Introduction
Neste generasjons sekvensering (NGS) of Clinical Oncology prøver har blitt mer allment tilgjengelig i løpet av de siste årene som vokser vitenskapelige litteraturen viser til viktigheten av å identifisere målrettbare genetiske endringer og prediktiv / prognostiske molekylære markører. Multi-gen panel analyser og hele exome sekvense studier i både epitelceller 1,2 og hematologisk 3 maligniteter har stivnet begrepet svulst heterogenitet og klonal evolusjon som sykdommen utvikler seg og tilbakefall. I tillegg, i motsetning til konkurrerende teknologier som for eksempel polymerasekjedereaksjon (PCR) eller Sanger-sekvensering, kan NGS oppdage de fleste genomiske forandringer i alle klinisk relevante kreftgener i en enkelt assay 4.
The Center for Tilpassede Diagnostics opprinnelig lansert med to kliniske NGS paneler, et tilpasset Hematologisk Panel (Heme-NGS Panel) og en off-the-sokkel Cancer Panel for FFPE- prøver (Solid-NGS panel) (se Innholdet til den Heme-NGS Panel ble avledet fra flere kilder, men sentre rundt 16-genene mutert i akutt myeloid leukemi (AML) som tidligere er beskrevet som viser et høyt nivå av klinisk anvendelighet 5. Solid-NGS Panel er kommersielt produsert med den målrettede regioner basert på vanlig muterte gener i kreft som rapportert i Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) database seks. Flere viktige skritt karakterisere den generelle arbeidsflyten for kliniske NGS. Etter klinikeren beordrer testen, fastslår en patolog tilstrekkelighet av prøven følgende analyse for svulst prosent og prøvevolum. I vår institusjon, krever vi at minst 10% tumor på grunn av bakgrunnssekvensefeilhyppigheten ( "støy") av teknologien og effektiviteten av målrettet tilnærming. Når vevet er tilstrekkelig for testing, er genomisk DNA ekstrahert. Dette DNA blir deretter utsatt for flere kvalitetskontroll (QC) trinn. Dersom DNA passerer QC, er et fragment biblioteket generert og sekvensert. Den resulterende dataene er analysert gjennom en in-house bioinformatikk rørledningen. Etter bioinformatikk analyse, er varianter manuelt gjennomgått og tolket for patogenitet før innlemmelse i en klinisk rapport. Nedenfor beskriver vi to tilfeller som gikk gjennom denne grundige arbeidsflyt og til slutt førte til endringer i klinisk ledelse. Sak 1 - Akutt myelogen leukemi En benmargsbiopsi fra pasient A var diagnostisk for AML, uten modning. Cytogenetiske studier ble sendt på benmargen prøven og viste en normal kvinnelig karyotype. Det var 95% som sirkulerer blasts stede, så et perifert blod eksemplar ble sendt for personlig diagnostisk testing på Heme-NGS Panel. Akutt myelogen leukemi (AML) er en hematologisk malignitet av myeloid avstamning av hvite blodlegemer. deteksjons~~POS=TRUNCav genmutasjoner i AML har blitt stadig viktigere for prognose og behandling, med tilbakevendende genmutasjoner anerkjent som viktig i patogenesen og prognose 7. Mutasjoner i NPM1 og CEBPA har vært forbundet med en gunstig prognostisk risiko, mens interne tandem duplikasjoner (ITDs) i FLT3 har vært forbundet med en mindre gunstig utfall 8. En voksende mengde bevis støtter en patogen rolle for disse og andre mutasjoner i AML 9. Tilfelle 2 - Lung Adenocarcinoma En biopsi av en venstre supraclavicular masse fra pasient B vist lunge adenokarsinom. Biopsimateriale fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) lymfeknute massen ble sendt for genomisk testing (Solid-NGS Panel) som ruller / krøller med mer enn 50% tumor, for å finne ut om en mutasjon var til stede for målrettet terapeutisk intervensjon. Lung cancer er den ledende årsak til kreft relatert dødelighet i USA og er delt inn i to hovedtyper, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC). NSCLC kan bli ytterligere definert som enten adenokarsinom eller skvamøst cellekarsinom, basert på histologisk av lesjonen. Lunge adenokarsinom er den vanligste undertype av lungekreft, sett i både røykere og ikke-røykere, og er den vanligste formen for lungekreft for ikke-røykere 10. Molekylære studier av lunge adenokarsinomer har identifisert mutasjonen i flere onkogener 11. De vanligste driver mutasjoner identifisert i røykere er mutasjoner i KRAS og BRAF. De vanligste mutasjoner i ikke-røykere er mutasjoner i EGFR og rearrangements involverer gener ALK, RET og ROS1. Lungesvulster har blitt beskrevet med en in-frame ekson 20 innsetting i genet ErbB2 (HER2 / neu). Den vanligste abnormitet i HER 2 / neu er en forsterkning av dette locus i brystkreft hvor en målrettet terapi er tilgjengelig (trastuzumab: et humanisert monoklonalt antistoff mot HER2 / neu). HER2 / neu ekson 20 innsetting som er observert i 2-4% av lunge adenocarcimomas 12 har vist delvis respons på kombinasjonsbehandling med HER2 / neu og mTOR-hemmere (neratinib og temsirolimus, henholdsvis) 13. 
Figur 1:. Liste over Gener som dekkes i Panels Library forberedelser er utført ved hjelp av enten den tilpassede Hematologisk Panel (Heme-NGS Panel) av 33 gener eller off-the-sokkel Amplicon Cancer Panel (Solid-NGS) av 47 gener. Ikke alle gener eller eksoner dekkes i sin helhet, som noen amplikonene kan bare omfatte visse hotspots. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ A>
Protocol
Denne protokollen innbefatter de viktigste trinnene med to validerte laboratorie utviklet tester for den genomiske profilering av faste og flytende tumorer, respektivt. Testingen utføres i laboratoriet er gjort i samsvar med kravene i kliniske laboratorier Forbedrings Endringer (CLIA) i 1988.
1. DNA Extraction fra perifert blod eller benmarg
- Bestem hvor mye blod eller benmarg for å ta utgangspunkt i tabell 1.
| Prøve / WBC | Mengden som skal behandles 1 ml blod |
| Beinmarg | 250 fil |
| Blood WBC 12.000 - 50.000 | 1 ml |
| Blood WBC 50000 - 100000 | 500 mL |
| Blood WBC 100 000 - 200 000 | 200 ul </ Td> |
| Blood WBC> 200000 | 100 pl |
| * For Blood WBC <12000, ta 2 ml blod | |
Tabell 1:. Blood / Bone Marrow volum for å bruke Chart Siden hvite blodlegemer vil variere fra prøve til prøve, er det vanskelig å angi et bestemt volum av blod å bruke. Derfor må mengden av blod som skal brukes for analysen bestemmes ved å se på de hvite blodlegemer (WBC) før start av analysen. Selv om mindre blod blir benyttet, bør det likevel behandles som om de 1 ml Siden volumet av blod som brukes er redusert fordi antallet celler tilstede er større enn normalt.
- Flg kommersielt tilgjengelig kit protokoll for å isolere genomisk DNA.
2. DNA Utvinning fra Formalin fiksert parafin-embedded (FFPE) Tissue
- Basert påsvulsten regionen patologen sirklet på H & E lysbilde, stille opp ufargede lysbilder med guiden H & E lysbilde og skissere et tilsvarende område for utvinning. For makro-disseksjon, prosessen bare ett eksemplar / pasientens sett lysbilder om gangen.
- Varm gliderne på en 45 ° C varmeblokk til svakt smelte parafin. skrape forsiktig vevet innenfor linjene som er merket på lysbildet, ved hjelp av en ny skalpell for hver prøve som skal trekkes ut. Plasser voks avskraping inn i hensiktsmessig merket 1,5 ml tube. Vær forsiktig fordi skrapt voks er veldig elektro og kan hoppe ut av røret.
- Legg 320 mL av Deparaffinization løsning for hver fem til seks fem mikrometer seksjoner (25 - 30 mikrometer totalt). For eksempel, hvis et rør inneholdende 3 deler av en 10 um rull / curl kommer til å bli behandlet, og deretter bruke 320 pl, men hvis 5 seksjoner på den samme tykkelse ble erholdt da bruke 640 pl.
- Vortex kraftig i minst 10 sekunder og utføre aquick spinne i en mikrosentrifuge for å fjerne vev / voks fra sidene og lokket, og inn i oppløsningen. Inkuber ved 56 ° C i 3 minutter, og deretter inkuberes ved RT i 5 -. 10 min.
- Etter RT inkubasjon, tilsett 180 mL av ATL buffer for hver 320 ul Deparaffinization Solution lagt. Finhakk vev ti ganger med en steril mini-stampe ved hjelp av en ny stampe for hver prøve. Sikre at det ikke vev fast til stampe, så det kan være veldig klissete. Vortex suspensjonen kraftig i 3 sekunder, deretter sentrifuger ved maksimal hastighet i 1 min.
- Tilsett 10 ul proteinase K til den nedre klar fase. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned for å sikre vevet resuspenderes. IKKE vortex. Inkuber ved 56 ° C over natten med risting ved fra 400 - 500 rpm.
- Neste morgen, sjekk om vevet er helt oppløst (dette har skjedd dersom lavere oppløsningen er klar). Hvis lavere oppløsningen ikke er klar, så vortex kraftig i 3 sek og sentrifuger ved maksimal hastighet for 1 min. Legge til en ekstra 5 - 10 ul proteinase K og inkuber ved 56 ° C i ytterligere 30 - 60 min.
- Inkuber ved 90 ° C i 1 time for å bidra til å tilbakeføre formaldehyd-tverrbinding. Tillate prøvene å avkjøles til romtemperatur i 5 - 10 min og deretter raskt sentrifuger hvert rør for å konsolidere væsken.
- Overfør den nedre klart fase inn en merket 1,5 ml tube. Hvis det er flere rør fra den samme pasientprøve (for eksempel tilfelle når flere ruller er i bruk), rekombinerer de nedre faser i en tube ved dette punktet. Merknad: Overføring av små mengder av Deparaffinization løsning bør ikke forstyrre renseprosedyren, men det er en risiko dersom en stor mengde blir overført.
- Tilsett 2 ul RNase A oppløsning. Vortex forsiktig eller snu 25 ganger og rask spinn i en mikrosentrifuge. Inkuber ved RT i 5 min.
- Tilsett 200 ul av proteinutfelling løsning. Hvis du gjør en eller to ruller, bruke 200 mL. Hvis du gjør tre rolls på en gang, og deretter bruke 400 mL. Vortex kraftig ved høy hastighet i 30 sekunder for å ensartet blande de lyseringsbuffere. Inkuber på is i 5 min eller prøvene kan bo på is i opp til en time.
- Sentrifuger ved 5000 xg i 5 min. Det utfelte protein bør danne en tett, hvit pellet. Hell av supernatanten til et merket 1,5 ml rør, og deretter inkubere prøvene på is i minst 3 min. Sentrifuger ved 5000 x g i 3 min.
- Tilsett 200 ul 2-propanol (Isopropanol) for hver 180 ul Buffer ATL tilsatt tidligere, til en merket 1,5 ml rør (det kan være nødvendig å anvende en 2 ml rør). For eksempel, hvis dette tre ruller legge til 600 pl isopropanol. Tilsett 1 mL av glykogen for hver 180 ul Buffer ATL lagt tidligere til isopropanol og Snu røret flere ganger for å blande.
- legge supernatanten forsiktig fra Protein Nedbør skrittet inn i Isopropanol blandingen. Bland ved å snu røret forsiktig minst 50 ganger.
- Sentrifuger ved maksimal speed i 3 min. DNA vil være synlig som små hvite pellet på bunnen av røret.
- Hell eller aspireres av supernatant til det aktuelle avfall røret. Hold en separat 1,5 ml avfall rør for hver prøve i tilfelle pelleten kommer forflyttet slik at det ikke vil gå tapt eller blandet med avfall av andre prøver. Renne røret på et papirhåndkle og sikre flertallet av Isopropanol er fjernet.
- Legg 300 mL av rykende 70% etanol. Snu røret forsiktig flere ganger for å vaske pelleten. Prøv å sikre pelleten kommer ut av stilling for å sikre en mer grundig rengjøring.
- Sentrifuge ved maksimal hastighet i 5 min. og deretter fjerne etanol nøye. Den pellet kan være løs, så helle eller aspirer sakte og se pelleten. Fjern overskuddet av etanol fra innsiden av røret, uten å berøre pellet. La prøvene lufttørke i 5 - 15 min, er forsiktig med å ikke over tørke prøven.
- Legg mellom 25-100 mL av DNA Hydration Solution til each prøven basert på størrelsen av DNA-pelleten og start mengden av vev. Vortex rørene kraftig og kort spinne i en mikrosentrifuge. Inkuber i 1 time ved 65 ° C for å full rehydrere DNA.
3. Genomisk DNA Quality Control
Merk: Det er tre uavhengige trinn for DNA kvalitetskontroll (QC). Se tabell 2 for nærmere forklaring på hvorfor hver QC trinnet utføres.
| Instrument | Resultat | Indikasjon | ideell Range |
| DropSense96 | A260 / A230 | Identifisering av kjemiske forurensninger (for eksempel etanol) | 1,50 til 2,2 |
| DropSense96 | A260 / A280 | Identifisering av proteinforurensninger | 1,60 til 2,2 |
| DropSense96 | Konsentrasjon | DNA kvantifisering | > 1 ng / mL |
| TapeStation | DNA Smear | Bestemmelse av DNA integritet (for eksempel nedbrytning / fragmentering av ekstrahert DNA) | 50%> 1000 bp |
| qubit 2.0 | Konsentrasjon | Mer nøyaktig DNA kvantifisering | > 1 ng / mL |
Tabell 2:. DNA QC Forventede resultater Alle disse verdiene er tatt hensyn til før du kjører tillater en prøve for å gå videre til biblioteket forberedelsesstadiet.
- Etter produsentens protokoll, kjøre 2 mL av den ekstraherte DNA på en fluorometer å skaffe arbeids konsentrasjon (ng / mL) av prøven.
- Kjør 1 - 2 ul av hver prøve på et UV / VIS-spektrofotometer for å kontrollere kvaliteten av prøven (A260 / A230 og A260 / A280 rotteIOS) i henhold til produsentens instruksjoner.
- For FFPE-prøver: Etter produsentens anvisninger, kjøre 1 mL av hver prøve på en microfluidic gel-elektroforese system for å vurdere nedbrytning / fragmentering av DNA. Se figur 2 for eksempler.
Fig. 2: Genomisk DNA QC Gel Eksempel grønn linje over de nedre bånd er å indikere den nedre markør. Den ekstra-in rød linje er å indikere ca 1000 bp. Lane A2 representerer helt intakt DNA, som man ville forvente fra fersk tis sue (f.eks perifert blod eller benmarg). Baner B1, C1, D1, B2, C2, E2 er eksempler på gode, intakt FFPE DNA. DNA i kjørefelt F2 synes å være intakt, men ved for lav konsentrasjon. DNA i kjørefelt G2 er degradert eller fragmentert og vil ikke fungere i analysen. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 representerer DNA som faller i "gråsonen" som betyr at analysen kan fungere godt, men noen av DNA kan bli for skadet eller tverrbundet og dermed vil ikke gi gode resultater i analysen. Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.
4. Amplicon Bibliotek Forberedelse
- Hybridisering av Oligo Pool og Extension-Ligering av Bound oligos
- I Pre-PCR rom, legge det nødvendige volumet av lav EDTA TE, 5 mL av panelets Oligo Tube (f.eks Solid-NGS Panel eller Heme-NGS Panel), og 100-250 ng av genomisk DNA til hver tilsvarende godt i en halv gikk langs 96 brønn-plate merket som Hybridisering (HYB) plate.
- Legg 40 ul Oligo Hybridisering for Sequencing Reagens 1 (OHS1) til hver prøve i HYB plate. Forsiktig pipettere opp og ned minst 5 - 6 ganger for å blande. Endre tips etter hver kolonne for å unngåkrysskontaminering.
- Tett HYB plate med selvklebende aluminiumsfolie og sentrifuger ved 1000 xg i 30 sek.
- Inkuber HYB platen i den forvarmede hybridisering inkubator ved 95 ° C i 1 min. Sette temperaturen av hybridisering inkubator til 40 ° C. Fortsett å inkubere så lenge som det tar inkubatoren for å redusere fra 95 ° C til 40 ° C (~ 90 min). Merk: Dette gradvis avkjøling er avgjørende for riktig hybridisering.
- I løpet av siste 15-20 min av hybridisering inkubasjon, pre-vaske Filter Plate Unit (FPU). Forbered bare de brønner som skal anvendes i den nåværende analysen, dvs. bare bruker ferske / ubrukte brønner av en tidligere åpnet filterplate, men aldri gjenbruke brønner som har blitt brukt. Merk: Dette bør være klart basert på Kit Antall på filterplaten, markeringene på filterplaten, og tetningsmasse brukes på tvers av platen.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 45 mL av Streng Wash 1 (SW1) til hver brønn.
- Hvis det finnes gjenværende væske, roter FPU 180 ° og gjenta sentrifugen skritt igjen for ytterligere 3 min. Dersom den resterende væske roterer gjennom den andre gang, og deretter gå videre til neste trinn, hvis ikke da det kan være en feil i filterplaten og den gjeldende platen må skiftes ut.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 45 mL av Streng Wash 1 (SW1) til hver brønn.
- Når hybridiseringen kuvøse er avkjølt til 40 ° C, sentrifuger platen ved 1000 x g i minst 30 sek ved 20 ° C for å samle kondens. Overfør hele volumet av hver prøve fra de HYB platen på midten av de tilsvarende forvasket brønnene i FPU. Endre tips etter hver kolonne for å unngå krysskontaminering. Dekk til FPU og sentrifuger ved 2250 xg i 3 min ved 20 ° C.
- Legg 45 ul SW1 og sentrifuger ved 2250 xg i 3 min ved 20 ° C. Gjenta for totalt to vasker. Roter FPU 180 ° og sentrifuger igjen på 2250 xg i 3 min for å fjerne all SW1.
- Dissemble FPU. Forkast alle gjennomstrømnings (inneholdende formamid) inn i riktig avfallsbeholder. Monter FPU å bruke en annen MIDI Avfall Collection Plate. Legg 45 ul av Universal Buffer 1 (UB1) til hver prøve godt og sentrifuger ved 2250 xg i 3 min ved 20 ° C. ADVARSEL: Inneholder formamide.
- Legg 45 mL av Extension hemorroider Mix 3 (ELM3) til hver prøvebrønnen på FPU plate og pipette opp og ned 3 ganger for å blande. Merk: Extension-Ligation reaksjon finner sted på filterplaten membran.
- Tett FPU plate med klebemiddel aluminiumsfolie og inkuberes hele FPU sammenstillingen i et forvarmet 37 ° C inkubator i 45 min.
- Indeksering og PCR Amplification
- Delmengde indeksene som brukes til de tilsvarende brønner i Indeksert Amplification Plspiste (IAP) ved å arrangere primere i indeksen Plate ligaen, arrangert på følgende måte: i5 primer rør (hvit caps, klar oppløsning) vertikalt, på linje med rader A til H, i7 primer rør (oransje caps, gul løsning) horisontalt , på linje med kolonne 1 til 12. Ved hjelp av en p10 flerkanals pipette, tilsett 4 pl i7 primere (gul løsning) til hver rad i IAP og legge 4 mL av i5 primere (klar løsning) til hver kolonne i IAP.
- På is eller en kjøleblokk, forberede PCR Master Mix ved å tilsette 0,5 mL av DNA Polymerase 1 (TDP1) til 25 ul av PCR Master Mix 2 (PMM2) per prøve. Inverter, raskt vortex, og kort sentrifuger PCR Master Mix å blande.
- Legg 22 ul av PCR masterblanding til hver brønn av IAP og pipetten opp og ned 3 ganger for å blande. Endre tips mellom brønner. Hold IAP ved 4 ° C.
- Etter 45 min Extension-Ligation reaksjon (trinn 4.1.10), fjern FPU fra inkubatoren og forsiktig fjerne aluminum folie segl. Dekk med lokket og sentrifuger ved 2250 xg i 3 min ved 20 ° C.
- Legg 25 ul av 50 mM NaOH til hver prøve godt på FPU. Pipetter opp og ned minst 6 ganger; sikre pipettespissene kommer i kontakt med membranen. Endre tips etter hver kolonne. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Overføre prøvene eluert fra FPU til IAP som følger:
- Ved hjelp av en p100 flerkanals pipette satt til 20 ul, pipette NaOH på FPU platen opp og ned minst 6 ganger. Litt vippe FPU plate for å sikre fullstendig aspirasjon av platen.
- Overføre 20 ul fra FPU til den tilsvarende kolonne av IAP. Forsiktig pipette opp og ned minst seks ganger for å grundig kombinere DNA med PCR Master Mix. Tett IAP med lim film og sentrifuger ved 1000 xg i 1 min ved 20 ° C.
- Ta med PCR Plate i Post-PCR Room og laste platen på en termosykler. Kjør PCR program som består av et varme denaturerende trinn ved 95 ° C i 3 minutter; etterfulgt av 25 sykluser med 95 ° C i 30 sek, 62 ° C i 30 sek, 72 ° C i 60 sekunder; etterfulgt av en endelig forlengelse på 72 ° C i 5 min; etterbehandling med en hold ved 10 ° C. Hvis ikke går videre til neste trinn etter gjennomføringen av PCR, kan platen forbli på termosykler over natten, eller det kan lagres ved 2 til 8 ° C inntil to dager.
- PCR Rensing og Bead-baserte Normalisering
- Fjern de magnetiske rensing perler, elueringsbuffer (EBT), og gel-elektroforese reagenser fra 4 ° C kjøleskap og sted ved RT minst 20 min før neste etappe.
- Når PCR er fullført, sentrifuger ved 1000 xg i 1 min ved 20 ° C samle kondens. Overfør 1 mL av hver PCR-reaksjon å strippe rør / plate brønner som inneholder 4 mL vann for å fortynne prøvene 1/5. Pipetter opp og ned for å blande.
- Tilsett 2 mL avfortynnet PCRed prøvene til 2 mL av mikrofluid-gel buffer. Tett strimler / plate. Rist på 1800 rpm i minst 30 sek og sentrifuger ved 1000 xg i 30 sek. Ved å følge produsentens protokoll, kjøres blandingen på en mikrofluid gel for å vurdere om biblioteket preparat ga en akseptabel bibliotek (se figur 3).
- Vortex de magnetiske rensing perler til de er godt suspendert og fargen vises homogen. Legg 45 mL av perlene til hver prøve.
- Tett plate med klar tape film og rist plate på 1800 rpm i 2 min. Inkuber ved romtemperatur uten rysting i 10 minutter.
- Sett platen på en magnetisk stativ. Når supernatanten har ryddet, fjern forsiktig og kast supernatanten. Hvis noen perler er utilsiktet suges inn i tips, dispensere perlene tilbake til platen og la tallerkenen hvile på magnet for 2 min og bekrefte at supernatanten har ryddet.
- Med platen på than magnetisk stativ, tilsett 200 mL av nylaget 80% etanol til hver prøvebrønnen. Flytt platen frem og tilbake et par ganger. Inkuber platen på den magnetiske stå i 30 sek. fjern og kast supernatanten forsiktig. Gjenta for totalt to vasker.
- Fjern overskudd av etanol ved en kort sentrifugering av platen ved 1000 x g for å kjøre ned en hvilken som helst ethanol på røret sidene, plassere platen tilbake på den magnetiske stand, og ved å bruke en p10 flerkanals pipette satt til 10 pl for å fjerne etanolen. Tillat perlene lufttørke for 5-8 min.
- Ved hjelp av en p100 flerkanals pipette, tilsett 30 ul EBT til hver brønn. Pipetter opp og ned et par ganger for å sikre perlene kommer ut på siden av røret. Tett plate med klar tape film og rist plate på 1800 rpm i 2 min.
- Inkuber ved romtemperatur uten rysting i 3 minutter. Dersom det finnes prøver hvor kulene ikke er fullstendig resuspendert forsiktig pipettere opp og ned for å resuspendere kulene.
- Sett platen på et magnetisk stativ. Ved hjelp av en p100 flerkanals pipette overføre 20 mL av supernatanten til en helt ny plate kalt Bibliotek Normalisering Plate (LNP). Overfør de resterende ~ 10 mL av de enkelte sekvense bibliotekene til en egen plate kalt Gjenværende renset opp Bibliotek Plate (RCLP). Lagre denne plate sammen med den endelige bibliotek prep, ettersom den kan brukes som en reserve for en andre sekvensdrevet, om nødvendig. Hvis ikke går videre til neste trinn, kan LNP og RCLP oppbevares ved -15 til -25 ° C.
- Kraftig vortex og resuspender bibliotek Normalisering Perler 1 (LNB1). Det er viktig å fullstendig resuspendere LNB1 vulst pellet på bunnen av røret. Forbered Normalisering Mix, ved å blande 8 pl LNB1 med 44 mL av Library Normalisering Tilsetningsstoffer 1 (LNA1) per prøve. Kraftig vortex Normalisering Mix for 10 - 20 sek.
FORSIKTIG: LNA1 inneholder formamide. - Med intermitterende inversjon ennd virvling av Normalisering blanding, tilsett 45 ul til hver prøve av LNP. Tett plate med klare klebefilmen og riste platen ved 1800 rpm i 30 min. Denne 30 minutter inkubasjon er kritisk for riktig bibliotek normalisering som inkubasjoner som er større eller mindre enn 30 minutter kan påvirke bibliotek representasjon og cluster tetthet.
- I løpet av 30 min inkubasjon, forberede reagenser for sekvensering ved tining reagensforpakningen og Hyb Buffer (HT1) [FORSIKTIG: Begge inneholder formamide]. I tillegg får is for et senere trinn og sikre en varmeblokk er egnet for 1,5 ml sentrifugerør er satt til 96 ° C.
- Når 30 min blandetrinnet er fullført, plasserer LNP på et magnetisk stativ. Når supernatanten har ryddet, kan du bruke en flerkanals pipette for å forsiktig fjerne og kast supernatanten i riktig avfallsbeholder.
- Fjern det LNP fra den magnetiske stativet og vaske perlene med Library Normalisering Wash 1 (LNW1) som følger:
- Legg 45ul av LNW1 til hver prøve godt.
ADVARSEL: Inneholder formamide. Tett plate med klare klebefilmen og riste platen ved 1800 rpm i 5 min. Gjenta for totalt to vasker. Sørge for å fjerne all LNW1 etter den andre vask.
- Legg 45ul av LNW1 til hver prøve godt.
- Fjern det LNP fra magnetstativet og ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 30 ul 0,1 N NaOH (mindre enn en uke gammel) til hver brønn for å eluere prøven. Tett plate med klare klebefilmen og riste platen ved 1800 rpm i 5 min.
- I løpet av 5 min elueringen, tilsett 30 ul Library Normalisering lagringsbuffer 1 (LNS1) til hver brønn for å bli brukt i en ny plate heter lagringsplaten (SGP).
- Plasser LNP på magnetstativet. Når supernatanten har ryddet, overføre 30 mL eluering til LNS1 i SGP. Endre tips mellom prøver å unngå smitte.
- Tett plate med selvklebende film og sentrifuger ved 1000 xg i minst 30 sek.
- Tilsett 51; l av hver prøve for å bli sekvensert til en merket Felles-Amplicon bibliotek (PAL) 1,5 ml rør. Vortex PAL å mikse og kort spinne ned i en mikro.
- Avhengig av hva sekvense kjemi blir brukt (V2 eller V3) legger 4 - 10 mL av PAL til 590 - 596 mL av HT1. Vanligvis legger 5,8 mL av PAL til 595 mL av HT1 for V2 kjemi og 8,5 mL av PAL til 592 mL av HT1 for V3 kjemi. Merk dette røret som Fortynnet Amplicon Library (DAL) tube.
- Vortex DAL og kort spinne ned i en mikro. Inkuber DAL ved 96 ° C i 2 min. Vend DAL røret 3 ganger og sette DAL på is i minst 5 min, mens han forberedte sequencer for sekvensering. Etter 5 min, er den DAL klar til å bli lastet.
- Hvis ferdig med SGP, forsegle plate med selvklebende aluminiumsfolie film og merk den med dato og plate-ID. Oppbevar forseglet SGP og PAL ved -15 til -25 ° C.
Figur 3:. Bibliotek Prep QC Gel Eksempel Den grønne linjen over lavere band er å indikere lavere markør og lilla linje over de øverste båndene er å indikere høyere markør. Alt fungerte bra for baner H1, A2, B2, C2, E2, og G2. Biblioteket prep fungerte ikke optimalt, for baner D2, F2 og H2, men resultatene vil fortsatt bli innhentet de bare kan ikke ha tilstrekkelig dekning. For A3, biblioteket prep knapt virket og mest sannsynlig denne DNA-prøven var ikke tilstrekkelig for analysen. De nedre bånd over den nederste markør er de ubrukte primere, fordi alikvoten er tatt direkte fra PCRed brønnen. NTC Prøven skal bare ha den ubrukte primer band, og ingenting annet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Sekvense
- Sikre en korrekt SampleSheet.csv har blitt gjort for kjøringen. Se Supplerende Figur 1 for et eksempel.
- Skyll og tørk strømningscellen og tilsett 600 mL av DAL til tint reagensforpakningen.
- Forbered sequencer for sekvensering ved å følge instruksjonene på skjermen.
6. Data Analysis
- Utfør bioinformatikk rørledningen. Utnytte in-house, tilpasset designet bioinformatiske rørledning for å identifisere mutasjoner, innskudd, slettinger og presiseringer 18.
- Etter at rørledningen er ferdig, sjekk loggfilene for feil / advarsel, som noen vesentlig feil / advarsler hjelpemiddel i QC av rørledningen behandling.
- Analyser kjøre statistikk (Tabell 3) for å sikre sekvensert bibliotek har passert laboratoriet bestemmes QC beregninger (figur 4). Gjennom hver variant manuelt ved å vise .bam filene i en genomisk data viewer (f.eks Genomics Viewer 16 (IGV)).
MERK: Bare varianter innenfor den validerte allel-frekvensområdet og over minimumsdybde på dekning etter kvalitet filtrering er rapportert (ved hjelp av Human Genome Variasjon Society (HGVs) nomenklatur). For sluttrapportering, ble hver exonic variant kategorisert i: patogene, sannsynligvis sykdom forbundet, variant av ukjent betydning (vus), sannsynlig godartet, og godartet. Alle varianter over rapporteringskriteriene av 5% allelfrekvens unntatt disse anses godartede varianter og synonymt endringer, ble rapportert.
Figur 4. Oversikt over kontrollører trinn for NGS. Kvalitetskontroll av hvert trinn i prosessen er nødvendig for å sikre sekvensering vil gi resultater slik at før og etter sekvense beregninger blir vurdert. Passende prøven behandling er avgjørende for høy kvalitet DNA. blod ogbenmargen i upassende fiksativ kan gi lav kvalitet DNA. Upassende fiksering av faste vevsprøver kan degradere DNA (f.eks fiksering i B5). DNA kvalitet bør vurderes for protein og RNA forurensning ved spektrofotometriske midler, og nøyaktig vurdert for mengden og integriteten til DNA. Sekvenserings beregninger må bestemmes empirisk i sekvense laboratorium og fulgt for hver sekvenseringsreaksjon og hvert eksemplar. Før rapportering sekvenseringsresultater for hver prøve bør vurderes for dekning, dybde og tilstrekkelig ytelse av positive og negative kontroller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Sak 1 - Heme-NGS Panel
DNA ekstrahert fra leukemisk perifert blod var av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet (176 ng / mL) for den Heme-NGS panel. Den totale midlere dybde av dekning var 4,933x (over minimum gjennomsnittlig dybde på dekning av 1,000x). Ytterligere kjøre statistikk er i tabell 3. Av de 8 regionene nedenfor 250x dekning, 3 var på grunn av feil trimming av primerne (dvs. primeren sekvensen ble ikke ordentlig fjernet på grunn av sekvenseringsfeil), en var en kjent gjenstand av analysen og de andre fire var delvis regioner av eksoner av ulike gener uten rapporterings varianter. Selv om vår kliniske protokollen omfatter bare rapportering varianter som dekkes av minst 250 leser, leser alle data med minst 100 er importert inn i databasen for gjennomgang.
Databehandling from bioinformatikk rørledningen oppdaget tre rapporteringspliktige, sykdomsassosierte mutasjoner; en missense mutasjon i FLT3, en missense mutasjon i IDH2, og et rammeskifte mutasjon i NPM1. De exonic varianter med sine allel frekvenser, er beskrevet i tabell 4. En vanlig mutasjon i FLT3 er FLT3 -Internminne tandem-duplisering (ITD) som ikke automatisk kalt av vår rørledning og krever en visuell inspeksjon av exon 14. Visuell inspeksjon av exon 14 av FLT3 viste ingen innsetting eller duplisering i de innsendte prøven. Den FLT3 I836del var på 1% allel frekvens og ble ikke tatt med i den endelige rapporten fordi den falt under valideres minimum allelet frekvens på 5%. Denne mutasjonen er ikke på samme DNA-molekyl som FLT3 D835Y endring (dvs. observert i samme fragment regionen, men ikke i "cis" i noen av sekvensering leser), og det ble kun observert ved manuell gjennomgang av .bam files når verifisere p.D835Y endring. De nedre allel frekvensene av de to FLT3 mutasjoner antyder at disse mutasjoner kan representere heterogenitet og / eller klonal evolusjon; imidlertid, kan forskjellen skyldes analyseytelse for at fragment eller en enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) nær eller overlappende primersekvensen som påvirket amplifikasjon av denne allelet.
De Heme-NGS Panel resultater for Tilfelle 1 med AML identifisert mutasjoner i FLT3, IDH2, og NPM1 er tre vanlige muterte gener i AML. Mutasjoner i FLT3 observert i ~ 25% av voksne pasienter med AML (COSMIC database 17) og er enten indre tandem duplikasjoner (ITDs) eller missense mutasjoner i tyrosin kinase domene. De FLT3-ITDs er de mer vanlig mutasjon og er assosiert med dårlig respons på standard kjemoterapi, mens prognostisk betydning av FLT3 kinase domain punktmutasjoner, som i dette AML pasient, har en uklar innvirkning på prognose 14. Isocitrat dehydrogenase 2 (NADP +), mitokondrie (IDH2) er et gen som koder for en epigenetisk modifier som vanligvis mutert i AML. Mutasjoner i epigenetiske modifikatorer er relativt vanlig i AML, med mutasjoner i IDH1 og DNMT3A representerer andre mutasjoner i denne klassen av gener som fører til genet feilregulering. Mutasjoner i genet for nucleophosmin (NPM1) er en av de mest vanlige ervervede mutasjoner i AML og er generelt ansett for å være en god prognostisk faktor (i fravær av en FLT3 - ITD).
Co-mutasjoner av NPM1 og IDH2 er blitt beskrevet i litteraturen som et gunstig prognostisk indikator 5, med et 3-års overlevelse på 89%. Dette representerer en betydelig overlevelsesfordel i forhold til den totale 3-års overlevelsevilltype NPM1 og IDH2 på 31%. For eksempel, standard-omsorg praksis omfatter mutasjonsanalyse for NPM en og FLT3-ITD mutasjoner. I dette scenariet vil påvisning av bare et NPM1 mutasjon ikke klarer å riktig stratify pasienten for risiko, som de sekundære mutasjoner kan være gunstig (f.eks IDH2) eller ugunstig (f.eks TET2), reduserer tillit for å lindre en benmargstransplantasjon.
Tilfelle 2 - Solid-NGS Panel
DNA ekstrahert fra FFPE vev var av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for Solid-NGS panel, med en konsentrasjon på 252 ng / mL og bare 4% av DNA under 1000 basepar (bp). Etter dataanalyse den midlere dybde av dekningen var 9167 leser (godt over minimumsdybde cutoff av 1000 lesninger) uten regioner under 250 lese dybde. Andre QC beregninger er shown i tabell 3.
Data som er behandlet gjennom bioinformatikk rørledningen oppdaget to sykdomsassosierte mutasjoner: en in-frame innsetting i ekson 20 av ErbB2 (HER2 / neu) og en missense mutasjon i TP53. Alle exonic varianter med sine allelfrekvenser er representert i tabell 5. Innsetting i ErbB2 faktisk representerer en tandem dupliseres (HER2 / neu) sekvens, noe som reflekteres i nomenklaturen. Identifisering og bekreftelse av in-frame innsetting kreves manuell gjennomgang av sekvensering leser gjennom IGV. Detekteringen av mutasjonen frekvenser som er større enn 50%, som vist for både den TP53 og Her2 / neu mutasjoner antyder et tap av heterozygositet (LOH) aktivitet (se diskusjon).
SSD-NGS Panel resultater for Tilfelle 2 med lunge adenokarsinom oppdaget mutasjoner in ErbB2 (HER2 / neu) og TP53, to gener som ikke er vanligvis testes for som en del av den nåværende standard-of-care for lungekreftpasienter. HER2 / neu koder for en tyrosinkinasereseptor som ligner på en annen vanlig muterte genet i lungekreft, EGFR . Aktivering HER2 / neu ekson 20 innsett er observert i 2-4% av lungekreft adenokarsinomer, står for mesteparten av HER2 / neu mutasjoner observert i lungekreft, og er vanligvis sett i svulster uten mutasjoner i andre driver gener som EGFR og ALK 12 . Det er flere linjer med bevis som viser potensialet for ulike behandlingstilbud for pasienter med aktive HER2 / neu innsett, inkludert delvis respons på kombinasjonsbehandling med HER2 / neu og mTOR-hemmere 13 og betydelig sykdomskontroll med det monoklonale antistoffet Trastuzumab i kombinasjon med kjemoterapi 15. Oppdage en TP53 endringen er ikke uncommon i kreft, men på dette tidspunktet er det ingen handlings terapi.
| tilfelle 1 | tilfelle 2 | |
| Total Starting Leser | 2215926 | 2129110 |
| Andel Leser Mapping | 98,42% | 98,29% |
| Andel Leser på Target | 99.01% | 97,29% |
| Andel Leser på Target Etter Filter | 97,60% | 95,45% |
| Andel Kan brukes Leser | 94,87% | 91,79% |
| Andel av baser over 250x Dekning | 98,40% | 100% |
| Andel Baser enBove 1000x Dekning | 95,90% | 99,70% |
| Dekning Nedenfor 250x - Amplicon Antall | 8 | 0 |
Tabell 3:. Sekvense Run QC målinger Dette er en oppsummering av de viktigste kjøre statistikk, ikke inkludert bety dekning, som brukes for data gjennomgang for å finne ut om et bibliotek prep prøven har gått QC. Hele prosessen er vellykket hvis alle prosenter er over 90%, men det er mulig, med overføring av SW1 eller UB1 i FPU vasketrinnet eller primer krysstale, for å ha lavere "Percent på Mål 'i størrelsesorden 80 - 90%. Hvis 'Prosent kartlagt' er for lav, ville det indikere en forurensning av bakterier eller andre DNA, som alle prøver bør justeres til menneske. Når noen av disse spesifikasjonene er under 80%, blir prøven flagget for ytterligere gjennomgang for å finne ut hvordan du proceed og forbedre prosessen.
Tabell 4:.. Sak 1 Resultater oppdaget patogene, sykdom forbundet, variant av ukjent betydning (vus), og sannsynligvis godartede exonic varianter over rapporteringskriteriene av 5% allelfrekvens er oppført Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 5:.. Sak 2 Resultater oppdaget patogene, sykdom forbundet, variant av ukjent betydning (vus), og sannsynligvis godartede exonic varianter over rapporteringskriteriene av 5% allelfrekvens er oppført Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende Figur 1: Et eksempel på et amplikon basert SampleSheet.csv. Dette arket formidler til sequencer hva kjemi for å kjøre (i dette tilfellet Amplicon), hva arbeidsflyt (f.eks GenerateFastq), hva Søknad og analyse (f.eks FastqOnly), hvor mange baser (eller leser) til sekvensen (i dette tilfellet 186 bp x 186 bp), og til slutt hvilke prøvene er forbundet med visse indekser (i dette tilfellet to indeksering). De delene som er uthevet i gult kan endres til hva eksperimentator ønsker, men i dette tilfellet laboratoriet bruker disse parametrene. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Discussion
Da de to NGS testene som er beskrevet i dette manuskriptet tilbys klinisk, er det mest viktige praktiske hensyn kvalitetskontroll. Spesielt må nær det tas hensyn til kvaliteten og kvantiteten av ekstrahert DNA. Dette er spesielt viktig for FFPE-prøver som ofte er sterkt degradert med variabel DNA utbytte. En isopropanol utfelling metode ble utviklet for å maksimalisere DNA-utbytte fra FFPE-prøver som kolonne-baserte metoder ble funnet å noen ganger føre til DNA skjær med begrenset elueringsvolumer. Derfor er de fleste av tiden når en prøve gir for lav konsentrasjon eller er for degradert for analysen, er det mest sannsynlig på grunn av vev størrelse, type, eller fiksering og ikke ekstraksjonsprosessen. For blod / benmargsprøver, hvis det er en svikt utvinning, er det vanligvis på grunn av en prøve som hemodilute (dvs. ikke å ha tilstrekkelig antall hvite blod eller tumorceller i den trekningen) eller kjemoterapi ablasjon.
. Nt "> Under validering, bør etableres tidsavgrensninger for aksept av DNA kvalitet og kvantitet Den anbefalte inngang på 100-250 ng er ofte brukt i analysen, men hvis DNA kvaliteten er god, deretter lavere innsatsbeløp kan være vellykket. i tillegg, hvis DNA er av dårlig kvalitet (dvs. mengden av forøkbare DNA er mindre enn 100-250 ng) deretter høyere inngangs mengder kan forbedre kvaliteten av sekvenseringsresultatene (siden mengden av forøkbare DNA vil nå den anbefalte input) . Metrics for DNA kvalitet og kvantitet skal brukes til hver prøve før fremme DNA i biblioteket forberedelse. Disse prøvene i en "gråsone" (se figur 2) skal kjøres på skjønn av laboratorielederen eller en utpekt. Foreløpig best måte å forutsi hvis DNA ikke vil gi gode resultater i løpet av sekvensering er å utføre en qPCR-basert assay som gjør det mulig for kvantifisering og kvalitetsvurdering av inngangs DNA. Denne fremgangsmåten løser bioavailability av forskjellige størrelser fragmenter i prøven, gjennom forsterkning av forskjellige størrelser fragmenter (f.eks, 100 bp, 150 bp, 200 bp og 300 bp) og sammenligning utbytte.For tiden innebærer bibliotek forberedelse et stort antall manuelle trinn hvor en feilsteg på en av flere knutepunkter kan føre til at biblioteket til enten ikke eller for å være av dårlig kvalitet. Den microfluidic gel analyse er den eneste QC skritt å sjekke bibliotek prep problemet før sekvensering. Følgelig, er det flere viktige trinnene hvor ekstra oppmerksomhet kan øke sannsynligheten for en vellykket reaksjon. Det er viktig å sikre korrekt prøven og oligonukleotid bassenget blir brukt for hver prøve. Sikre og riktig opptak at hver prøven inneholder en av 96 unike kombinasjoner av dual-indeksert PCR primerpar reduserer sjansen for et utvalg blanding opp. Dessuten er det viktig å sikre at filterplaten (FPU) drenerer riktig; hvis det ikke renne riktig kan dette føre til at extension-ligering trinn av biblioteket forberedelse til å utføre suboptimalt og føre til dårlig kvalitet sekvenseringsdata. Etter bibliotek QC, er det viktig å sikre at LNB1 perlene er fullstendig resuspendert og at LNB1 / LNA1 oppløsning blandes godt før tilsetning av den til prøvene som konsentrasjonen av denne blandingen blir anvendt for å bestemme molariteten av biblioteket. Til slutt, hvis vulsten elueringstrinn fører til en suboptimal mengde av biblioteket eluering av kulene vil det avta clustering tetthet og muligens føre til biblioteket for å ikke oppnå tilstrekkelig middeldekning. Motsatt vil et overskudd av bibliotek føre til dårligere kvalitet leser. Derfor er det viktig å være konsekvent på perle-baserte normalisering skritt for å sikre optimal samkjøring og clustering av bibliotekene på sequencer.
I tillegg til bibliotek forberedelse, er det avgjørende å validere en bioinformatikk rørledning som vil produsere nøyaktige mutasjon samtaler fra de rå, de-multiplex fastq filer. velge entilpasset løsning kan være tidkrevende som det er mange åpen kildekode og kommersielt tilgjengelige aligners, variant innringere, og NGS programvarepakker som man ville ha til å sile gjennom. Tilpassede algoritmer må være utformet for å trekke ut viktige resultatstatistikk, identifisere unike vendende mutasjoner som unngikk de fleste open source verktøy, og bestemme kopiantall status over hver av de loci. Under valideringsprosessen av en bioinformatikk rørledning, er det viktig å finne de rapporteringstidsavgrensninger for varianter som oppfyller eller overgår både en minimumsdybde på dekning etter kvalitet filtrering (f.eks minimum 250 lesninger) og et minimum allel frekvens (f.eks 4 %). Etter denne en multiplekset amplikon-baserte analysen, er det viktig å bestemme den minste midlere dybde av dekning (f.eks 1,000x) at biblioteket behov for å oppnå å være i stand til å få lavest utfører fragment til den minimumsdybde på lesninger. I tillegg er det multiplekset arten av analysen gjør cause av målet effekter og disse "gjenstander" må bli oppdaget og fullt vetted før lanseringen. En annen viktig begrensning for den angitte analyse er et behov for prøver for å inneholde mer enn 10% tumor for å oppnå den validerte minimum allel frekvens.
Påvisning av lav frekvens, 1%, FLT3 innsett er bevis på at manuell vurdering er fortsatt ønskelig i denne prosessen. Selv med et allel frekvens cut-off på 5%, noen viktige mutasjoner kanskje savnet, og dermed manuell vurdering vil være avgjørende for å fastslå disse variantene. For FLT3-ITDs, er visuell inspeksjon av ekson 14 utføres for alle AML pasienter for å sikre et lavt nivå eller store innsetting / duplisering ikke gå ubemerket hen. I tillegg HER2 ekson 20 innsett som er vanlig ved siden av primer sekvens, trenger manuell inngripen. Til tross for å ha en robust bioinformatikk rørledning, kan noen varianter går oversett noe som er bare natur å ha en hard kuttoff for de fleste statistikken nevnt ovenfor. Bedre bioinformatikk ville være nødvendig for å bidra til å lindre dette problemet, så vil bedre bibliotek forberedelse og / eller sekvensering metoder, fordi det er mer fordelaktig å ha god kvalitet data på enda lavere tidsavgrensninger som inneholder færre gjenstander og falske positiver.
Deteksjon og fortolkning av allel frekvenser kan være vanskelig på grunn av vanskeligheten i tumor prosent bestemmelse og amplifikasjon forspenning av noen regioner av genomet. I tillegg kan allel frekvenser over 50% skal detekteres, som observert i tilfellet 2. Dette tolkes som et tap av heterozygositet (LOH) hendelse, enten på grunn av tap av den normale allelet, som fører til den tilsynelatende økning av mutant leser, en forsterkning av den mutante allel (f.eks, 2-mutant og en normal kopi), eller andre mekanismer. Disse mekanismene kan belyses ved å anvende matrisen komparativ genomisk hybridisering (aCGH 19) og / eller en SNP genotyping array. 20.
De nåværende target berikelse metoder stole på heldags prosedyrer enten ineffektiv hybrid fangst eller multipleksede PCR teknikker som resulterer i behov for mer sekvensering dekning av en enkelt prøve og mer utenfor mål sekvense leser. Tilleggsprogrammer for NGS molekylær onkologi forventes i nær fremtid vil omfatte enklere bibliotek tilberedningsmetoder som kan være fullt automat og være i stand til å behandle prøvene med svært lave mengder innspill DNA (dvs. mindre enn 1 ng) samt prøver med svært degradert DNA. For å møte disse utfordringene, vil de fleste metoder antagelig være PCR baserte, enten som en flertrinns PCR tilnærming eller et massivt-parallell singleplex PCR tilnærming. I tillegg har molekylstrekkoding av de enkelte amplikonene vist seg å dramatisk redusere bakgrunnsstøy sekvensering, og vil muliggjøre testing av prøver med lavere andeler av tumorceller for å oppnå lavere allel frekvenser og bevege seg mot fange circulating tumorceller.
Påvisning av sykdomsassosierte mutasjoner i kreftprøver har vært standard vare i flere tiår. Historisk gener ble ofte testet sekvensielt, ett gen / exon av gangen, med identifikasjon av en mutasjon som fører til den ende av testsekvensen. Ankomsten av NGS har gjort det mulig for en mindre forspent tilnærming til sekvensering av flere gener assosiert med mange kreftformer i parallell som fører til identifisering av flere mutasjoner som er forbundet med neoplasi. Den kliniske nytten av NGS for påvisning av somatiske mutasjoner i kreft er stadig tydeligere. Faktisk NGS-basert analyse av tumorprøver representerer et nytt paradigme som utfordrer tradisjonelle, enkelt gen testing, men den kliniske nytten er veldig klar. Kliniske laboratorier i dag har en spennende mulighet til å gifte seg forsiktig metodevalidering og tolkning av tester med bruk av denne kraftige teknologien.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke hjelp av Daniel Wild for lesing av manuskriptet og bistand i produksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5365 | |
| Genomic DNA Reagents | Agilent Technology | 5067-5366 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technology | 5067-5585 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technology | G2965A | |
| TapeStation Analysis Software | Agilent Technology | A.01.04 or higher | |
| 96-well Tube Storage Racks | Any Vendor | ||
| 15/50 ml Tube Rack | Any Vendor | ||
| 96-well Plate Rack | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 0.5–2.5 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 1–10 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 2–20 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 10–100 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 20–200 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 100–1,000 μl | Any Vendor | ||
| Serological Pipettor | Any Vendor | ||
| Vortexer | Any Vendor | ||
| Ice bucket | Any Vendor | ||
| Microcentrifuge (for tubes and strip tubes) | Any Vendor | ||
| Freezer, -20 °C | Any Vendor | ||
| 4 °C Refrigerator | Any Vendor | ||
| Water or Bead Bath | Any Vendor | ||
| Incubator (37 °C) | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 1 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 5 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 10 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 25 ml | Any Vendor | ||
| Gloves | Any Vendor | ||
| Razor Blades/Scaples | Any Vendor | ||
| KimWipes | Any Vendor | ||
| 15 ml Conical Tube | Any Vendor | ||
| 50 ml Conical Tube | Any Vendor | ||
| Paper Towels | Any Vendor | ||
| 200 proof Ethanol | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
| 25 ml Reservoirs | Any Vendor | ||
| 10 N NaOH | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 1 – 10 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 10 – 100 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 20 – 300 μl | Any Vendor | ||
| Ice Bucket | Any Vendor | ||
| Water Squirt Bottle | Any Vendor | ||
| Alcohol Squirt Bottle | Any Vendor | ||
| Lens Cleaning Paper | Any Vendor | ||
| Plates, 96-well PCR, Semi-Skirted | Any Vendor | ||
| Tube strips, 8-well, 0.2 ml | Any Vendor | ||
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| BioShake IQ or 3000-T elm | Bulldog Bio/Q.Instruments | 1808-0506/ 1808-0517 | |
| DropPlate96 S - LabChipDS | Caliper | 128876 | |
| DropPlate96 D - LabChipDS | Caliper | 132848 | |
| DropSense96 | Caliper (Trinean) | ||
| DropQuant Software | Caliper (Trinean) | ||
| Plate Sealing Film | Denville | B1212-5S | |
| Aluminum Seal Foil | Denville | B1212-6S | |
| Nuclease-Free, Pure Water System | EMD Millipore | ||
| 5424 centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 | Both 15 ml tube and plate rotators, preferably a centrifuge that can go up to 2,500 x g. |
| Safe-Lock Tube 1.5 ml, Natural | Eppendorf | 22431021 | |
| 5 ml Tube, DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108310 | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 022620645 | Any plate rotator centrifuge will work |
| Hybex Microsample Incubator | Fisher Scientific | 1057-30-0 | |
| Hybex 0.2 ml Tube Block | Fisher Scientific | 1057-31-0 | |
| TruSeq Amplicon – Cancer Panel | Illumina | FC-130-1008 | 96 reactions |
| TruSeq Custom Amplicon | Illumina | PE-940-1011 | 96 reactions |
| TruSeq Custom Amplicon Index Kit | Illumina | FC-130-1003 | 96 Indices, 384 Samples |
| MiSeq Reagent Kit v3, 500 Cycles | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Kit v2, 300 Cycles | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles | Illumina | MS-102-2003 | |
| Experiment Manager | Illumina | 1.3 or higher | |
| MiSeq Reporter | Illumina | 2.0 or higher | |
| Sequencing Analysis Viewer | Illumina | 1.8 or higher | |
| TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit | Illumina | FC-130-1007 | |
| MiSeq v2 | Illumina | SY-410-1003 | |
| TruSeq Custom Amplicon Filter Plate | Illumina | FC-130-1006 | |
| Index Adapter Replacement Caps | Illumina | 11294657 | |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit 0.5 ml Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | |
| DynaMa6-96 Magnetic Stand, Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | |
| GeneAmp PCR System 9700 (gold/silver block) | Life Technologies | N8050200 | |
| Gentra Puregene Blood Kit | Qiagen | 158489 | |
| Deparaffinization Solution (16 ml) | Qiagen | 19093 | |
| Buffer ATL (4 x 50ml) | Qiagen | 939011 | |
| Protein Precipitation Solution (50 ml) | Qiagen | 158910 | |
| DNA Hydration Solution (100 ml) | Qiagen | 158914 | |
| Glycogen Solution (500 μl) | Qiagen | 158930 | |
| Qiagen Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| Rnase (5 ml) | Qiagen | 158924 | |
| Nuclease-Free Water (10 x 50 ml) | Qiagen | 129114 | |
| Pestles | USA Scientific | 1415-5390 | |
| TipOne RPT 10 µl elongated filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips). | USA Scientific | 1180-3810 | |
| TipOne RPT 100 µl natural, beveled filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1840 | |
| TipOne RPT 200 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-8810 | |
| TipOne RPT 20 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1810 | |
| TipOne RPT 1,000 μl natural, graduated XL filter pipet tips in | USA Scientific | 1182-1830 |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Campbell, P. J., et al. The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).
- Frampton, G. M., et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).
- Patel, J. P., et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).
- Forbes, S. A., et al. COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).
- Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies. Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).
- Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use. Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).
- Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. Molecular genetics in acute myeloid leukemia. Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).
- Subramanian, J., Govindan, R. Lung cancer in "Never-smokers": a unique entity. Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).
- Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma. Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).
- Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).
- Gandhi, L., et al. Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors. J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).
- Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients. Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).
- Mazières, J., et al. Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives. J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).
- Robinson, J. T., et al.
- Forbes, S. A., et al. COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).
- Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets. Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).
- Haraksingh, R. R., et al. Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms. PLoS ONE. 6 (11), e27859 (2011).
- de Leeuw, N., et al. SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control. Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).
