.6.
- Assicurarsi che le cellule, sia da una cultura congelati o dal vivo, sono sospesi in 7 ml di RT SCGM con 10 micron Y27632.
- Carico di colonna 12 del rack punta a letto posizione uno con RT 200 punte microlitri pipetta.
- Mettere un serbatoio quattro trogolo a letto posizione 2.
- Posizionare un nuovo gel matrice extracellulare rivestito piastra a 96 pozzetti pre-riscaldato a 37 ° C in posizione letto 5 e rimuovere il coperchio mettendolo in PLHR.
- Trasferire i 7 ml di cellule risospese a pozzetto 3 del serbatoio da pipetta sterile o versare.
- Utilizzando il robot di controllo touch pad, premere la seguente combinazione di tasti:
- Toccare "Esegui un protocollo".
- Selezionare "gradiente di densità di semina" e tocca accanto.
- Decisione Utente: Toccare "giro di prova" per utilizzare la procedura guidata passo-passo per pre-testare la selezioneProgramma ed.
Nota: Il robot non ma piuttosto il software verifica il protocollo per problemi di software. Con protocolli stabiliti, maschiatura, "salta setup" è accettabile.
- Toccare "Run Protocol".
- Quando la serie di diluizione è completa, ri-coprire la piastra e posto a 37 ° C, 5% CO 2, incubatore umidificato fino l'alimentazione successiva.
- Optional: Etichettare la piastra con la data, informazioni ceppo, il nome utente, il tipo di supporto e altre informazioni pertinenti.
- Nel corso dei prossimi giorni, alimentare la piastra a 96 così come richiesto utilizzando il protocollo 4 di seguito.
Nota: un piatto tipico delle cellule staminali sarà necessario un cambiamento multimediale completo una volta ogni 24 ore e il SCGM non contiene Y27632 per l'alimentazione; solo durante la semina iniziale dopo il passaggio. Prima di alimentazione, controllare la piastra per la contaminazione e la densità delle colonie. Vedere il punto 3.16 per ulteriori informazioni sul monitoraggio della densità colonia. - Nel corso dei prossimi giorni, più colonne vicino al centrare della piastra (di solito 5-8 colonne) si avvicinerà una densità ideale per il passaggio; identificare questa densità, confrontare la piastra a 96 pozzetti per la gamma di densità mostrato in Figura 3B con le seguenti informazioni in mente:
- Passaggio quando lo spazio tra la maggioranza delle colonie è circa il 25% del diametro di una colonia adiacente.
Nota: Il razionale per identificare il tempo di passaggio è che un altro ciclo di alimentazione e la crescita comporterebbe colonie fanno contatto, che dovrebbe essere evitato.
- Passaggio quando lo spazio tra la maggioranza delle colonie è circa il 25% del diametro di una colonia adiacente.
- Per avviare un piatto uniformemente diluito e cominciare cultura regolare, selezionare una colonna che è alla densità ideale e passaggio. Vedere protocollo 5 passaggio.
4. di alimentazione a 96 pozzetti colonie Piastra cellule staminali
Nota: Il seguente protocollo descrive l'alimentazione di uno dei 96 pozzi staminali piatto colonia di cellule. La tecnica può essere scalata per accogliere 6 piastre totale in parallelo.
- Rimuovere il 96 pozzetti stem piatto colonia cella dal 37 ° C, 5% di CO 2, incubatore umidificato.
- Controllare la piastra per la contaminazione e la densità delle cellule. Al fine di alimentare, in modo che la densità colonia è sotto la densità di passaggio ideale. Vedere la Figura 3B per informazioni sulla densità.
Nota: La contaminazione può presentare media come torbidi ed essere accompagnato da un odore sgradevole. Piccolo, aggregati ovviamente non IPSC possono essere visibili sotto controllo microscopico. Per valutare densità cellulare, vedi sopra punto 3.16.1. - Posizionare la piastra colonia di cellule staminali da 96 pozzetti in posizione letto 3 su una pendenza, 37 ° C rampa.
- Carico di colonna 12 del rack punta in posizione 1 letto con RT 200 punte microlitri pipetta.
- Posizionare un trogolo 4 bene a letto posizione 2.
- Riempire bene 3 del canale in posizione letto 2 con 8 ml di fresco, RT SCGM senza Y27632 o da sterili versare o pipetta di trasferimento.
- Rimuovere la piastra a 96 pozzetti staminali colonia di cellule coperchio inserirlo nella PLHR.
- Usando ilrobotica di controllo touch pad, premere la seguente combinazione di tasti:
- Toccare "Esegui un protocollo".
- Selezionare "Colony feed One Piatto" e toccare Avanti.
- Decisione Utente: toccare "giro di prova" per utilizzare la procedura guidata passo-passo per pre-testare il programma selezionato.
Nota, il robot non ma piuttosto il software verifica il protocollo per problemi di software. Con protocolli stabiliti, maschiatura, "salta setup" è accettabile. - Toccare "Run Protocol".
- Quando il protocollo di traino è dotato, ri-coprire la piastra a 96 pozzetti colonia cellule staminali e tornare al 37 ° C, 5% CO 2, è necessaria incubatore umidificato fino alla somministrazione successiva o passaggio. Questo è di solito necessario dopo 24 ore.
Nota: Si consiglia di registrare l'evento di alimentazione sulla piastra di copertura con la data, tipo di supporto, il nome utente e altre informazioni pertinenti.
5. Passaging 96 pozzetti Plate staminali colonie di cellule
- Dopo diversi cicli di alimentazione piastra colonia a 96 pozzetti cellule staminali sarà pronto per il passaggio. Questo protocollo descrive il passaggio di una colonna di una piastra a 96 pozzetti, che rappresenta un rapporto di 01:12 di divisione. L'utente può definire il rapporto di divisione e selezionare qualsiasi numero di pozzi o colonne di dividere, tra cui la scelta di pozzi che potrebbero non essere adiacente.
- Confrontare il 96 pozzetti cellule staminali densità piatto colonia alla figura 3B per determinare se il passaggio. La densità ideale passaggio è quando lo spazio tra la maggioranza delle colonie è circa il 25% del diametro di una colonia adiacente o un'alimentazione successiva comporterebbe colonie crescenti uno nell'altro.
- Esaminare la piastra di colonia di cellule staminali a 96 pozzetti al microscopio per garantire che non vi è alcuna contaminazione.
- Posizionare la piastra colonia di cellule staminali da 96 pozzetti in posizione letto 3 su una pendenza, 37 ° C rampa.
- Carico colonne 8-12 nel rack punta di carico in posizione 1 letto con RT 200 microlitri pipettasuggerimenti.
- Posizionare un trogolo 4 bene a letto posizione 2.
- Lascia ben depressione 1 vuoto, mettere 8.5 ml SCGM + 10 micron Y27632 in ben 2, mettere 3.5 ml 30% proteolitici e il reagente di dissociazione collagenolitica (o reagente di dissociazione basato EDTA) in ben 3, mettere 4.5 ml di soluzione in ben 4.
Nota: Tutti i reagenti possono essere a temperatura ambiente o 37 ° C. RT proteolitici e collagenolitica reagente di dissociazione al 30% diluito con PBS è stato utilizzato per il adiposo e fibroblasti derivati cultura iPSC qui descritto. - Posizionare un nuovo 37 ° C gel matrice extracellulare rivestito piastra a 96 pozzetti, preriscaldata in posizione matrimoniale 5.
- Rimuovere il 96 pozzetti cellule staminali piastra colonia coperchio, così come il nuovo coperchio piastra a 96 pozzetti e entrambi posizionare nel PLHR.
- Utilizzando il robot di controllo touch pad, premere la seguente combinazione di tasti:
- Toccare "Esegui un protocollo".
- Selezionare "Colony Split 01:12 Colonna 1" e tocca accanto.
- Decisione Utente: Toccare "giro di prova" per usarela procedura guidata passo-passo per pre-testare il programma selezionato.
Nota: Il robot non ma piuttosto il software verifica il protocollo per problemi di software. Con protocolli stabiliti, maschiatura, "salta setup" è accettabile. - Toccare "Run Protocol".
- Una volta che il protocollo di passaggio ha finito, ri-coprire entrambe le piastre.
- Optional: Etichettare la nuova piastra con le informazioni necessarie (ad esempio, la data, linea cellulare, il numero di passaggio, il tipo di supporto, nome utente, ecc).
- Ritorna entrambe le piastre a 37 ° C, 5% CO 2, è necessaria incubatore umidificato fino alla somministrazione successiva o passaggio. Nota: L'alimentazione successiva è in genere dopo 24 ore.
Nota: Le cellule e colonie dovrebbe attribuire alla piastra entro 2-3 ore di scissione e guardare molto sparsi. Ciò è dovuto alla presenza di inibitore Rho-chinasi e le cellule si condensa e mostra la morfologia delle cellule staminali caratteristica (cioè, ciottoli imballato colonie with piccolo volume cellulare per il grande rapporto di nucleo) dopo la prima poppata libera inibitore della Rho-chinasi.
6. Raccolta 96 pozzetti Cellule staminali Piastra per Produzione
Nota: colonie di cellule staminali possono essere raccolti per l'utilizzo in qualsiasi momento durante la coltura. Di solito ciò si verifica quando le cellule sono pronte per passaggio (vedi protocollo 5). Questo protocollo descrive come raccogliere undici colonne da una piastra di colonia 96 pozzetti cellule staminali.
- Esaminare la piastra di colonia di cellule staminali a 96 pozzetti al microscopio per garantire che non vi è alcuna contaminazione.
- Posizionare la piastra colonia di cellule staminali da 96 pozzetti in posizione letto 3 su una pendenza, 37 ° C rampa.
- Colonne di carico 11 e 12 nel rack punta di carico in posizione 1 letto con RT 200 punte microlitri pipetta.
- Posizionare un trogolo 4 bene a letto posizione 2.
- Lascia ben depressione 1 vuoto, mettere 8.5 ml SCGM in ben 2, ha messo 3,5 ml 30% proteolitici e reagente collagenolitica dissociazione (o EDTA basato reagente di dissociazione) in ben3, ha messo 4,5 ml di soluzione in ben 4.
Nota: Tutti i reagenti possono essere a temperatura ambiente o 37 ° C. - Rimuovere la piastra coperchio 96 pozzetti staminali colonia di cellule e posto nel PLHR.
- Utilizzando il robot di controllo touch pad, premere la seguente combinazione di tasti:
- Toccare "Esegui un protocollo".
- Selezionare "Colonne Colony Harvest 2-12" e tocca accanto.
- Decisione Utente: Toccare "giro di prova" per utilizzare la procedura guidata passo-passo per pre-testare il programma selezionato.
Nota: Il robot non ma piuttosto il software verifica il protocollo per problemi di software. Con protocolli stabiliti, maschiatura, "salta setup" è accettabile. - Toccare "Run Protocol".
Nota: Al termine della procedura di raccolta è completa, le cellule saranno in depressione ben 2 e pronto per il ritiro.
Representative Results
Sviluppo di uno stelo robotica piattaforma coltura cellulare piastra base.
La domanda di iPSCs è in crescita a causa della loro utilità nello sviluppo di farmaci e nella medicina rigenerativa. Eppure la produzione scalabile si è concentrata sulla coltura in sospensione 32 in attrezzature relativamente complessa che esclude molti ricercatori e diverge da metodi di coltura aderenti stabiliti. Invece di alterare drasticamente targa comprovata staminali basato metodi di coltura cellulare, come il passaggio ad una cultura di sospensione o utilizzando un microcarrier, ci siamo concentrati sulla miniaturizzazione e automatizzando le nostre tecniche di coltura IPSC aderenti esistenti. Il primo obiettivo era di automatizzare l'alimentazione e passaging per normalizzare l'intero processo di coltura. È stato anche richiesto una piattaforma capace di rapida scala con la tecnologia esistente. Per raggiungere questi obiettivi il metodo è stato concepito per le cellule staminali della cultura in un piatto da 96 pozzetti che utilizzano un sistema di gestione dei liquidi automatizzato (Figura 1). Il protocols sviluppati qui con il robot di gestione dei liquidi per l'alimentazione ed il passaggio non richiedono una fase di centrifugazione o monitoraggio continuo da un tecnico. Questi protocolli sono stati sviluppati con due linee di alimentazione libere IPSC; uno derivato da fibroblasti e l'altro da cellule adipose 33.
Il sistema di gestione dei liquidi controllato da computer (Figura 1A) è costituito da una lastra piana che si muove anteriore e posteriore. Il letto ha nove, circa 5 x 3,3 pollici recessi numerati con pressione fermagli per accettare piastre di coltura delle cellule normali, i serbatoi di liquidi e altro hardware personalizzato. La testina di pipette sposta da sinistra a destra (perpendicolare al movimento letto), così come su e giù. Insieme con il letto, la testa pipetta può essere programmato per rimuovere o fornire supporto ovunque sul letto dopo aver raccolto le punte delle pipette da un rack ricaricabile. Se necessario, ciascuno dei 96 pozzetti può essere separata per eliminare la contaminazione incrociata. Nella configurazione attuale, 0 a200 ml di supporti possono essere spostati da ogni punta della testa pipetta, ma altre gamme di volume sono possibili in base alle dimensioni punta.
Quando passaging cellule staminali in piastre standard, enzimatici o dissociazione chimica in genere richiede incubazione a 37 ° C. I test iniziali confermato dissociazione con proteolitica e collagenolitica reagente di dissociazione o un reagente a base EDTA risultati migliori a 37 ° C di RT sia per il tempo di dissociazione e omogeneità delle dimensioni delle colonie prodotti per i nostri due 96 pozzetti linee IPSC (dati non mostrati). Per automatizzare il processo di scissione e di evitare lo spostamento piastre dentro e fuori di un incubatore, inclinate, rampe di temperatura controllata che accettano e riproducibile posizionare piastre di coltura standard sono state costruite (Figura 1A). Quando le rampe sono stati riscaldati a 37 ° C, un proteolitica e collagenolitica reagente di dissociazione o EDTA dissociazione base delle iPSCs di piastre a 96 pozzetti era paragonabile alle piastre poste a 37 ° C incubatore (dati not mostrato). Le rampe inclinate sono stati anche utilizzati per consentire puntali di raccogliere i contenuti di un intero e (meno di 5 uL volume residuo) raggiungendo il punto più basso nel pozzo, mentre l'aspirazione da una lastra piana lasciato un volume residuo di circa 10-15 microlitri, risultante in perdita di cellule. La rampa inclinata anche permesso ai pozzetti da lavare (triturati) estraendo supporto nella parte superiore del pozzo inclinato e per raccogliere in fondo.
Cultura robotica di cellule staminali nel formato piastra a 96 pozzetti; alimentazione e passaging.
Cultura iPSCs utilizzando il sistema di gestione dei liquidi robotizzato ha due fasi; passaggio e l'alimentazione. Quando una colonia è pronto per il passaggio, questo viene suddiviso in un predeterminato rapporto per inizializzare una nuova piastra che viene poi alimentata ad intervalli regolari fino a quando non è pronto per il passaggio di nuovo (Figura 1B). Culture congelati o non 96 pozzetti possono essere avviati nel formato a 96 pozzetti e comporre immediatamente il passaggio / alimentazioneciclo. Le cellule che non sono utilizzati per mantenere la colonia, che è la maggioranza di una piastra, sono raccolte per altri usi e rappresentano la componente produzione di questo sistema.
Alimentazione 96 pozzetti iPSCs coltura è raggiunto quando alcuni o tutti i media viene rimosso dopo un periodo di coltura e depositato in un serbatoio dei rifiuti. Poi mezzi freschi è frazionare la stessa targa. Il robot può utilizzare nuovi suggerimenti e le depressioni dei media per separare ogni bene per l'alimentazione completamente personalizzabili, tra cui la miscelazione mezzi condizionati con i nuovi media.
Tipico passaggio delle cellule staminali richiede un metodo di dissociazione e spesso una fase di centrifugazione. I protocolli descritti qui mira a normalizzare la dissociazione ed eliminare centrifugazione. Il protocollo passaggio inizia quando il robot trasporta reagente di dissociazione per piastre a 96 pozzetti montato su 37 ° C rampe inclinate. Dopo un tempo prestabilito, le cellule dissociate vengono raccolti con una azione di lavaggio in cui l'utente ha Control la posizione, la ripetizione, volume e frequenza triturazione. Enzima tempo, il tasso di triturazione e il numero di ripetizioni triturazione erano sufficienti a variare le dimensioni delle colonie dissociata e omogeneità (Figura 2), ma ogni parametro è regolabile per adattarsi a esigenze di un determinato linee cellulari. Questo controllo rimuove variabilità introdotta da tecnici che pipetta con aliquote diverse, posizioni e ripetizioni. Una volta che le cellule dissociate sono raccolti e raggruppati in un serbatoio con mezzi freschi, sono distribuiti ad una nuova piastra. Per evitare di centrifugazione e semina problemi dal degrado substrato o morte cellulare a causa di enzimi azione, reagente di dissociazione è stato diluito al punto di minimo di dissociazione accettabile che ha provocato semina affidabile. Questa tecnica è efficace per una proteolitica e collagenolitica reagente dissociazione mTeSR1 medio 34, che ha un relativamente alto contenuto proteico, ma anche efficace in mezzi a basso contenuto proteico come Essential-8 35
Controllare la densità di semina di cellule staminali dopo il passaggio è fondamentale per coltura di cellule staminali di routine e di successo. Semina troppo basso o alto può causare differenziazione ectopica e perdita di pluripotenza oltre a causare intervalli passaggio irregolari. Coltura di cellule staminali tipica si basa su rapporto di divisione dove un pozzetto di un 6-pozzetti è usato per seminare un intero nuovo 6-pozzetti (1: 6 split). Con la movimentazione del robot liquido questo rapporto può essere regolata secondo le esigenze dell'utente (ad esempio, 1: 6, 1: 9, 1:12, ecc) ed ha più influenza sull'intervallo passaggio. Il robot può raccogliere meno di una colonna, una intera colonna (8 pozzetti), o più di una colonna a seconda delle esigenze dell'utente, che dovrebbero essere determinate empiricamente. Le iPSCs adiposo e fibroblasti derivati mantenuto un regolare programma di tre giorni che si alimenta con il passaggio al quarto giorno in cui dividere 01:12. In questo caso una colonna è stato raccolto ed utilizzato per inizializzare una nuova piastra a 96 pozzetti, creando un 1:12 split con ogni ciclo (Figura 3A). I restanti 11 pozzi sono stati poi disponibili per applicazioni a valle. Per raccogliere questi 11 pozzi di produzione, il protocollo di passaggio è stato ripetuto eccetto le cellule sono state depositate in un trogolo di raccolta. In alternativa, le cellule possono essere lasciati sulla piastra e usati direttamente.
Per raggiungere passaggio densità di semina coerente passaggio senza contare, e mantenere un programma splitting di routine I protocolli richiedono suddividere lo stesso numero predeterminato di colonne quando la colonia è ad una densità ideale per passaggio. Per aiutare gli utenti a identificare la densità corretta per il passaggio, una serie di immagini è stata generata mostra una gamma di densità con una densità ideale passaggio evidenziata (Figura 3B). Per determinare quando passaggio, un tecnico esamina la piastra e lo confronta con la scala dell'immagine densità. L'ideaDensità l per il passaggio è stato determinato dalla cultura dei iPSCs adipose e fibroblasti derivati ed è risultato essere quando lo spazio tra la maggior parte delle colonie era di circa il 25% del diametro colonia adiacente. È importante che le colonie distribuire omogeneamente. Questa quantità di separazione colonia correlato con la densità massima desiderabile perché un ciclo di alimentazione supplementare provocherebbe colonie toccano, che è un trigger per differenziazione ectopica.
Un protocollo necessario sviluppato qui indirizza come avviare una cultura nel formato a 96 pozzetti e come reimpostare una cultura dopo un problema di densità. Quando si avvia una nuova cultura, la migliore densità di semina e il numero di cicli di alimentazione prima passaging sono sconosciuti. Per garantire una densità utile dopo la semina, il robot distribuisce cellule esistenti o decongelati attraverso una piastra a 96 pozzetti in una diluizione seriale (Figura 4A). Risultati dell'esempio di tale gradiente sono mostrati nella Figura 4B-E. Dopo diversi alimentazionecicli, alcune colonne avvicinano la densità ideale per dividere, a quel punto un tecnico utilizza il robot per seminare una piastra uniformemente diluito per avviare la cultura regolare. Questo protocollo gradiente di densità è stato anche utilizzato per ripristinare intervalli regolari e di passaggio colonia omogeneità a un piatto irregolare. Se il passaggio è in ritardo o perdere, la densità delle colonie e le dimensioni diventano troppo alti, mentre se il passaggio è troppo presto, la densità colonia è troppo basso e singole colonie può diventare troppo grande, senza essere uniformemente distribuiti in tutto il bene. Il protocollo gradiente di densità di risolvere questi problemi e permette all'utente di riavviare con la scelta di un set ideale seminato di pozzi.
Due linee IPSC rimasti pluripotenti dopo 3 mesi di coltura robotica.
Manutenzione della pluripotenza delle cellule staminali può essere influenzato negativamente da condizioni di coltura 36,37. Per valutare se adiposo e fibroblasti derivati linee IPSC (a-IPSC, f-IPSC, rispettivamente) mantenuto pluripotency quando coltivate robotizzato in piastre da 96 pozzetti per un periodo di tempo prolungato, le due linee sono state coltivate sul robot manipolatore come descritto sopra per 3 mesi e poi marcatori pluripotenza stati esaminati liquido. Per questo periodo entrambe le linee sono stati diversi passaggi con un reagente di dissociazione proteolitica e collagenolitica maggiore di 20 volte senza centrifugazione. Piastre a 96 pozzetti fissi da un-IPSC e linee f-IPSC colorate per Oct4 e Nanog esposti nucleare accumulazione di questi marcatori, mentre è stata osservata SSEA-4 sulla superficie cellulare (Figura 5A-L). Ciò è coerente con le precedenti relazioni per iPSCs pluripotenti 38-41. Controcolorazione con DAPI non ha evidenziato celle aggiuntive che non erano anche positivo per i tre marcatori pluripotenza. Anomalie cromosomiche sono comunemente osservati durante coltura di cellule staminali 42,43, ma non possono influenzare la distribuzione di marcatori pluripotenza come quelle mostrate in Figura 5A-L. Kanalisi aryotype rivelato entrambe le linee IPSC robot diversi passaggi avevano 46 cromosomi normali, suggerendo il metodo cultura robot non ha introdotto instabilità cromosomica al di là di ciò che potrebbe accadere normalmente (Figura 5 M-N).
Per sondare l'espressione genica di cellule staminali stabilito marcatori 1,41,44,45 nelle linee IPSC robotizzato coltivate, l'RNA totale è stato raccolto in parallelo per la colorazione e l'analisi del cariotipo. Entrambe le piastre a 96 pozzetti linee IPSC avevano simile espressione di marcatori pluripotenza Nanog, POU5F1 e REX1 mentre cardiomiociti differenziati da ogni riga no, e neppure una riga separata di fibroblasti dermici umani (HDFs) (Figura 6). I cardiomiociti derivati da entrambe le linee erano MYL7 positivi mentre i HDFs e cellule staminali non hanno espresso MYL7. Entrambe le linee IPSC sono stati differenziati in cardiomiociti con la piccola molecola, Wnt tecnica di manipolazione percorso descritto recentemente 46 (Figura 7). Differenziazione in cardiomiociti nel formato a 96 pozzetti avuto successo in più del 80% dei pozzetti (dati non mostrati). Insieme, questi dati suggeriscono 3 mesi e più di 20 brani di cultura robotica portato nelle cellule cromosomicamente normali che presentano un programma di trascrizione coerente con pluripotenza che erano anche in grado di differenziazione in cardiomiociti.
Figura 1. Panoramica della robotica apparecchiature coltura di cellule staminali e tipico della cultura di routine IPSC. (A) sistema di gestione dei liquidi Robotic mostrato con il layout tipico letto per 96 pozzetti staminali coltura cellulare. Nuove punte sterili pipetta (Tips), contenitore di rifiuti punta estraibile (rifiuti), multi-canale e autoclave per tenere richiesti reagenti liquidi (liquidi), piastre da 96 pozzetti sono posizionati un d supportato su una temperatura controllata, rampa inclinata (piastre a 96 pozzetti), 8 canali capo pipetta robotico che si muove a sinistra / destra e su / giù (Dispensare testa). Piatto coperchio tiene rack (PLHR). Numeri di posizione letto indicati nella seguente tabella. La cultura (B) Robotic IPSC ha due fasi: Alimentazione e Passage. Il ciclo di produzione cellulare inizia quando un piatto colonia è pronto per il passaggio. L'utente sceglie il rapporto desiderato di passaggio in corrispondenza ei semi robot un nuovo gruppo di piastre a 96 pozzetti quindi alimentata ad intervalli regolari fino pronti per il passaggio di nuovo. Quando le piastre sono pronti per il passaggio, la maggior parte di ciascuna piastra non viene utilizzato per inizializzare piastre colonia successive ed è disponibile per altri usi, rappresentando così la fase di produzione del sistema. Linee di cellule congelate o esistenti possono essere introdotti in qualsiasi momento e mantenuti nel ciclo di alimentazione / passaggio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Parametri di gestione liquidi robotizzato può essere utilizzato per controllare IPSC caratteristiche colonia dissociazione. Ogni immagine rappresentativa mostra fibroblasti derivati iPSCs dissociate dopo il trattamento indicato mentre ancora sospesi in 96 pozzetti. (Riga superiore, A - C) Enzima Tempo, senza triturazione. Fibroblasti iPSCs derivati coltivate in piastre a 96 pozzetti sono stati sottoposti a tempi di proteolitica e collagenolitica dissociazione reagente dissociazione e senza triturazione robotico aumentando stata eseguita. (Middle Row, D - F) Tasso di triturazione, tre minuti enzima. Le cellule sono state esposte a tre minuti di proteolitici e trattamento del reagente di dissociazione collagenolitica e poi è stato applicato mezzi di crescita 175 ml e ogni pozzetto pipettati su e giù una volta alla velocità indicata. pl / sec = microlitri per secondo. (Fila in basso, G - I) Trituration Ripetizioni, 3 minuti enzima, 160 ml / sec. Le cellule sono state esposte a proteolitici e collagenolitica reagente di dissociazione per 3 minuti, 175 mezzi di crescita microlitri è stato applicato, poi triturato a 160 ml / sec per il numero di ripetizioni indicato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. adiposo tipico schema manutenzione colonia fibroblasti IPSC e una serie di immagini di densità colonia per determinare quando il passaggio a mantenere un regolare ciclo di alimentazione / passaggio. (A) A partire da un adiposo o fibroblasti 96 pozzetti iPSC colonia pronto per il passaggio, una colonna di celle è stato diversi passaggi sul robot senza centrifugazione e diluitoa 12 nuove colonne che sono stati alimentati a intervalli specifici in seguito fino a quando il piatto era pronto a passo di nuovo. Per la produzione di celle, le colonne non utilizzati per mantenere la colonia sono stati diversi passaggi e raccolti per il successivo utilizzo. Qualsiasi numero di colonne possono essere diversi passaggi per controllare la frequenza di espansione. (B) per determinare quando il passaggio, una serie di immagini di densità catturate ogni 24 ore è stato fornito agli utenti. Nella scatola rossa superiore (entro 72 ore dopo la semina iniziale) della colonia non è abbastanza denso di passaggio e deve essere alimentato. Quando la densità corrisponde a quello mostrato nella casella verde (a ~ 96 ore), la colonia è ad una densità ideale per passaggio. Con 120 hr, la colonia è troppo densa per passaggio e questo scenario dovrebbe essere evitato. Questi ultimi possono essere risolti con un gradiente di densità di semina, ma la cultura di routine in questa densità è fortemente sconsigliato. Bar Bianco è uguale a 200 micron. Clicca qui per vedere un più ampio versisu questa figura.
Figura 4. 96 pozzetti sistema di coltura robotica consente agli utenti di iniziare colture da linee cellulari congelati o attivi ed eseguire un gradiente di semina. (A) Una soluzione cella viene preparata dall'utente da una cella stock congelate o dopo la raccolta una cultura attiva e collocato sul robot. Il sistema robot esegue quindi un protocollo di diluizione seriale di distribuire la soluzione cellula iniziale lungo la piastra a 96 pozzetti con gradiente di densità distribuita per colonna. (B - E) Esempi di densità cellulare da quattro delle dodici colonne da A, 48 ore dopo la semina protocollo gradiente di densità. Linee bianche uguale 225 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questofigura.
Figura 5. pluripotenza viene mantenuta per adiposo e fibroblasti derivate linee IPSC durante 96 pozzetti cultura robotica per il 22 (adiposo) o 23 (fibroblasti) passaggi (~ 3 mesi). (A - L) adiposo e fibroblasti derivate linee cellulari IPSC erano robot nutriti e diversi passaggi come descritto nel testo senza centrifugazione in piastre a 96 pozzetti per 22 o 23 passaggi poi fissate e colorate per i marcatori pluripotenza Oct4, Nanog, o Ssea4 con DAPI di contrasto. Bar Bianco è uguale a 100 micron. (M - N). Culture parallele a quelle descritte in A sono state presentate per l'analisi del cariotipo che ha rivelato una normale dotazione di 46 cromosomi Cliccate qui per vedere una versione più grande of questa cifra.
Figura 6. adiposo (96-A) e fibroblasti (96-F) derivato iPSCs coltivati da più di 20 passaggi nel formato da 96 pozzetti robotica mantenuto l'espressione genica pluripotenza e differenziati in cardiomiociti. Totale mRNA è stato estratto da entrambe le linee IPSC robot coltivate così come cardiomiociti differenziati da entrambe le linee (CM-A = adipose cardiomiociti iPSC derivati, CM-F = fibroblasti iPSC derivato cardiomiociti, raccolto 14 giorni dopo l'induzione differenziazione) e utilizzata per RT-PCR per sondare marcatori pluripotenza Nanog, POU5F1, REX1, cardiomiociti marcatore MYL7 e controllo carico GAPDH. Fibroblasti dermici umani (HDF) sono stati raccolti e utilizzati come un non-IPSC, controllo non cardiomiociti. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. fibroblasti e adiposo derivato iPSCs mantenuto la capacità di differenziarsi in cardiomiociti dopo lungo termine a 96 pozzetti cultura robotica (A - H). Adiposo e iPSCs fibroblasti coltivati nel formato a 96 pozzetti robotica per più di 20 passaggi sono stati differenziati in cardiomiociti . 14 giorni dopo l'induzione di differenziazione, piatto legato cardiomiociti 96 pozzetti erano dissociate e ripiastrate a bassa densità su vetrini per immunocolorazione di troponina T (rosso), F-actina (verde) e nuclei (blu). Cliccate qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.
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Figura 8. Scaling up piastra di coltura di cellule staminali da 96 pozzetti. Scale up della produzione di cellule staminali dipende dal numero di lastre utilizzate per seminare il successivo gruppo di lastre. L'utente può mantenere un livello di produzione dal passaging lo stesso numero di piastre a ogni occasione frazionamento o espandere la produzione mediante inseminazione di più piastre. Ad esempio, nel ciclo 0, una piastra a 96 pozzetti è diversi passaggi a dodici nuove piastre (ciclo 1), creando una espansione 12 volte. Tale percentuale può essere mantenuta se uno dei dodici piatti diversi passaggi è di una nuova serie di dodici piatti (Cycle 1-2) e ampliato da passaging placche multiple (Cycle 2-3). Durante il passaggio, eventuali piastre non utilizzati per mantenere la colonia sono disponibili per applicazioni a valle. Pertanto, passaging 12 piatti routine potrebbe produrre fino a 144 lastre in due passaggi: 12 per la manutenzione delle colonie e 132 per altri usi."> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9. Efficienza del 96 pozzetti cultura basata piastra per la produzione di celle supera di gran lunga la coltivazione manuale. Come indicato in figura 8, un piatto può essere diversi passaggi per seminare dodici piatti, che possono poi essere diversi passaggi a 144 piatti. Questo tasso di espansione può essere raggiunto in due occasioni di divisione. Un tecnico richiede circa 3,5 minuti per alimentare una piastra da 6 pozzetti che spendono circa 30 secondi con una piastra a 96 pozzetti per esaminare sul microscopio e posizionarlo sul robot. Se il tecnico sta portando 144 piastre, che spenderanno circa 1,2 piastre di gestione hr durante l'alimentazione con il robot considerando che la cultura manuale richiederà un 8 ore dedicato a nutrire. Cliccate qui per view una versione più grande di questa figura.
Discussion
Nel presente studio abbiamo sviluppato un metodo di coltura per la produzione robotizzata IPSC che miniaturizza e automatizza l'alimentazione e il passaggio in un formato a 96 pozzetti mentre anche consentendo efficiente scale-up. Un robot liquido gestione è stato utilizzato per alimentare regolarmente le colonie IPSC e li passo a intervalli regolari da dissociazione enzimatica. Il robot è stato anche programmato per produrre lastre rivestite gel matrice extracellulare ed eseguire un gradiente di densità di semina. Quando fibroblasti e adiposo derivato iPSCs sono stati coltivati in questo sistema per più di 20 passaggi, circa 3 mesi, pluripotenza è stata mantenuta, così come lo erano cariotipo stabili. Entrambe le linee di cellule erano in grado di differenziazione in cardiomiociti. Insieme, la collezione di protocolli qui descritta consente agli utenti con poca esperienza sulle cellule staminali cultura o accesso limitato alle attrezzature cultura specialistica, alle cellule staminali di coltura e di raggiungere una produzione di cellule o la manipolazione con il lavoro minimo e il costo su più righe.
44,47 - 49 per mantenere la pluripotenza. Mentre gli altri formati di cellule pluripotenti scalabile di cellule staminali cultura rendimento 20,23,29 metodo basato questo piatto richiede essenzialmente nessun cambiamento nella disposizione della cultura, come adattamento alla sospensione, l'uso di sostanze chimiche o antischiuma uso prolungato di Rho-chinasi inibitori 20. Questo metodo della piastra base può quindi rapidamente, e prevedibilmente, accogliere nuove linee in quanto le condizioni di coltura sono simili. Come l'uso di iPSCs per la modellazione della malattia aumenta 4,6,19,50, nuove linee IPSC sono continuamente generate. Le tecniche qui descritte sono più adatti alla cultura nuova linee in medio-alto volume e la velocità perché la barriera di transizione sul formato è low. Questo è vero per la manodopera e apparecchiature necessarie per mantenere le colonie anche. Infine, perché il formato e la manipolazione sono simili per l'ambiente utilizzata per ricavare e validare linee IPSC, le prestazioni della cultura, come la differenziazione diretta, è probabile che sia più prevedibile.
La figura 8 illustra una strategia per scale up della produzione di cellule staminali in piastre da 96 pozzetti. Una piastra (Ciclo 0) è utilizzata per seminare robot 12 nuovi piatti, un aumento di 12 volte (Ciclo 0 a 1). Dopo diversi giorni di alimentazione, uno dei dodici piastre è diversi passaggi per seminare un'altra serie di dodici piastre (ciclo 1 al ciclo 2). I rimanenti piastre undici sono ora disponibili per altri usi e rappresentano la componente produzione del sistema. A questo ritmo, il passaggio di una piastra fornirà 11 piatti ogni ciclo, o ogni 3-4 giorni. Questa metodologia può essere scalata maggiore quando più piastre sono diversi passaggi, come illustrato nel passaggio dal Ciclo 2 Ciclo 3. In Ciclo 3, due piastre sonosempre utilizzato per mantenere la colonia e delle sementi 24 nuovi piatti. I restanti 22 piastre sono quindi disponibili per l'uso dopo ogni ciclo di passaggio. In qualsiasi punto del ciclo di manutenzione l'utente può seminare più piastre per aumentare la produzione. Un esempio potrebbe essere quello di passaggio ogni colonna per due cicli di crescita. Il primo passaggio converte una piastra in dodici piastre, e ciascuno dei dodici piastre viene utilizzata per seminare 144 piastre. In questo caso, un utente inizia con una piastra e dopo due passaggi, o circa 1,5-2 settimane di coltura, di 144 piastre. Ad esempio, i fibroblasti e adipose linee IPSC producono circa 25-75.000.000 cellule per piastra a 96 pozzetti quando si è pronti per il passaggio. 144 piastre potrebbero quindi rappresentare circa 4-7 x 10 9 cellule.
Qual è il peso del lavoro per la realizzazione di 144 piastre da 96 pozzetti robot? Uno degli obiettivi di questo lavoro è stata la produzione scalabile di cellule staminali che ha ridotto il lavoro rispetto ai tradizionali (targa ad esempio, 6 pozzetti) staminali coltura cellulare. Il robot accomplishes questo per alleviare la necessità di gestire fisicamente ogni piatto durante l'alimentazione e passaging. Mentre a 96 pozzetti scale di produzione piatto linearmente come sarebbe in 6 pozzetti tradizionali, il tempo di un tecnico passa a lavorare con i piatti è molto meno con la cultura robotica. L'efficienza di produzione della cultura robotica deriva da questa differenza (Figura 9). E 'stato trovato i tecnici hanno potuto rimuovere un 6-pozzetti dal termostato, controllare sul microscopio, poi aspirare e alimentare il piatto in circa 3,5 minuti. In confronto, i tecnici spendono circa 30 sec rimuovendo una piastra a 96 pozzetti da incubatore e ispezionandolo sul microscopio per la densità e la contaminazione prima dell'immissione sul robot. Con un protocollo alimentazione espanso simile a quella sopra descritta, sei piastre a 96 pozzetti possono essere caricati e alimentati, che dura circa 21 min, o 3,5 min per piastra. Il tempo trascorso totale per alimentare un piatto è comparabile tra robotè richiesto ic e metodi manuali, ma per alimentazione mano 6 piatti di un tecnico per tutti i 21 minuti, mentre il tecnico spende gestire i sei piatti per il robot (un controllo 30 sec per piastra) a soli 3 minuti. Come mostra la figura 9 mostra, il tempo trascorre un tecnico movimentazione 144 piastre utilizzando il robot è di circa 1,2 ore, rispetto all'8 hr manualmente il robot farà mai gestire un errore piastre o il trasferimento di liquidi.
Le 96 pozzetti IPSC metodi di coltura qui descritti forniscono una piattaforma per le attività di screening trattabili complesse. Poiché ogni bene è geneticamente identici e testa di serie alla stessa densità dallo stesso pool iniziale, le variabili possono essere distribuiti in tutta la piastra e mantenuti dal robot con serbatoi disponibili in commercio per separare condizioni. Questo sarebbe utile per esperimenti come la crescita delle cellule staminali dei media sviluppo 34,35,47, substrato o condizione cultura test e studi di tossicità che utilizzano cellule staminali51. Dal momento che ogni linea di cellule staminali è unica in termini di requisiti ottimali dimensioni delle colonie e di passaggio, si può usare questo sistema per modulare la densità di semina, la frequenza di alimentazione e la manipolazione passaggio manipolando le colonne raccolte, l'agitazione meccanica durante il passaggio e la frequenza di alimentazione. Iterazione attraverso queste variabili permette all'utente di trovare rapidamente una serie di condizioni idonee per la cultura di una nuova linea o sviluppare nuove tecniche di coltura. Il sistema robotico è anche in grado di mantenere 96 colonie di cellule staminali parallele ma indipendenti. Quando IPSC sono derivati da cellule somatiche o clonato dopo la manipolazione genetica, molti cloni paralleli sono proiettati per produrre potenziali linee IPSC. Una volta che le singole cellule vengono seminate in piastre a 96 pozzetti, il sistema può alimentare e di passaggio le piastre a 96 pozzetti mantenendo ogni colonia segregata. Ciò consente molto elevato throughput quando si seleziona potenziali cloni ed elimina la difficoltà di coltura fisicamente 96 linee parallele. Questo metodo inoltrellows scalati produzione di ogni clone in modo che il materiale è facilmente disponibile per l'analisi in parallelo. Infine, prevediamo integrando tali tecniche di coltura con un sistema di traffico piatto robotico che trasporta piastre da e per l'incubatore abilitazione coltura completamente automatizzato. Ciò potrebbe essere realizzato con più robotica complessi che consentono una maggiore espansione poiché i protocolli di base qui descritte sono trasferibili ad altri sistemi basati piastra.
I primi passi fondamentali per affrontare nei protocolli sono quelli che impediscono e controllano per la contaminazione, come passi 1.5 e 4.2. Contaminazione, come discusso in precedenza, può essere evitato con successo se buona tecnica sterile e il buon senso sono utilizzati. E 'indispensabile, indipendentemente dal formato coltura di cellule staminali, che il controllo dell'operatore di contaminazione e di farlo in questo protocollo i passi indicati ridurrà notevolmente il rischio di contaminazione. La corretta applicazione del gel matrice extracellulare è un secondo esspasso ziale per il successo globale di questo protocollo. Senza rivestimento adeguatamente le piastre a 96 pozzetti, le cellule staminali non crescerà. Un problema comune è il rivestimento ben incompleta. L'esperienza ha dimostrato che le bolle d'aria, attrazione elettrostatica e capillarità ostacolano rivestimento ben completa. La fase di pre-bagnatura (1.6) è stato sviluppato per migliorare significativamente il rivestimento ben inferiore e non deve essere ignorato. Questa fase di pre-bagnatura sembra ridurre l'apparente idrofobicità della piastra a 96 pozzetti di plastica in modo che quando il rivestimento in gel matrice extracellulare viene applicato è uniformemente distribuito attraverso il ben inferiore e lati. Si raccomanda inoltre di toccare delicatamente le piastre a 96 pozzetti contro una mano pulita una volta rivestito per assicurare una distribuzione soluzione di gel matrice extracellulare anche. I parametri di dissociazione sono importanti anche per ottimizzare. Incubazione estesa con l'enzima o il reagente di dissociazione base EDTA si tradurrà in singole cellule che possono o non possono essere l'obiettivo durante il passaggio. Pertanto, l'operatoredovrebbe prestare particolare attenzione a come il tempo di dissociazione, forza triturazione, e le ripetizioni di lavaggio influenzano la morfologia delle colonie e la salute e regolare di conseguenza.
Comprendere i limiti alle tecniche qui descritte sono di fondamentale importanza per il funzionamento di successo. Come in qualsiasi altra impostazione coltura cellulare, l'utilizzo di piastre a 96 pozzetti presenta un rischio relativamente alto di contaminazione. Come sopra descritto, un tecnico è gestire ogni piastra durante l'alimentazione e passaging; per esempio, quando si apre il coperchio, mettere la piastra sulla base del robot, e controllando la piastra sul microscopio. Quindi, come indicato dopo passo 1.5, è imperativo non toccare la parte interna del coperchio qualsiasi piatto o esporre questa parte a qualsiasi superficie potenzialmente contaminati, come i blocchi riscaldanti inclinate o perni verticali sul letto. Durante lo sviluppo del protocollo questa limitazione è stato scoperto e ha dato l'impulso per sviluppare un rack per contenere coperchi piastra per mantenere la sterilità. Allo stesso modo, i serbatoi di valle, puntali e other forniture sul liquido letto manipolazione robot sono potenziali fonti di contaminazione, perché sono aperti per l'ambiente e la manipolazione da parte del tecnico. Pertanto, buona tecnica sterile deve essere applicato come la riduzione dei movimenti rispetto ai materiali della cultura esposti o liquidi aperti. Un altro limite è che quando il protocollo è calcificato, controllando visivamente ogni ben di> 100 piastre a 96 pozzetti è ingombrante. Questo può essere affrontato da ispezionare visivamente tutta la piastra per i segni di contaminazione, come i media torbido, per identificare i pozzi sospetti. Per future scala up, verrà incorporata uso di un microscopio automatico e indicatore della crescita cellulare e la potenziale contaminazione.
In sintesi, l'high-throughput da 96 pozzetti piattaforma basata descritto qui offre un metodo fedeltà riproducibili, alto per la cultura e la produzione di cellule staminali in un formato piatto. Questo metodo riduce l'esperienza richiesta, delle attrezzature necessarie e di lavoro dedicata per arginare coltura cellulare mentremantenendo i vantaggi di cultura tradizionale aderente.
Disclosures
Gli autori MKC, MJG, EEB, NJD e RO sono o erano al tempo dei dipendenti per lo sviluppo di InvivoSciences, INC che ha concepito e sviluppato dei protocolli robotici qui descritti. TW è il CSO per InvivoSciences INC. SH è un dipendente di Gilson INC.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH, R44 e R01 GM087784 HL109505. Gli autori ringraziano il team tecnico e OEM a Gilson, INC per il supporto tecnico esteso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | Corning | 3596 | 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped |
| Seahorse Trough | SeahorseBio | 201308-100 | Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs |
| Gilson Tips | Gilson | F167023 | 10 racks gilson 96 tips D200 tips |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12500062 | DMEM/F12 powder. Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter. |
| Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 354230 | Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5857 | mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance. |
| E8 Media | StemCell Technologies | 5940 | TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance |
| Y27632 | AdooQ BioScience | A11001-50 | Rock inhinitor Y-27632 2HCI |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | ACCUTASE | Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution |
| PBS | Fisher | SH30256FS | PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk |
| Gilson PIPETMAX | Gilson | PIPETMAX | http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk |
References
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
- Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
- Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34 (6), 755-764 (2013).
- Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3 (4), 369-381 (2008).
- Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
- Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-17 (2013).
- Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111 (3), 344-358 (2012).
- Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4 (130), 130ra47 (2012).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
- Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
- Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
- Soldner, F., Jaenisch, R.
- Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5 (1), 51-64 (2010).
- Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11 (3), 1103-1116 (2013).
- Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8 (3), 388-402 (2012).
- Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6 (5), 572-579 (2011).
- Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18 (10), (2012).
- Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16 (2), (2010).
- Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
- Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
- Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6 (5), (2011).
- Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
- Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77 (100), 246-257 (2013).
- Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
- Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451 (7175), 141-146 (2008).
- Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113 (5), (2003).
- Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3 (1), 3-11 (2009).
- Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (4), 521-531 (2010).
- Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30 (1), 22-27 (2012).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105 (12), 4598-4603 (2005).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
- Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. , (2014).
