Introduction
नैदानिक ऑन्कोलॉजी नमूनों की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) लक्षित की आनुवंशिक परिवर्तन और भविष्य कहनेवाला / शकुन आणविक मार्कर की पहचान करने के महत्व को वैज्ञानिक साहित्य अंक बढ़ के रूप में पिछले कई वर्षों से अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध हो गया है। मल्टी जीन पैनल का विश्लेषण करती है और दोनों उपकला 1,2 और 3 hematologic दुर्दमताओं में पूरे exome अनुक्रमण के अध्ययन ट्यूमर विविधता की अवधारणा और प्रतिरूप विकास जम चुके इस रोग की प्रगति और relapses के रूप में। इसके अतिरिक्त, इस तरह के पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) या सेंगर अनुक्रमण के रूप में प्रतिस्पर्धा प्रौद्योगिकियों के विपरीत, NGS सभी चिकित्सकीय प्रासंगिक कैंसर के जीन में सबसे जीनोमिक परिवर्तन एक भी परख 4 में पता लगा सकते हैं।
शुरू में दो नैदानिक NGS पैनल, एक कस्टम hematological पैनल (हीम-NGS पैनल) और एक मुस्तैद FFPE नमूनों के लिए कैंसर पैनल (ठोस NGS पैनल) के साथ शुरू की निजीकृत निदान के लिए केंद्र (देखें हीम-NGS पैनल के लिए सामग्री विभिन्न स्त्रोतों से प्राप्त होता है, लेकिन तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) पहले से नैदानिक उपयोगिता 5 के एक उच्च स्तर का प्रदर्शन के रूप में वर्णित में उत्परिवर्तित जीन 16 के आसपास केंद्रित किया गया था। ठोस NGS पैनल व्यावसायिक रूप से कैंसर में आमतौर पर उत्परिवर्तित जीन पर आधारित लक्षित क्षेत्रों के रूप में कैंसर (लौकिक) डेटाबेस 6 में दैहिक म्यूटेशन की सूची में रिपोर्ट के साथ उत्पादन किया जाता है। कई महत्वपूर्ण कदम नैदानिक NGS के लिए समग्र कार्यप्रवाह विशेषताएँ। बाद चिकित्सक परीक्षण के आदेश, एक पैथोलॉजिस्ट निम्नलिखित ट्यूमर प्रतिशत और नमूना मात्रा के लिए नमूना विश्लेषण की पर्याप्तता निर्धारित करता है। हमारी संस्था में, हम प्रौद्योगिकी की पृष्ठभूमि अनुक्रमण त्रुटि दर ( "शोर") और लक्षित दृष्टिकोण की क्षमता के कारण कम से कम 10% ट्यूमर की आवश्यकता होती है। अगर ऊतक परीक्षण के लिए पर्याप्त है, जीनोमिक डीएनए निकाला जाता है। यह डीएनए तो कई गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन है (क्यूसी) कदम। डीएनए से गुजरता है तो क्यूसी, एक amplicon पुस्तकालय उत्पन्न होता है और अनुक्रम है। परिणामी डेटा एक घर में जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन के माध्यम से विश्लेषण किया है। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के बाद, वेरिएंट मैन्युअल की समीक्षा की और एक चिकित्सीय रिपोर्ट में शामिल करने से पहले pathogenicity के लिए व्याख्या कर रहे हैं। नीचे हम वर्णन दो मामलों है कि इस कठोर कार्यप्रवाह के माध्यम से चला गया और अंततः नैदानिक प्रबंधन में बदलाव के लिए नेतृत्व किया। केस 1 - एक्यूट माइलॉयड लेकिमिया मरीज को एक से एक अस्थि मज्जा बायोप्सी एएमएल के लिए नैदानिक था, परिपक्वता के बिना। Cytogenetic अध्ययनों अस्थि मज्जा नमूना पर भेजा और एक सामान्य महिला कुपोषण प्रदर्शन किया गया। 95% घूम वर्तमान विस्फोटों रहे थे, तो एक परिधीय रक्त नमूना हीम-NGS पैनल पर व्यक्तिगत नैदानिक परीक्षण के लिए भेजा गया था। तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) सफेद रक्त कोशिकाओं की माइलॉयड वंश के एक hematological द्रोह है। खोजएएमएल में जीन म्यूटेशन के रोग का निदान और उपचार के लिए तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है, साथ आवर्तक जीन म्यूटेशन रोगजनन और रोग का निदान 7 में महत्वपूर्ण के रूप में मान्यता दी। NPM1 और CEBPA में उत्परिवर्तन, एक अनुकूल शकुन जोखिम के साथ संबद्ध किया गया है, जबकि आंतरिक मिलकर दोहराव (ITDs) FLT3 में एक कम अनुकूल परिणाम 8 के साथ संबद्ध किया गया है। सबूत के एक बढ़ती शरीर एएमएल 9 में इन और अन्य परिवर्तन के लिए एक रोगजनक भूमिका का समर्थन करता है। केस 2 - फेफड़े Adenocarcinoma रोगी बी से एक बाएं अक्षोत्तर द्रव्यमान का एक बायोप्सी फेफड़े ग्रंथिकर्कटता का प्रदर्शन किया। formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) लिम्फ नोड जन से बायोप्सी सामग्री जीनोमिक परीक्षण (ठोस NGS कक्ष) के लिए भेजा गया था के रूप में रोल / 50% से अधिक ट्यूमर के साथ कर्ल, की पहचान करने के लिए है कि क्या एक उत्परिवर्तन लक्षित चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए उपस्थित थे। फेफड़े CANCएर संयुक्त राज्य अमेरिका में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर का प्रमुख कारण है और दो मुख्य प्रकार, गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) और छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (SCLC) में बांटा गया है। NSCLC आगे घाव के ऊतक विज्ञान पर आधारित है, या तो ग्रंथिकर्कटता या स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। फेफड़ों adenocarcinoma फेफड़ों के कैंसर का सबसे आम उप प्रकार, दोनों धूम्रपान करने वालों और गैर धूम्रपान करने वालों में देखा है, और गैर धूम्रपान करने वालों के लिए 10 फेफड़ों के कैंसर का सबसे आम रूप है। फेफड़ों adenocarcinomas की आणविक अध्ययन कई ओंकोजीन 11 में उत्परिवर्तन की पहचान की है। सबसे आम चालक धूम्रपान करने वालों में पहचान म्यूटेशन KRAS और BRAF में परिवर्तन कर रहे हैं। गैर धूम्रपान करने वालों में सबसे आम म्यूटेशन EGFR में परिवर्तन, और जीन ALK, रेत और ROS1 शामिल rearrangements हैं। फेफड़ों के ट्यूमर जीन ErbB2 में एक में फ्रेम एक्सॉन 20 प्रविष्टि (HER2 / neu) के साथ वर्णित किया गया है। उन्होंने कहा कि में सबसे आम विषमताआर 2 / neu जिसके लिए एक लक्षित थेरेपी (: HER2 / neu के खिलाफ एक humanized मोनोक्लोनल एंटीबॉडी त्रास्तुज़ुमाब) उपलब्ध है स्तन कैंसर में इस लोकस के एक प्रवर्धन है। HER2 / neu एक्सॉन 20 सम्मिलन है कि 2 में मनाया जाता है - फेफड़ों के 4% adenocarcimomas 12 HER2 / neu और mTOR अवरोधकों के साथ संयोजन चिकित्सा के लिए आंशिक प्रतिक्रिया (neratinib और temsirolimus, क्रमशः) 13 दिखाया गया है। 
चित्रा 1:। पैनलों में जिन जीन की सूची पुस्तकालय तैयारी का उपयोग किया जाता है या तो कस्टम hematological पैनल 33 जीन या मुस्तैद Amplicon कर्क पैनल 47 जीनों की (ठोस NGS) के (हीम-NGS पैनल)। नहीं जीन या एक्सॉनों के सभी पूर्ण में शामिल किया जाता है, जैसा कि कुछ amplicons केवल कुछ आकर्षण के केंद्र कवर कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ A>
Protocol
इस प्रोटोकॉल ठोस और तरल ट्यूमर के जीनोमिक रूपरेखा के लिए दो मान्य प्रयोगशाला विकसित परीक्षण की मुख्य कदम, क्रमशः शामिल हैं। परीक्षण प्रयोगशाला में प्रदर्शन 1988 के नैदानिक प्रयोगशाला सुधार संशोधन (CLIA) की आवश्यकताओं के अनुसार किया जाता है।
1. परिधीय रक्त या अस्थि मज्जा से डीएनए निष्कर्षण
- 1 टेबल के आधार पर लेने के लिए कितना रक्त या अस्थि मज्जा का निर्धारण करते हैं।
| नमूना / WBC | राशि रक्त के 1 मिलीलीटर के रूप में इलाज किया जा |
| मज्जा | 250 μl |
| रक्त WBC 12,000 - 50,000 | 1 मिलीलीटर |
| रक्त WBC 50,000 - 100,000 | 500 μl |
| रक्त WBC 100,000 - 200,000 | 200 μl </ Td> |
| रक्त WBC> 200,000 | 100 μl |
| * रक्त WBC <12,000, रक्त के 2 मिलीलीटर लेने के लिए | |
तालिका 1:। रक्त / अस्थि मज्जा वॉल्यूम चार्ट में इस्तेमाल के बाद से सफेद रक्त कोशिकाओं की संख्या नमूने के लिए नमूना से भिन्न होगी, यह रक्त का उपयोग करने का एक विशिष्ट मात्रा निर्दिष्ट करने के लिए मुश्किल है। इसलिए, रक्त परख के लिए उपयोग करने की राशि परख शुरू करने से पहले सफेद रक्त कोशिका गिनती (WBC) को देखकर निर्धारित किया जाना चाहिए। हालांकि कम रक्त उपयोग किया जाता है, यह अभी भी रूप में उपयोग किया जाता है, तो रक्त की मात्रा के बाद से अपने 1 मिलीलीटर कम हो जाता है, क्योंकि वर्तमान कोशिकाओं की संख्या सामान्य से अधिक है इलाज किया जाना चाहिए।
- जीनोमिक डीएनए को अलग-थलग करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के प्रोटोकॉल का पालन करें।
2. से Formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) ऊतक डीएनए निष्कर्षण
- पर आधारितट्यूमर क्षेत्र रोगविज्ञानी एच एंड ई स्लाइड पर परिक्रमा की, गाइड और एच ई स्लाइड के साथ बेदाग स्लाइड अप लाइन और निकासी के लिए एक समान क्षेत्र की रूपरेखा। मैक्रो-विच्छेदन के लिए, इस प्रक्रिया में केवल एक नमूना / एक समय में स्लाइड के मरीज की स्थापना की।
- गर्मी एक 45 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर स्लाइड थोड़ा आयल पिघला। ध्यान से लाइनों है कि स्लाइड पर चिह्नित कर रहे हैं के भीतर ऊतक परिमार्जन, एक नया छुरी प्रयोग करने के लिए प्रत्येक नमूना निकाला जाता था। मोम scrapings उचित लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। सावधान रहो, क्योंकि स्क्रैप मोम बहुत इलेक्ट्रोस्टैटिक है और ट्यूब से बाहर कूद कर सकते हैं।
- (- 30 माइक्रोन कुल 25) हर पांच से छह 5 माइक्रोन वर्गों के लिए Deparaffinization समाधान के 320 μl जोड़ें। उदाहरण के लिए, यदि एक ट्यूब एक 10 माइक्रोन रोल / कर्ल के 3 वर्गों युक्त संसाधित किया जा रहा है, तो 320 μl उपयोग करते हैं, लेकिन अगर एक ही मोटाई में 5 वर्गों प्राप्त किया गया तो 640 μl का उपयोग करें।
- कम से कम 10 सेकंड के लिए सख्ती और AQ प्रदर्शन भंवरएक microcentrifuge में uick स्पिन पक्षों और टोपी से और समाधान में ऊतक / वैक्स हटाने के लिए। । के लिए 3 मिनट 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और फिर 5 के लिए आरटी पर सेते - 10 मिनट।
- आरटी ऊष्मायन के बाद, कहा Deparaffinization समाधान के हर 320 μl के लिए ATL बफर के 180 μl जोड़ें। एक बाँझ मिनी मूसल प्रत्येक नमूना के लिए एक नया मूसल का उपयोग का उपयोग ऊतक कीमा दस गुना। सुनिश्चित करें कोई ऊतक, मूसल के लिए अटक के रूप में यह बहुत चिपचिपा हो सकता है। भंवर निलंबन सख्ती 3 सेकंड के लिए है, तो अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- कम स्पष्ट चरण के लिए proteinase कश्मीर के 10 μl जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting सुनिश्चित करने के लिए ऊतक resuspended है द्वारा धीरे मिलाएं। भंवर नहीं है। 500 आरपीएम - रात भर में 400 पर झटकों के साथ 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- अगर ऊतक पूरी तरह से भंग कर रहा है अगली सुबह, जांच (यदि कम समाधान स्पष्ट है यह हुआ है)। निचले समाधान स्पष्ट है, तो भंवर 3 सेकंड और के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज के लिए सख्ती नहीं है, तोआर 1 मिनट। Proteinase कश्मीर के 10 μl और एक अतिरिक्त 30 के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं - - एक अतिरिक्त 5 जोड़े 60 मिनट।
- 1 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं रिवर्स formaldehyde पार से जोड़ने में मदद करने के लिए। 10 मिनट के लिए और फिर कुछ समय प्रत्येक ट्यूब अपकेंद्रित्र तरल मजबूत करने के लिए - नमूने 5 के लिए कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें।
- एक लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कम स्पष्ट चरण हस्तांतरण। वहाँ एक ही रोगी नमूना (जैसे मामले में अगर कई रोल किया जा रहा है के रूप में) से कई ट्यूबों कर रहे हैं, इस बिंदु पर एक ट्यूब में कम चरणों recombine। नोट: Deparaffinization समाधान की छोटी मात्रा में शुद्धिकरण की प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए स्थानांतरण, लेकिन वहाँ एक जोखिम है, तो एक बड़ी राशि स्थानांतरित कर रहा है।
- RNase एक समाधान के 2 μl जोड़ें। भंवर धीरे या 25 बार और एक microcentrifuge में त्वरित स्पिन पलटना। 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- प्रोटीन वर्षा समाधान के 200 μl जोड़ें। अगर एक या दो रोल कर रही है, 200 μl का उपयोग करें। तीन रोल कर रही हैंपर एक बार, फिर 400 μl का उपयोग कर रहा है। सख्ती उच्च गति पर 30 सेकंड के लिए समान रूप से भंवर सेल बफ़र्स मिश्रण करने के लिए। 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं या नमूने एक मानव संसाधन के लिए ऊपर के लिए बर्फ पर रह सकते हैं।
- 5 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र। उपजी प्रोटीन एक चुस्त, सफेद गोली फार्म चाहिए। एक लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला डालो, और फिर कम से कम 3 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने सेते हैं। 3 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र।
- जोड़े बफर ATL के हर 180 μl के लिए 2-propanol (Isopropanol) के 200 μl एक लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को पहले जोड़ा (यह एक 2 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है)। उदाहरण के लिए, क्या कर रही है, तो तीन रोल isopropanol के 600 μl जोड़ें। isopropanol के लिए पहले जोड़ा बफर ATL के हर 180 μl के लिए ग्लाइकोजन के 1 μl जोड़ें और ट्यूब कई बार मिश्रण करने के लिए पलटना।
- ध्यान से Isopropanol मिश्रण में प्रोटीन वर्षा कदम से सतह पर तैरनेवाला जोड़ें। धीरे inverting कम से कम 50 बार से ट्यूब मिक्स।
- अधिकतम सपा पर अपकेंद्रित्र3 मिनट के लिए eed। डीएनए ट्यूब के नीचे छोटे सफेद गोली के रूप में दिखाई जाएगी।
- डालो या उचित अपशिष्ट ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate। मामले में प्रत्येक नमूना गोली उखाड़ फेंकना आता है तो यह खो नहीं किया जाएगा या अन्य नमूनों की बर्बादी के साथ मिश्रित के लिए एक अलग 1.5 मिलीलीटर अपशिष्ट ट्यूब रखें। एक कागज तौलिया पर ट्यूब नाली और यह सुनिश्चित isopropanol के बहुमत निकाल दिया जाता है।
- ताजा बना 70% इथेनॉल के 300 μl जोड़ें। ट्यूब धीरे उलटें कई बार गोली धोने के लिए। एक और अधिक पूरी तरह से सफाई सुनिश्चित करने के लिए उखाड़ फेंकना आता गोली सुनिश्चित करने के लिए प्रयास करें।
- 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर अपकेंद्रित्र। और फिर ध्यान से इथेनॉल को हटा दें। गोली ढीला हो सकता है, इसलिए डालना या महाप्राण धीरे धीरे और गोली देखते हैं। ट्यूब के अंदर से अतिरिक्त इथेनॉल निकालें, गोली को छूने के बिना। 5 के लिए शुष्क हवा के नमूनों की अनुमति दें - 15 मिनट, नहीं खत्म नमूना सुखाने के लिए सावधान किया जा रहा।
- डीएनए जलयोजन समाधान के 100 μl ई - 25 के बीच जोड़ेACH नमूना डीएनए गोली के आकार और ऊतकों की प्रारंभिक राशि पर आधारित है। भंवर ट्यूब सख्ती और संक्षेप में एक microcentrifuge में स्पिन। 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं पूरी तरह से डीएनए rehydrate करने के लिए।
3. जीनोमिक डीएनए गुणवत्ता नियंत्रण
नोट: डीएनए गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के लिए तीन स्वतंत्र कदम उठाए हैं। यही कारण है कि प्रत्येक क्यूसी कदम प्रदर्शन किया है और आगे स्पष्टीकरण के लिए 2 टेबल देखें।
| साधन | परिणाम | संकेत | आदर्श सीमा |
| DropSense96 | A260 / A230 | रासायनिक contaminants की पहचान (जैसे, इथेनॉल) | 1.50 - 2.2 |
| DropSense96 | A260 / A280 | प्रोटीन प्रदूषणों से पहचान | 1.60 - 2.2 |
| DropSense96 | एकाग्रता | डीएनए मात्रा का ठहराव | > 1 एनजी / μl |
| TapeStation | डीएनए स्मियर | डीएनए अखंडता का निर्धारण (जैसे, गिरावट / निकाले डीएनए के विखंडन) | 50%> 1,000 बीपी |
| qubit 2.0 | एकाग्रता | अधिक सटीक डीएनए मात्रा का ठहराव | > 1 एनजी / μl |
तालिका 2:। डीएनए क्यूसी अपेक्षित परिणाम इन मूल्यों के सभी एक नमूना अनुमति देने के पुस्तकालय तैयारी चरण के लिए आगे बढ़ने के लिए चलाने से पहले ध्यान में रखा जाता है।
- निर्माता प्रोटोकॉल के बाद, एक fluorometer काम एकाग्रता नमूने की (एनजी / μl) प्राप्त करने पर निकाले डीएनए के 2 μl चलाते हैं।
- नमूने की गुणवत्ता (A260 / A230 और A260 / A280 चूहे की जांच करने के लिए एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर प्रत्येक नमूने की 2 μl - 1 रनआईओएस) निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
- FFPE नमूने के लिए: निर्माता के निर्देशों के बाद डीएनए के क्षरण / विखंडन का आकलन करने के लिए एक microfluidic जेल वैद्युतकणसंचलन सिस्टम पर प्रत्येक नमूने की 1 μl चलाते हैं। उदाहरण के लिए चित्र 2 देखें।
चित्रा 2:। जीनोमिक डीएनए क्यूसी जेल उदाहरण निचले बैंड पर हरे रंग की लाइन कम मार्कर से संकेत मिलता है। जोड़ा में लाल रेखा लगभग 1,000 बीपी से संकेत मिलता है। के रूप में एक ताजा आज़ादी मुकदमा (जैसे, परिधीय रक्त या अस्थि मज्जा) से क्या उम्मीद करेंगे लेन ए 2, पूरी तरह से बरकरार डीएनए का प्रतिनिधित्व करता है। लेन बी 1, सी 1, डी 1, बी 2, सी 2, E2 अच्छा बरकरार FFPE डीएनए के उदाहरण हैं। लेन F2 में डीएनए बरकरार है, लेकिन बहुत कम एक एकाग्रता में प्रतीत होता है। लेन G2 में डीएनए अपमानित या खंडित है और परख में काम नहीं करेगा। लेन E1, F1, G1, एच 1, डी 2,एच 2 डीएनए जो 'ग्रे जोन' जिसका अर्थ है कि परख अच्छी तरह से काम हो सकता है में गिर जाता प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन डीएनए के कुछ भी क्षतिग्रस्त हो सकता है या पार से जुड़े और इस प्रकार यह परख में अच्छा प्रदर्शन नहीं होगा। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।
4. Amplicon पुस्तकालय तैयारी
- Oligo पूल और के संकरण बन्धे ओलिगोस का विस्तार-Ligation
- प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए इसी जीनोमिक डीएनए के 250 एनजी - पूर्व पीसीआर कमरे में, कम EDTA ते की आवश्यक मात्रा के पैनल के Oligo ट्यूब (जैसे, ठोस NGS कक्ष या हीम-NGS पैनल) 5 μl, और 100 से जोड़ने एक अर्द्ध skirted 96 अच्छी तरह से थाली के संकरण (HYB) थाली के रूप में चिह्नित किया।
- HYB थाली में प्रत्येक नमूने के लिए अनुक्रमण अभिकर्मक 1 के लिए Oligo संकरण (OHS1) के 40 μl जोड़ें। मिश्रण करने के लिए 6 बार - धीरे कम से कम 5 विंदुक ऊपर और नीचे। सुझावों के बदले प्रत्येक स्तंभ के बाद से बचने के लिएपार संदूषण।
- 30 सेकंड के लिए 1,000 XG पर चिपकने वाला एल्यूमीनियम पन्नी और सेंट्रीफ्यूज के साथ HYB प्लेट सील।
- 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म संकरण इनक्यूबेटर में HYB थाली सेते हैं। 40 डिग्री सेल्सियस के संकरण इनक्यूबेटर का तापमान सेट करें। जब तक यह 95 डिग्री सेल्सियस से 40 डिग्री सेल्सियस (~ 90 मिनट) के लिए कम करने के लिए इनक्यूबेटर लेता incubating जारी रखें। नोट: यह धीरे-धीरे ठंडा उचित संकरण के लिए महत्वपूर्ण है।
- पिछले 15 के दौरान - संकरण ऊष्मायन के 20 मिनट, फिल्टर प्लेट यूनिट (एफपीयू) पूर्व धो लें। तैयार केवल कुओं वर्तमान परख में इस्तेमाल किया जा रहा है, यानी, केवल एक पहले से खोला फिल्टर प्लेट की ताजा / अप्रयुक्त कुओं का उपयोग करें, लेकिन कभी फिर से उपयोग कुओं कि इस्तेमाल किया गया है। नोट: इस किट फिल्टर प्लेट पर नंबर, फिल्टर प्लेट पर चिह्नों, और थाली भर में इस्तेमाल किया सीलेंट पर आधारित स्पष्ट होना चाहिए।
- एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करना, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए कड़े धो 1 (SW1) के 45 μl जोड़ें।
- अवशिष्ट तरल मौजूद है, तो FPU 180 डिग्री बारी बारी से और एक अतिरिक्त 3 मिनट के लिए फिर सेंट्रीफ्यूज कदम दोहराएँ। अवशिष्ट तरल दूसरी बार के माध्यम से spins, तो अगले कदम के लिए आगे बढ़ना है, अगर नहीं तो वहाँ फ़िल्टर प्लेट में एक दोष हो सकता है और मौजूदा प्लेट के लिए जगह की आवश्यकता होगी।
- एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करना, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए कड़े धो 1 (SW1) के 45 μl जोड़ें।
- एक बार संकरण इनक्यूबेटर 40 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया है, थाली 1,000 XG पर कम से कम 30 सेकंड के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर संक्षेपण इकट्ठा करने के लिए अपकेंद्रित्र। FPU की इसी पूर्व धोया कुओं के केंद्र पर HYB थाली से प्रत्येक नमूने की पूरी मात्रा स्थानांतरण। प्रत्येक स्तंभ के बाद सुझावों के बदले पार संक्रमण से बचने के लिए। 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 2250 XG पर FPU और सेंट्रीफ्यूज को कवर किया।
- 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 2250 XG पर SW1 और सेंट्रीफ्यूज के 45 μl जोड़े। दो washes के एक कुल के लिए दोहराएँ। 3 मिनट के लिए 2250 XG पर फिर से FPU 180 ° और सेंट्रीफ्यूज घुमाएँ पूरी तरह से सभी SW1 हटा दें।
- FPU स्वांग रचना। सभी प्रवाह के माध्यम से (formamide युक्त) उचित अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें। FPU एक अलग मिडी अपशिष्ट संग्रह प्लेट का उपयोग कर पुनः। यूनिवर्सल बफर 1 (UB1) के 45 μl 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 2250 XG पर प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से और सेंट्रीफ्यूज में जोड़े। चेतावनी: formamide शामिल हैं।
- FPU प्लेट और पिपेट और मिश्रण करने के लिए नीचे 3 गुना पर अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के लिए एक्सटेंशन Ligation मिक्स 3 (ELM3) के 45 μl जोड़ें। नोट: एक्सटेंशन-बंधाव प्रतिक्रिया फिल्टर प्लेट झिल्ली पर जगह लेता है।
- चिपकने वाला एल्यूमीनियम पन्नी के साथ FPU प्लेट को सील करने और 45 मिनट के लिए एक पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पूरे FPU विधानसभा सेते हैं।
- इंडेक्सिंग और पीसीआर प्रवर्धन
- विभाज्य अनुक्रमित क्रमाँक प्रवर्धन पी एल में इसी कुओं के लिए इस्तेमाल किया जा रहा(आईएपी) खाया सूचकांक प्लेट स्थिरता में प्राइमरों, निम्नलिखित तरीके से व्यवस्था की व्यवस्था की: i5 प्राइमर ट्यूब (सफेद टोपियां, स्पष्ट समाधान) खड़ी, एच के माध्यम से पंक्तियाँ एक के साथ गठबंधन किया है, i7 प्राइमर ट्यूब (नारंगी टोपी, पीला समाधान) क्षैतिज , 12 के माध्यम से कॉलम 1 एक P10 मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग के साथ गठबंधन किया है, आईएपी की प्रत्येक पंक्ति को i7 प्राइमरों (पीला समाधान) के 4 μl जोड़ें और आईएपी के प्रत्येक स्तंभ के लिए (स्पष्ट समाधान) i5 प्राइमरों के 4 μl जोड़ें।
- बर्फ या ठंडा ब्लॉक पर, नमूना प्रति पीसीआर मास्टर मिक्स 2 (PMM2) के 25 μl के लिए डीएनए पोलीमरेज़ 1 (TDP1) के 0.5 μl जोड़कर पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें। उलटा, जल्दी भंवर, और संक्षेप में मिश्रण करने के लिए पीसीआर मास्टर मिक्स अपकेंद्रित्र।
- आईएपी के प्रत्येक अच्छी तरह से और पिपेट और मिश्रण करने के लिए नीचे 3 बार पीसीआर मास्टर मिक्स के 22 μl जोड़ें। कुओं के बीच सुझावों के लिए परिवर्तित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर आईएपी रखें।
- 45 मिनट के विस्तार-बंधाव प्रतिक्रिया (कदम 4.1.10) के बाद, इनक्यूबेटर से हटा दें और FPU ध्यान अल को दूरuminum पन्नी सील। 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 2250 XG पर ढक्कन और सेंट्रीफ्यूज के साथ कवर।
- FPU पर अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के लिए 50 मिमी NaOH के 25 μl जोड़ें। कम से कम 6 बार पिपेट और नीचे; विंदुक युक्तियाँ झिल्ली के साथ संपर्क में आते हैं। प्रत्येक स्तंभ के बाद सुझाव दिए बदलें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
- स्थानांतरण के नमूने आईएपी के लिए FPU से eluted इस प्रकार है:
- एक P100 मल्टी चैनल पिपेट 20 μl करने के लिए सेट का उपयोग कर, ऊपर और नीचे कम से कम 6 बार FPU प्लेट पर NaOH पिपेट। थोड़ा FPU प्लेट झुकाव थाली से पूरा आकांक्षा सुनिश्चित करने के लिए।
- स्थानांतरण आईएपी की इसी स्तंभ के लिए FPU से 20 μl। धीरे विंदुक ऊपर और नीचे कम से कम 6 बार अच्छी तरह से पीसीआर मास्टर मिक्स के साथ डीएनए गठबंधन करने के लिए। आईएपी 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर चिपकने वाली फिल्म और सेंट्रीफ्यूज के साथ सील।
- बाद पीसीआर कक्ष में पीसीआर थाली ले आओ और एक थर्मल साइक्लर पर थाली लोड। भागो पीसीआर पीएक गर्मी 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर कदम denaturing से मिलकर rogram; 30 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 62 डिग्री सेल्सियस, 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र द्वारा पीछा किया; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के अंतिम विस्तार के द्वारा पीछा किया; 10 डिग्री सेल्सियस पर एक पकड़ के साथ खत्म। पीसीआर के पूरा होने के बाद अगले चरण के लिए आगे बढ़ने से नहीं हैं, प्लेट रात भर थर्मल साइक्लर पर रह सकते हैं, या इसे दो दिनों के लिए 8 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 पर संग्रहित किया जा सकता है।
- पीसीआर शोधन और मनका आधारित सामान्य
- 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज और अगले चरण के पहले कम से कम 20 मिनट के आरटी पर जगह से चुंबकीय शुद्धि मोती, क्षालन बफर (ईबीटी), और जेल वैद्युतकणसंचलन अभिकर्मकों निकालें।
- एक बार जब पीसीआर पूरा हो गया है, 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र संक्षेपण इकट्ठा करने के लिए। स्थानांतरण 1 प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया की μl ट्यूबों / प्लेट नमूनों 1/5 कमजोर करने के लिए पानी के 4 μl युक्त कुओं पट्टी करने के लिए। पिपेट और नीचे मिश्रण करने के लिए।
- के 2 μl जोड़ेmicrofluidic जेल बफर के 2 μl को PCRed नमूने पतला। स्ट्रिप्स / प्लेट सील। 30 सेकंड के लिए 1,000 XG पर कम से कम 30 सेकंड और सेंट्रीफ्यूज के लिए 1800 rpm पर हिला। निर्माता प्रोटोकॉल के बाद, पुस्तकालय तैयारी के लिए एक स्वीकार्य पुस्तकालय (चित्रा 3 देखें) झुकेंगे यदि आकलन करने के लिए एक microfluidic जेल पर मिश्रण को चलाते हैं।
- चुंबकीय शुद्धि मोती भंवर जब तक वे अच्छी तरह से निलंबित कर दिया है और रंग सजातीय प्रकट होता है। प्रत्येक नमूने के मोतियों की 45 μl जोड़ें।
- स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली सील और 2 मिनट के लिए 1800 rpm पर थाली हिला। 10 मिनट के लिए मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर सेते हैं।
- एक चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखें। एक बार सतह पर तैरनेवाला मंजूरी दे दी है, ध्यान से हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। किसी भी मोती अनजाने सुझावों में से aspirated रहे हैं, तो 2 मिनट के लिए वापस थाली करने के लिए मोती बांटना और चुंबक पर थाली आराम करते हैं और इस बात की पुष्टि है कि सतह पर तैरनेवाला मंजूरी दे दी है।
- टी पर थाली के साथवह चुंबकीय स्टैंड, अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 200 μl जोड़ें। आगे और पीछे एक बार कुछ प्लेट ले जाएँ। 30 सेकंड के लिए चुंबकीय स्टैंड पर थाली सेते हैं। ध्यान से निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। दो washes के एक कुल के लिए दोहराएँ।
- संक्षेप में, ट्यूब पक्षों पर कोई इथेनॉल नीचे ड्राइव करने के लिए 1,000 XG पर प्लेट centrifuging वापस चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखने, और एक P10 मल्टी चैनल पिपेट 10 μl करने के लिए सेट इथेनॉल को दूर करने का उपयोग करके अतिरिक्त इथेनॉल निकालें। 8 मिनट - 5 के लिए हवा शुष्क मोतियों की अनुमति दें।
- एक P100 मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करना, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ईबीटी के 30 μl जोड़ें। ऊपर पिपेट और नीचे एक बार कुछ सुनिश्चित करने के लिए मोती ट्यूब के पक्ष में उतर आते हैं। स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली सील और 2 मिनट के लिए 1800 rpm पर थाली हिला।
- 3 मिनट के लिए मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर सेते हैं। अगर वहाँ के नमूनों में जो मोती पूरी तरह से resuspended नहीं कर रहे हैं, धीरे मोती resuspend करने के लिए नीचे विंदुक ऊपर और।
- एक चुंबकीय स्टैंड पर थाली रखें। एक P100 मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करना, एक नया थाली करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के 20 μl हस्तांतरण लाइब्रेरी सामान्य प्लेट (LNP) कहा जाता है। एक अलग प्लेट के लिए शेष ~ व्यक्ति अनुक्रमण पुस्तकालयों के 10 μl स्थानांतरण शेष साफ अप पुस्तकालय प्लेट (RCLP) कहा जाता है। अंतिम पुस्तकालय प्रस्तुत करने के साथ साथ इस थाली स्टोर, के रूप में यह यदि आवश्यक हो, एक दूसरे अनुक्रमण चलाने के लिए एक रिज़र्व के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अगले चरण के लिए आगे बढ़ने से नहीं हैं, तो LNP और RCLP -15 से -25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
- सख्ती भंवर और लाइब्रेरी सामान्य मोती 1 (LNB1) resuspend। यह पूरी तरह से ट्यूब के नीचे LNB1 मनका गोली resuspend के लिए महत्वपूर्ण है। नमूना प्रति लाइब्रेरी सामान्य Additives 1 (LNA1) के 44 μl के साथ LNB1 के 8 μl मिश्रण से सामान्य मिक्स, तैयार करें। 20 सेकंड - सख्ती 10 के लिए सामान्य मिक्स भंवर।
चेतावनी: LNA1 formamide में शामिल है। - रुक-रुक कर उलटा एक साथएन डी सामान्य मिक्स के vortexing, LNP के प्रत्येक नमूने के 45 μl जोड़ें। स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली को सील करने और 30 मिनट के लिए 1800 rpm पर थाली हिला। यह 30 मिनट ऊष्मायन के अधिक से अधिक या कम से कम 30 मिनट की incubations पुस्तकालय प्रतिनिधित्व और क्लस्टर घनत्व प्रभावित कर सकता है के रूप में उचित पुस्तकालय सामान्य बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।
- 30 मिनट ऊष्मायन के दौरान, अभिकर्मक कारतूस विगलन और Hyb बफर (HT1) द्वारा अनुक्रमण के लिए अभिकर्मकों तैयार [चेतावनी: दोनों formamide शामिल]। इसके अलावा, बाद में एक चरण के लिए बर्फ पाने के लिए और एक गर्मी 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए उपयुक्त 96 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट कर दिया जाता ब्लॉक किया जाता है।
- जब 30 मिनट के मिश्रण कदम पूरा हो गया है, एक चुंबकीय स्टैंड पर LNP जगह है। एक बार सतह पर तैरनेवाला मंजूरी दे दी है, एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग सावधानी से हटाने के लिए और उचित अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- इस प्रकार के रूप LNP चुंबकीय स्टैंड से निकालें और लाइब्रेरी सामान्य धो 1 (LNW1) के साथ मोती धोने:
- 45 जोड़ेअच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के LNW1 के μl।
चेतावनी: formamide शामिल हैं। स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली सील और 5 मिनट के लिए 1800 rpm पर थाली हिला। दो washes के एक कुल के लिए दोहराएँ। दूसरे धोने के बाद सभी LNW1 दूर करने के लिए सुनिश्चित करें।
- 45 जोड़ेअच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के LNW1 के μl।
- चुंबकीय स्टैंड से LNP निकालें और, एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग, नमूना elute करने के लिए एक अच्छी तरह से (एक सप्ताह से भी कम समय वर्ष) 0.1 एन NaOH के 30 μl जोड़ें। स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली सील और 5 मिनट के लिए 1800 rpm पर थाली हिला।
- 5 मिनट के क्षालन के दौरान प्रत्येक अच्छी तरह से भंडारण प्लेट (SGP) नाम की एक नई प्लेट में इस्तेमाल किया जा करने के लिए लाइब्रेरी सामान्य भंडारण बफर 1 (LNS1) का 30 μl जोड़ें।
- चुंबकीय स्टैंड पर LNP रखें। एक बार सतह पर तैरनेवाला मंजूरी दे दी है, SGP में LNS1 के लिए 30 μl क्षालन हस्तांतरण। नमूने के बीच सुझावों के पार संक्रमण से बचने के लिए परिवर्तित करें।
- कम से कम 30 सेकंड के लिए 1,000 XG पर चिपकने वाली फिल्म और सेंट्रीफ्यूज के साथ थाली सील।
- 5 जोड़े1; प्रत्येक नमूने की एल एक लेबल जमा Amplicon लाइब्रेरी (पाल) 1.5 मिलीलीटर ट्यूब अनुक्रम किया जा सके। पाल मिश्रण और संक्षेप में एक microcentrifuge में नीचे स्पिन भंवर।
- HT1 के 596 μl - 590 के लिए पाल 10 μl - क्या अनुक्रमण रसायन विज्ञान इस्तेमाल किया जा रहा (V2 या वी 3) के आधार पर 4 जोड़ें। आम तौर पर, V2 रसायन शास्त्र के लिए HT1 के 595 μl और के वी 3 रसायन शास्त्र के लिए HT1 के 592 μl को पाल 8.5 μl के पाल 5.8 μl जोड़ें। पतला Amplicon लाइब्रेरी (डीएएल) ट्यूब के रूप में इस ट्यूब लेबल।
- दाल भंवर और संक्षेप में एक microcentrifuge में नीचे स्पिन। 2 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर दाल सेते हैं। दाल ट्यूब पलटना 3 बार और, कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर दाल डाल दिया, जबकि अनुक्रमण के लिए sequencer तैयारी। 5 मिनट के बाद, दाल लोड करने के लिए तैयार है।
- अगर SGP साथ समाप्त हो गया, चिपकने वाला एल्यूमीनियम पन्नी फिल्म के साथ थाली सील और तारीख और प्लेट आईडी के साथ लेबल। -15 से -25 डिग्री सेल्सियस पर सील SGP और पाल स्टोर।
चित्रा 3:। लाइब्रेरी तैयारी क्यूसी जेल उदाहरण निचले बैंड पर हरे रंग की लाइन कम मार्कर और ऊपरी बैंड पर बैंगनी रेखा से संकेत मिलता है उच्च मार्कर से संकेत मिलता है। सब कुछ के लिए गलियों एच 1, ए 2, बी 2, सी 2, E2, और G2 अच्छी तरह से काम किया। पुस्तकालय प्रस्तुत करने का बेहतर काम नहीं किया, गलियों डी 2, F2, और एच 2 के लिए, लेकिन परिणाम अभी भी प्राप्त हो जाएगा कि वे सिर्फ पर्याप्त कवरेज नहीं हो सकता है। A3 के लिए, पुस्तकालय प्रस्तुत करने का मुश्किल से काम किया है और सबसे अधिक संभावना इस डीएनए नमूने परख के लिए पर्याप्त नहीं था। क्योंकि विभाज्य अच्छी तरह PCRed से सीधे लिया जाता है कम मार्कर ऊपर निचले बैंड, अप्रयुक्त प्राइमरों हैं। एनटीसी नमूना केवल अप्रयुक्त प्राइमर बैंड, और कुछ नहीं करना चाहिए था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
5. अनुक्रमण
- यह सुनिश्चित करने एक सही SampleSheet.csv रन के लिए बनाया गया है। एक उदाहरण के लिए अनुपूरक चित्रा 1 देखें।
- कुल्ला और प्रवाह सेल सूखी और thawed अभिकर्मक कारतूस के लिए दल के 600 μl जोड़ें।
- परदे पर संकेतों का पालन करके अनुक्रमण के लिए sequencer तैयार करें।
6. डेटा विश्लेषण
- जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन का निष्पादन करें। म्यूटेशन, सम्मिलन, विलोपन और amplifications 18 की पहचान करने के लिए घर में, कस्टम डिजाइन bioinformatic पाइप लाइन का उपयोग।
- पाइप लाइन की समाप्ति के बाद, के लिए त्रुटियों / चेतावनी लॉग फाइल की जांच पाइपलाइन प्रसंस्करण की क्यूसी में कोई महत्वपूर्ण त्रुटियों / चेतावनी सहायता के रूप में।
- रन के आँकड़े (3 टेबल) का विश्लेषण अनुक्रम पुस्तकालय सुनिश्चित करने के लिए पारित कर दिया गया प्रयोगशाला चुना गया क्यूसी मैट्रिक्स (चित्रा 4)। स्वयं (एक जीनोमिक डेटा दर्शकों में .bam फ़ाइलों को देखने जैसे, एकीकृत जीनोमिक्स Vi से प्रत्येक संस्करण की समीक्षासुराही 16 (IGV))।
नोट: मान्य एलील की आवृत्ति सीमा के भीतर और गुणवत्ता को छानने के बाद कवरेज की न्यूनतम गहराई ऊपर केवल वेरिएंट रिपोर्ट कर रहे हैं (मानव जीनोम रूपांतर सोसायटी (HGVs) नामकरण का उपयोग)। रोगजनक, शायद जुड़े रोग, अज्ञात महत्व (VUS) के संस्करण हैं, आमतौर पर सौम्य, और सौम्य: अंतिम रिपोर्टिंग के लिए, प्रत्येक exonic संस्करण में वर्गीकृत किया गया था। 5% एलील आवृत्ति की रिपोर्टिंग मानदंड, उन समझा सौम्य वेरिएंट और पर्याय परिवर्तन को छोड़कर उपरोक्त सभी वेरिएंट, सूचित किया गया।
NGS के लिए गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कदम की चित्रा 4. अवलोकन। इस प्रक्रिया में हर कदम की गुणवत्ता नियंत्रण अनुक्रमण है कि इस तरह से पहले और बाद अनुक्रमण मैट्रिक्स माना जाता है परिणाम निकलेगा यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। उचित उपचार नमूना उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के लिए आवश्यक है। रक्त औरअनुचित fixatives में अस्थि मज्जा कम गुणवत्ता की डीएनए उपज कर सकते हैं। ठोस ट्यूमर नमूनों की अनुचित निर्धारण डीएनए (जैसे, बी 5 में नियतन) नीचा कर सकते हैं। डीएनए गुणवत्ता spectrophotometric माध्यम से प्रोटीन और आरएनए संदूषण के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और सही मात्रा में और डीएनए की अखंडता के लिए आकलन किया। अनुक्रमण मेट्रिक्स अनुभव से अनुक्रमण प्रयोगशाला में चुना गया है और प्रत्येक अनुक्रमण प्रतिक्रिया और हर नमूना के लिए पीछा किया जा करने की जरूरत है। प्रत्येक नमूना के लिए अनुक्रमण परिणाम रिपोर्टिंग करने से पहले कवरेज, गहराई, और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की पर्याप्त प्रदर्शन के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Representative Results
केस 1 - हीम-NGS पैनल
डीएनए लयूकेमिक परिधीय रक्त से निकाले हीम-NGS पैनल के लिए पर्याप्त गुणवत्ता और मात्रा (176 एनजी / μl) का था। कवरेज के समग्र मतलब गहराई (1,000x के कवरेज की न्यूनतम मतलब गहराई से ऊपर) 4,933x था। अतिरिक्त रन आंकड़ा तालिका 3 में हैं। 250x कवरेज नीचे 8 क्षेत्रों में से, 3 प्राइमरों के अनुचित ट्रिमिंग (यानी, प्राइमर अनुक्रम ठीक से अनुक्रमण त्रुटियों के कारण हटाया नहीं गया था), 1 परख के एक ज्ञात विरूपण साक्ष्य था के कारण थे, और अन्य 4 कोई reportable वेरिएंट के साथ विभिन्न जीनों की एक्सॉनों के आंशिक क्षेत्रों थे। हमारे नैदानिक प्रोटोकॉल केवल कम से कम 250 पढ़ता द्वारा कवर वेरिएंट रिपोर्टिंग शामिल हैं, हालांकि, कम से कम 100 के साथ सभी डेटा की समीक्षा के लिए डाटाबेस में आयात कर रहे हैं पढ़ता है।
डाटा प्रोसेसिंग चROM जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन तीन reportable, रोग से जुड़े म्यूटेशन का पता चला; FLT3 में एक missense उत्परिवर्तन, IDH2 में एक missense उत्परिवर्तन, और NPM1 में एक frameshift उत्परिवर्तन। उनकी एलील आवृत्तियों के साथ exonic वेरिएंट तालिका 4 में वर्णित हैं। FLT3 में एक आम उत्परिवर्तन FLT3 -internal मिलकर दोहराव (आईटीडी) जो स्वचालित रूप से हमारे पाइप लाइन से नहीं कहा जाता है और एक्सॉन 14. एक्सॉन 14 के दृश्य निरीक्षण के एक दृश्य निरीक्षण की आवश्यकता है FLT3 का कोई प्रविष्टि या प्रस्तुत नमूना में दोहराव से पता चला है। FLT3 I836del 1% एलील आवृत्ति पर था और अंतिम रिपोर्ट में शामिल नहीं किया गया है क्योंकि यह 5% की मान्य न्यूनतम एलील आवृत्ति से नीचे गिर गया। इस उत्परिवर्तन FLT3 D835Y परिवर्तन के रूप में एक ही डीएनए अणु पर नहीं है (यानी, है, लेकिन "सीआईएस" अनुक्रमण के किसी भी पढ़ता में नहीं एक ही amplicon क्षेत्र में मनाया) है और यह केवल .bam फाई की मैन्युअल समीक्षा से मनाया गयालेस जब p.D835Y परिवर्तन की पुष्टि करने। दो FLT3 म्यूटेशन के निचले एलील आवृत्तियों का सुझाव इन म्यूटेशन विविधता और / या प्रतिरूप विकास प्रतिनिधित्व कर सकते हैं; हालांकि, अंतर यह है कि amplicon या एक एकल nucleotide बहुरूपता (एसएनपी) के पास या प्राइमर अनुक्रम कि इस एलील के प्रवर्धन प्रभावित ओवरलैपिंग के लिए परख प्रदर्शन के कारण हो सकता है।
FLT3, IDH2, और NPM1 में एएमएल पहचान परिवर्तन के साथ केस 1 के लिए हीम-NGS पैनल परिणाम, FLT3 में एएमएल। उत्परिवर्तनों में तीन सामान्यतः उत्परिवर्तित जीन एएमएल (लौकिक डेटाबेस 17) के साथ वयस्क रोगियों की ~ 25% में मनाया जाता है और या तो कर रहे हैं आंतरिक मिलकर दोहराव (ITDs) या missense म्यूटेशन tyrosine kinase डोमेन। FLT3-ITDs अधिक आम उत्परिवर्तन कर रहे हैं और, मानक कीमोथेरेपी के लिए गरीब प्रतिक्रिया के साथ जुड़े रहे हैं, जबकि FLT3 काइनेज डी शकुन महत्वomain बिंदु उत्परिवर्तन, इस एएमएल रोगी के रूप में देखा, रोग का निदान 14 पर एक अस्पष्ट प्रभाव पड़ता है। Isocitrate डिहाइड्रोजनेज 2 (NADP +), mitochondrial (IDH2) एक जीन है कि एक epigenetic आपरिवर्तक है कि आमतौर पर एएमएल में उत्परिवर्तित है encodes है। Epigenetic संशोधक में म्यूटेशन एएमएल में अपेक्षाकृत आम हैं, IDH1 और DNMT3A में परिवर्तन जीन है कि जीन अनियंत्रण के लिए नेतृत्व के इस वर्ग में अन्य उत्परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व करने के साथ। Nucleophosmin (NPM1) के लिए जीन में उत्परिवर्तन एएमएल में सबसे आम का अधिग्रहण परिवर्तन के एक रहे हैं और आम तौर पर एक अच्छा शकुन कारक माना जाता है (एक FLT3 के अभाव में - आईटीडी)।
NPM1 और IDH2 के सह-म्यूटेशन एक अनुकूल शकुन सूचक के रूप में 5 साहित्य में वर्णित किया गया है, 89% की एक 3 साल की समग्र अस्तित्व के साथ। यह एक महत्वपूर्ण उत्तरजीविता लाभ का प्रतिनिधित्व करता है जब की समग्र 3 साल के अस्तित्व की तुलनाजंगली प्रकार NPM1 और 31% की IDH2। उदाहरण के लिए, मानक का ख्याल अभ्यास एनपीएम 1 के लिए उत्परिवर्तन विश्लेषण और FLT3-आईटीडी म्यूटेशन भी शामिल है। इस परिदृश्य में, केवल एक NPM1 उत्परिवर्तन का पता लगाने, जोखिम के लिए उचित रूप से विभक्त रोगी के लिए असफल के रूप में माध्यमिक म्यूटेशन अनुकूल हो सकते हैं (जैसे, IDH2) या प्रतिकूल (जैसे, TET2), एक अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण को समाप्त करने के लिए आत्मविश्वास को कम करने।
केस 2 - ठोस NGS पैनल
FFPE ऊतक से निकाले डीएनए 252 एनजी / μl की एकाग्रता और 1,000 आधार जोड़े (बीपी) के नीचे डीएनए के केवल 4% के साथ पर्याप्त गुणवत्ता और ठोस NGS पैनल के लिए मात्रा की थी। डेटा विश्लेषण के बाद कवरेज का मतलब गहराई 9,167 पढ़ता (अच्छी तरह से ऊपर 1,000 के हमारे न्यूनतम गहराई कटऑफ पढ़ता है) के नीचे 250 पढ़ें गहराई कोई क्षेत्रों के साथ किया गया था। अतिरिक्त क्यूसी मेट्रिक्स थानेदार हैं3 टेबल में WN।
ErbB2 (HER2 / neu) की एक्सॉन 20 में एक में फ्रेम प्रविष्टि और TP53 में एक missense उत्परिवर्तन: जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन के माध्यम से संसाधित डेटा दो रोग से जुड़े म्यूटेशन का पता चला। उनकी एलील आवृत्तियों के साथ सभी exonic वेरिएंट 5 तालिका में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। ErbB2 में प्रविष्टि वास्तव में, एक मिलकर दोहराया (HER2 / neu) के अनुक्रम का प्रतिनिधित्व के रूप में नामकरण में परिलक्षित। पहचान और अनुक्रमण के में फ्रेम प्रविष्टि आवश्यक मैन्युअल समीक्षा की पुष्टि IGV के माध्यम से पढ़ता है। 50% से अधिक की उत्परिवर्तन आवृत्तियों का पता लगाने, दोनों के रूप में TP53 और Her2 के लिए देखा / neu म्यूटेशन Heterozygosity (LOH) घटना (चर्चा देखने के लिए) का एक नुकसान का सूचक है।
केस 2 के लिए ठोस NGS पैनल परिणाम फेफड़ों adenocarcinoma पता लगाया परिवर्तन के साथ मैंn ErbB2 (HER2 / neu) और TP53, दो जीन आमतौर पर फेफड़ों के कैंसर के रोगियों के लिए वर्तमान मानक की देखभाल के हिस्से के रूप में। HER2 / neu एक tyrosine kinase रिसेप्टर एक और आमतौर पर उत्परिवर्तित जीन के समान फेफड़ों के कैंसर, EGFR में encodes के लिए परीक्षण नहीं । को सक्रिय HER2 / neu एक्सॉन 20 सम्मिलन 2 में मनाया जाता है - फेफड़ों adenocarcinomas के 4%, HER2 / neu फेफड़ों के कैंसर में मनाया परिवर्तन के बहुमत के लिए खाते हैं, और आम तौर पर इस तरह के EGFR और ALK 12 के रूप में अन्य ड्राइवर जीन में म्यूटेशन के बिना ट्यूमर में देखा जाता है । वहाँ HER2 / neu और mTOR अवरोधकों 13 और कीमोथेरेपी 15 के साथ संयोजन के रूप में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी त्रास्तुज़ुमाब के साथ महत्वपूर्ण रोग नियंत्रण के साथ संयोजन चिकित्सा के लिए आंशिक प्रतिक्रिया सहित HER2 / neu सम्मिलन, सक्रिय करने के साथ रोगियों के लिए विभिन्न उपचार के विकल्प के लिए सबूत दिखा क्षमता की कई लाइनें हैं। एक TP53 परिवर्तन की खोज अनोखा नहीं हैकैंसर में MMON, लेकिन इस समय वहाँ कोई कार्रवाई उपचार कर रहे हैं।
| मामला एक | केस 2 | |
| कुल शुरू पुस्तकें | 2215926 | 2129110 |
| का प्रतिशत मानचित्रण पुस्तकें | 98.42% | 98.29% |
| का प्रतिशत लक्ष्य पर पढ़ता | 99.01% | 97.29% |
| का प्रतिशत लक्ष्य पर पढ़ता फिल्टर करने के बाद | 97.60% | 95.45% |
| प्रयोग करने योग्य का प्रतिशत पुस्तकें | 94.87% | 91.79% |
| 250x कवरेज ऊपर आधारों का प्रतिशत | 98.40% | 100% |
| आधारों में एक का प्रतिशतBove 1000x कवरेज | 95.90% | 99.70% |
| 250x नीचे कवरेज - Amplicon संख्या | 8 | 0 |
तालिका 3:। अनुक्रमण रन क्यूसी मेट्रिक्स यह मतलब कवरेज, कि डेटा की समीक्षा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं तो यह निर्धारित करने के लिए एक पुस्तकालय प्रस्तुत करने का नमूना क्यूसी बीत चुका सहित, सबसे महत्वपूर्ण रन आंकड़ों का सारांश नहीं है। पूरी प्रक्रिया सफल है अगर सब प्रतिशत 90% से ऊपर हैं, लेकिन यह संभव है, FPU धोने कदम या प्राइमर पार बात में SW1 का भार या UB1, 80 की रेंज में 'लक्ष्य पर प्रतिशत कम है करने के साथ - 90%। यदि 'प्रतिशत मैप' बहुत कम है, कि, बैक्टीरिया या अन्य डीएनए के एक संदूषण का संकेत के रूप में सभी के नमूने मानव के लिए तालमेल होना चाहिए होगा। इन विशेषताओं के किसी भी 80% से नीचे हैं, नमूना आगे की समीक्षा के लिए झंडी दिखाकर रवाना किया जाता है निर्धारित करने में मदद करने के लिए कैसे पी करने के लिएroceed और इस प्रक्रिया में सुधार होगा।
सारणी 4:।। प्रकरण 1 में परिणाम का पता चला रोगजनक, जुड़े रोग, अज्ञात महत्व के संस्करण (VUS), और 5% एलील आवृत्ति सूचीबद्ध हैं की रिपोर्टिंग मानदंड से ऊपर जाने की संभावना सौम्य exonic वेरिएंट इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 5:।। केस 2 परिणाम का पता चला रोगजनक, जुड़े रोग, अज्ञात महत्व के संस्करण (VUS), और 5% एलील आवृत्ति की रिपोर्टिंग मानदंड सूचीबद्ध हैं ऊपर जाने की संभावना सौम्य exonic वेरिएंट इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 1: एक amplicon आधारित SampleSheet.csv का एक उदाहरण है। इस शीट sequencer को बता देते हैं क्या रसायन शास्त्र को चलाने के लिए, क्या कार्यप्रवाह (जैसे, GenerateFastq), क्या आवेदन और परख (जैसे, FastqOnly), कितने दृश्य करने के लिए कुर्सियां (या पढ़ता है) (इस मामले में 186 बी.पी. में (इस मामले में Amplicon) x 186 बीपी), और अंत में क्या नमूने (कुछ अनुक्रमित के साथ जुड़े रहे हैं इस मामले दोहरे अनुक्रमण में)। भागों है कि पीले रंग में डाला जाता है जो कुछ भी चाहता है प्रयोगकर्ता को बदला जा सकता है, लेकिन इस मामले प्रयोगशाला इन मापदंडों का उपयोग करता है। यह आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
जैसा कि इस पांडुलिपि में वर्णित दो NGS परीक्षण चिकित्सकीय पेशकश कर रहे हैं, सबसे महत्वपूर्ण व्यावहारिक विचार गुणवत्ता नियंत्रण है। विशेष रूप से, बंद विचार गुणवत्ता और निकाले डीएनए की मात्रा करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। इस FFPE नमूने जो अक्सर चर डीएनए उपज के साथ अत्यधिक अपमानित कर रहे हैं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एक isopropanol वर्षा विधि आदेश FFPE नमूनों से डीएनए उपज को अधिकतम करने के रूप में स्तंभ आधारित विधियों कभी-कभी सीमित क्षालन संस्करणों के साथ डीएनए बाल काटना करने के लिए नेतृत्व करने के लिए पाए गए में विकसित किया गया था। इसलिए, समय था जब एक नमूना भी कम एकाग्रता पैदावार या परख के लिए भी अपमानित है की सबसे अधिक है, यह सबसे अधिक संभावना ऊतक आकार, प्रकार, या निर्धारण और न निकालने की प्रक्रिया के कारण है। रक्त / अस्थि मज्जा के नमूनों के लिए, अगर वहाँ एक निष्कर्षण विफलता है, यह आमतौर पर एक नमूना जा रहा है hemodilute की वजह से है (यानी, कि ड्रॉ में सफेद रक्त या ट्यूमर कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या नहीं होने के) या केमो ablated।
। NT "> सत्यापन के दौरान, डीएनए की गुणवत्ता और मात्रा की स्वीकार्यता के लिए cutoffs स्थापित किया जाना चाहिए 100 की सिफारिश की इनपुट - 250 एनजी अक्सर परख में प्रयोग किया जाता है, लेकिन, अगर डीएनए की गुणवत्ता अच्छी है, तो कम इनपुट मात्रा में सफल हो सकते हैं। तो उच्च इनपुट मात्रा अनुक्रमण परिणामों की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं (क्योंकि amplifiable डीएनए की मात्रा अनुशंसित इनपुट तक पहुंच जाएगा) - इसके अलावा, अगर डीएनए की गुणवत्ता खराब है (250 एनजी यानी, amplifiable डीएनए की मात्रा 100 से भी कम है) । डीएनए की गुणवत्ता और मात्रा के लिए मेट्रिक्स एक 'ग्रे जोन' (देखें चित्र 2) में पुस्तकालय तैयारी में डीएनए को आगे बढ़ाने से पहले प्रत्येक नमूने के लिए लागू किया जाना चाहिए। उन नमूनों को प्रयोगशाला के निदेशक या designee के विवेक पर चलाया जाना चाहिए। वर्तमान में सबसे अच्छा यदि डीएनए अनुक्रमण के दौरान अच्छा प्रदर्शन नहीं होगा भविष्यवाणी करने के लिए जिस तरह से एक qPCR आधारित परख है कि इनपुट डीएनए की मात्रा का ठहराव और गुणवत्ता के आकलन के लिए अनुमति देता प्रदर्शन करने के लिए है। यह दृष्टिकोण bioavailab के पतेनमूना में अलग अलग आकार के टुकड़े, विभिन्न आकार के टुकड़े (जैसे, 100 बीपी, 150 बीपी, 200 बीपी और 300 बीपी) और तुलना उपज के प्रवर्धन के माध्यम से की बड़प्पन।वर्तमान में, पुस्तकालय तैयारी जहां कई मौकों में से एक पर एक misstep पुस्तकालय के लिए या तो असफल हो या गरीब गुणवत्ता का होना पैदा कर सकता है मैनुअल के चरणों की एक बड़ी संख्या शामिल है। microfluidic जेल विश्लेषण अनुक्रमण से पहले एक पुस्तकालय प्रस्तुत करने का मुद्दा जाँच करने के लिए केवल क्यूसी कदम है। तदनुसार, वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम है, जहां अतिरिक्त mindfulness एक सफल प्रतिक्रिया की संभावना को बढ़ा सकते हैं। यह गारंटी करने के लिए सही नमूना और oligonucleotide पूल प्रत्येक नमूना के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं आवश्यक है। यह सुनिश्चित करने के लिए और ठीक रिकॉर्डिंग है कि प्रत्येक नमूना दोहरे अनुक्रमित पीसीआर प्राइमर जोड़े के 96 में से एक अनूठा संयोजन शामिल एक नमूना मिश्रण के लिए मौका कम कर देता है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर प्लेट (एफपीयू) सही ढंग से नालियों महत्वपूर्ण है; यदि यह उचित नाली नहीं है इस exte पैदा कर सकता हैपुस्तकालय तैयारी की nsion-बंधाव कदम suboptimally प्रदर्शन और खराब गुणवत्ता अनुक्रमण डेटा के लिए नेतृत्व करने के लिए। पुस्तकालय क्यूसी के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए कि LNB1 मोती पूरी तरह से resuspended हैं महत्वपूर्ण है और LNB1 / LNA1 समाधान अच्छी तरह से नमूने के लिए इसे जोड़ने के रूप में इस मिश्रण की एकाग्रता पुस्तकालय के molarity निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है पहले मिलाया है। अंत में, यदि मनका क्षालन कदम मोती बंद एल्यूटिंग पुस्तकालय का एक सबऑप्टिमल राशि के लिए होता है यह क्लस्टरिंग घनत्व कम हो जाएगा और संभवतः पुस्तकालय पर्याप्त मतलब कवरेज प्राप्त नहीं करने के लिए कारण। इसके विपरीत, पुस्तकालय की एक अतिरिक्त नेतृत्व करेंगे करने के लिए गरीब गुणवत्ता पढ़ता है। इसलिए, यह इष्टतम पूलिंग और sequencer पर लाइब्रेरी के क्लस्टरिंग सुनिश्चित करने के लिए मनका-आधारित सामान्य बनाने के कदम पर लगातार हो महत्वपूर्ण है।
पुस्तकालय तैयारी के अलावा, यह एक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन है कि कच्चे, डे-मल्टिप्लेक्स fastq फाइलों से सटीक उत्परिवर्तन कॉल का उत्पादन होगा मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है। चयन एककस्टम समाधान समय लेने वाली हो सकता है के रूप में वहाँ कई खुला स्रोत और वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध aligners, संस्करण कॉल करने, और NGS सॉफ्टवेयर संकुल है कि एक के माध्यम से झारना के लिए होता है। कस्टम एल्गोरिदम, आवश्यक प्रदर्शन आंकड़ों निकालने अद्वितीय आवर्ती म्यूटेशन कि सबसे खुला स्रोत उपकरण नहीं मिल पाई पहचान है, और लोकी में से प्रत्येक पर नकल संख्या स्थिति का निर्धारण करने के लिए तैयार करने की आवश्यकता होगी। एक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन की सत्यापन प्रक्रिया के दौरान, यह वेरिएंट है कि मिलने या गुणवत्ता को छानने के बाद कवरेज के दोनों एक न्यूनतम गहराई (जैसे, 250 की एक न्यूनतम पढ़ता है) और एक न्यूनतम एलील आवृत्ति से अधिक के लिए reportable cutoffs निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, 4 %)। यह एक मल्टिप्लेक्स amplicon आधारित परख के बाद से, यह निर्धारित करने के लिए कम से कम कवरेज की गहराई मतलब महत्वपूर्ण है (जैसे, 1,000x) पुस्तकालय न्यूनतम गहराई से पढ़ता के लिए सबसे कम प्रदर्शन amplicon प्राप्त करने में सक्षम होना करने के लिए प्राप्त करने की जरूरत है। इसके अलावा, परख की मल्टिप्लेक्स प्रकृति ग करता हैause बंद लक्ष्य प्रभाव और 'इन कलाकृतियों' की खोज की जा करने के लिए और पूरी तरह से शुरू होने से पहले पुनरीक्षित की आवश्यकता होगी। वर्णित परख के लिए एक और महत्वपूर्ण सीमा आदेश मान्य न्यूनतम एलील आवृत्ति प्राप्त करने के लिए 10% से अधिक ट्यूमर को रोकने के लिए नमूने के लिए एक की जरूरत है।
कम आवृत्ति, 1%, FLT3 सम्मिलन का पता लगाने के सबूत अभी भी इस प्रक्रिया में वांछनीय है कि मैनुअल समीक्षा की है। 5% की एक एलील आवृत्ति कट ऑफ के साथ भी, कुछ महत्वपूर्ण म्यूटेशन शायद याद किया और इस प्रकार मैन्युअल समीक्षा इन वेरिएंट पता लगाने के लिए आवश्यक हो जाएगा। FLT3-ITDs के लिए, एक्सॉन 14 के दृश्य निरीक्षण एक निम्न स्तर या बड़े सम्मिलन / दोहराव सुनिश्चित करने के लिए किसी का ध्यान नहीं जाना है सब एएमएल रोगियों के लिए किया जाता है। इसके अलावा, HER2 एक्सॉन 20 सम्मिलन है कि आमतौर पर प्राइमर अनुक्रम के बगल में हैं, मैनुअल हस्तक्षेप की जरूरत है। एक मजबूत जैव सूचना विज्ञान पाइप लाइन होने के बावजूद, कुछ वेरिएंट अनदेखी की जा सकते हैं जो सिर्फ एक कठिन कटौती होने का स्वभाव हैबंद सबसे आँकड़े के लिए ऊपर उल्लेख किया है। बेहतर जैव सूचना विज्ञान, इस मुद्दे को कम करने में मदद की जरूरत होगी के रूप में बेहतर होगा पुस्तकालय तैयारी और / या अनुक्रमण के तरीके में, क्योंकि यह भी कम cutoffs कि कम कलाकृतियों और झूठी सकारात्मक शामिल पर अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा के लिए अधिक फायदेमंद है।
का पता लगाने और एलील आवृत्तियों की व्याख्या ट्यूमर प्रतिशत दृढ़ संकल्प और जीनोम के कुछ क्षेत्रों के प्रवर्धन पूर्वाग्रह में कठिनाई के कारण मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, 50% से अधिक एलील आवृत्तियों, पता लगाया जा सकता है, क्योंकि इस मामले में मनाया 2. इस Heterozygosity (LOH) घटना की हानि के रूप में व्याख्या की है, या तो सामान्य एलील की कमी के कारण, उत्परिवर्ती की स्पष्ट वृद्धि के लिए अग्रणी, एक पढ़ता उत्परिवर्ती एलील (जैसे, 2 उत्परिवर्ती और एक सामान्य प्रतिलिपि) या अन्य तंत्र का लाभ। ये तंत्र सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (aCGH 19) और / या एक एसएनपी जीनोटाइपिंग सरणी का उपयोग करके स्पष्ट किया जा सकता है। 20।
वर्तमान लक्ष्य संवर्धन के तरीके या तो अक्षम संकर कब्जा या मल्टिप्लेक्स पीसीआर तकनीक का पूरा दिन प्रक्रियाओं है कि एक भी नमूना के अधिक अनुक्रमण कवरेज और बंद अधिक लक्ष्य अनुक्रमण पढ़ता के लिए की जरूरत में परिणाम पर निर्भर हैं। NGS आणविक ऑन्कोलॉजी के लिए अतिरिक्त अनुप्रयोगों निकट भविष्य में होने की उम्मीद आसान पुस्तकालय तैयारी के तरीकों कि पूरी तरह से automatable हो सकता है और इनपुट डीएनए की बहुत कम मात्रा के साथ नमूनों को प्रोसेस करने में सक्षम हो सकते हैं शामिल होंगे (यानी, 1 एनजी से कम) के साथ ही नमूने अत्यधिक अपमानित साथ डीएनए। इन चुनौतियों का सामना करने के लिए, सबसे तरीकों शायद पीसीआर आधारित होगा, या तो एक multistep पीसीआर दृष्टिकोण या एक व्यापक समानांतर singleplex पीसीआर दृष्टिकोण जा रहा है। इसके अलावा, व्यक्तिगत amplicons की आणविक बारकोडिंग नाटकीय रूप से पृष्ठभूमि अनुक्रमण शोर को कम करने के लिए दिखाया गया है और निचले एलील आवृत्तियों को प्राप्त करने और circulat पर कब्जा करने की दिशा में कदम ट्यूमर कोशिकाओं के कम अनुपात के साथ नमूनों की जांच में सक्षम होगाट्यूमर कोशिकाओं हैैं।
कैंसर के नमूनों में इस रोग से जुड़े म्यूटेशन की जांच के लिए दशकों से देखभाल के मानक किया गया है। ऐतिहासिक, जीन अक्सर क्रमिक रूप से, एक जीन / एक्सॉन एक समय में एक उत्परिवर्तन परीक्षण दृश्य के अंत करने के लिए अग्रणी की पहचान के साथ परीक्षण किया गया। NGS के आगमन कि रसौली के साथ जुड़े रहे कई उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए अग्रणी समानांतर में कई तरह के कैंसर के साथ जुड़े कई जीन अनुक्रमण के लिए एक कम पक्षपातपूर्ण दृष्टिकोण के लिए अनुमति दी गई है। कैंसर में दैहिक उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए NGS के नैदानिक उपयोगिता तेजी से स्पष्ट है। दरअसल, ट्यूमर के नमूनों की NGS-आधारित विश्लेषण एक नया प्रतिमान है कि पारंपरिक, एकल जीन परीक्षण को चुनौती दी प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन नैदानिक उपयोगिता बहुत स्पष्ट है। नैदानिक प्रयोगशालाओं आज इस शक्तिशाली प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के साथ सावधान विधि सत्यापन और परीक्षण व्याख्या से शादी करने के लिए रोमांचक अवसर है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों पांडुलिपि और उत्पादन में सहायता के पढ़ने के लिए डैनियल जंगली की सहायता को स्वीकार करना होगा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5365 | |
| Genomic DNA Reagents | Agilent Technology | 5067-5366 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technology | 5067-5585 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technology | G2965A | |
| TapeStation Analysis Software | Agilent Technology | A.01.04 or higher | |
| 96-well Tube Storage Racks | Any Vendor | ||
| 15/50 ml Tube Rack | Any Vendor | ||
| 96-well Plate Rack | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 0.5–2.5 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 1–10 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 2–20 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 10–100 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 20–200 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 100–1,000 μl | Any Vendor | ||
| Serological Pipettor | Any Vendor | ||
| Vortexer | Any Vendor | ||
| Ice bucket | Any Vendor | ||
| Microcentrifuge (for tubes and strip tubes) | Any Vendor | ||
| Freezer, -20 °C | Any Vendor | ||
| 4 °C Refrigerator | Any Vendor | ||
| Water or Bead Bath | Any Vendor | ||
| Incubator (37 °C) | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 1 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 5 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 10 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 25 ml | Any Vendor | ||
| Gloves | Any Vendor | ||
| Razor Blades/Scaples | Any Vendor | ||
| KimWipes | Any Vendor | ||
| 15 ml Conical Tube | Any Vendor | ||
| 50 ml Conical Tube | Any Vendor | ||
| Paper Towels | Any Vendor | ||
| 200 proof Ethanol | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
| 25 ml Reservoirs | Any Vendor | ||
| 10 N NaOH | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 1 – 10 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 10 – 100 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 20 – 300 μl | Any Vendor | ||
| Ice Bucket | Any Vendor | ||
| Water Squirt Bottle | Any Vendor | ||
| Alcohol Squirt Bottle | Any Vendor | ||
| Lens Cleaning Paper | Any Vendor | ||
| Plates, 96-well PCR, Semi-Skirted | Any Vendor | ||
| Tube strips, 8-well, 0.2 ml | Any Vendor | ||
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| BioShake IQ or 3000-T elm | Bulldog Bio/Q.Instruments | 1808-0506/ 1808-0517 | |
| DropPlate96 S - LabChipDS | Caliper | 128876 | |
| DropPlate96 D - LabChipDS | Caliper | 132848 | |
| DropSense96 | Caliper (Trinean) | ||
| DropQuant Software | Caliper (Trinean) | ||
| Plate Sealing Film | Denville | B1212-5S | |
| Aluminum Seal Foil | Denville | B1212-6S | |
| Nuclease-Free, Pure Water System | EMD Millipore | ||
| 5424 centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 | Both 15 ml tube and plate rotators, preferably a centrifuge that can go up to 2,500 x g. |
| Safe-Lock Tube 1.5 ml, Natural | Eppendorf | 22431021 | |
| 5 ml Tube, DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108310 | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 022620645 | Any plate rotator centrifuge will work |
| Hybex Microsample Incubator | Fisher Scientific | 1057-30-0 | |
| Hybex 0.2 ml Tube Block | Fisher Scientific | 1057-31-0 | |
| TruSeq Amplicon – Cancer Panel | Illumina | FC-130-1008 | 96 reactions |
| TruSeq Custom Amplicon | Illumina | PE-940-1011 | 96 reactions |
| TruSeq Custom Amplicon Index Kit | Illumina | FC-130-1003 | 96 Indices, 384 Samples |
| MiSeq Reagent Kit v3, 500 Cycles | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Kit v2, 300 Cycles | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles | Illumina | MS-102-2003 | |
| Experiment Manager | Illumina | 1.3 or higher | |
| MiSeq Reporter | Illumina | 2.0 or higher | |
| Sequencing Analysis Viewer | Illumina | 1.8 or higher | |
| TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit | Illumina | FC-130-1007 | |
| MiSeq v2 | Illumina | SY-410-1003 | |
| TruSeq Custom Amplicon Filter Plate | Illumina | FC-130-1006 | |
| Index Adapter Replacement Caps | Illumina | 11294657 | |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit 0.5 ml Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | |
| DynaMa6-96 Magnetic Stand, Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | |
| GeneAmp PCR System 9700 (gold/silver block) | Life Technologies | N8050200 | |
| Gentra Puregene Blood Kit | Qiagen | 158489 | |
| Deparaffinization Solution (16 ml) | Qiagen | 19093 | |
| Buffer ATL (4 x 50ml) | Qiagen | 939011 | |
| Protein Precipitation Solution (50 ml) | Qiagen | 158910 | |
| DNA Hydration Solution (100 ml) | Qiagen | 158914 | |
| Glycogen Solution (500 μl) | Qiagen | 158930 | |
| Qiagen Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| Rnase (5 ml) | Qiagen | 158924 | |
| Nuclease-Free Water (10 x 50 ml) | Qiagen | 129114 | |
| Pestles | USA Scientific | 1415-5390 | |
| TipOne RPT 10 µl elongated filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips). | USA Scientific | 1180-3810 | |
| TipOne RPT 100 µl natural, beveled filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1840 | |
| TipOne RPT 200 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-8810 | |
| TipOne RPT 20 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1810 | |
| TipOne RPT 1,000 μl natural, graduated XL filter pipet tips in | USA Scientific | 1182-1830 |
References
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