Introduction
Næste generations sekventering (NGS) af kliniske onkologi prøver er blevet mere bredt tilgængelige i løbet af de sidste mange år som voksende videnskabelige litteratur peger på betydningen af at identificere målsøgende genetiske ændringer og prædiktive / prognostiske molekylære markører. Multi-gen panel analyser og hele exome sekventering studier i både epitel 1,2 og hæmatologisk 3 maligniteter har størknet begrebet tumor heterogenitet og klonal evolution som sygdommen skrider frem og tilbagefald. Derudover, i modsætning til konkurrerende teknologier såsom polymerasekædereaktion (PCR) eller Sanger-sekventering, kan NGS registrere de fleste genomiske ændringer i alle klinisk relevante cancer gener i en enkelt assay 4.
Center for Personlig Diagnostics oprindeligt lanceret med to kliniske NGS paneler, en brugerdefineret Hæmatologisk Panel (Hem-NGS Panel) og en off-the-shelf Cancer Panel til FFPE prøver (Solid-NGS Panel) (se Indholdet for hæm-NGS Panel blev afledt fra flere kilder, men centrerer omkring 16 gener muteret i akut myeloid leukæmi (AML), som tidligere beskrevet som demonstrerer en høj grad af klinisk anvendelighed 5. Den Solid-NGS Panel fremstilles kommercielt med de målrettede regioner baseret på almindeligt muterede gener i cancer som rapporteret i Katalog over somatiske mutationer i Cancer (COSMIC) database 6. Flere vigtige skridt karakteriserer den overordnede arbejdsgang til kliniske NGS. Efter klinikeren beordrer testen, en patolog bestemmer tilstrækkeligheden af prøven efter analyse for tumor procent og prøvevolumen. I vores institution, kræver vi mindst 10% tumor på grund af baggrunden sekventering fejlprocent ( "støj") af teknologien og effektiviteten af den målrettede tilgang. Hvis vævet er tilstrækkelig til test, ekstraheres genomisk DNA. Dette DNA underkastes derefter flere reguleringskvalitet (QC) trin. Hvis DNA passerer QC, er en amplicon bibliotek genereret og sekventeret. De resulterende data analyseres gennem en in-house bioinformatik pipeline. Efter bioinformatik analyse, er varianter manuelt revideret og fortolkes for patogenicitet før inkorporering i en klinisk rapport. Nedenfor beskriver vi to sager, der gik gennem denne strenge arbejdsgang og i sidste ende førte til ændringer i den kliniske ledelse. Case 1 - akut myeloid leukæmi En knoglemarvsbiopsi fra patient A var diagnostisk for AML, uden modning. Cytogenetiske undersøgelser blev sendt på knoglemarven prøve og viste en normal kvindelig karyotype. Der var 95% cirkulerende blaster tilstedeværende, så en perifer eksemplar blod blev sendt til personlig diagnostisk test på Hem-NGS Panel. Akut myeloid leukæmi (AML) er en hæmatologisk malignitet af den myeloide afstamning af hvide blodlegemer. påvisningenaf genmutationer i AML er blevet stadig vigtigere for prognose og behandling, med tilbagevendende genmutationer anerkendt som vigtige i patogenese og prognose 7. Mutationer i NPM1 og CEBPA har været forbundet med en positiv prognostisk risiko, mens interne tandem gentagelser (ITD) i FLT3 er blevet associeret med en mindre gunstig resultat 8. En voksende mængde beviser understøtter en patogen rolle for disse og andre mutationer i AML 9. Case 2 - Lung Adenocarcinom En biopsi af en venstre supraclavicular masse fra patient B demonstrerede pulmonal adenocarcinom. Biopsi materiale fra formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) lymfeknude masse blev sendt til genomisk test (Solid-NGS panel) som ruller / krøller med mere end 50% tumor, at identificere, om en mutation var til stede for målrettet terapeutisk intervention. Lung CancER er den førende årsag til cancerrelateret mortalitet i USA og er opdelt i to hovedtyper, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet lungecancer (SCLC). NSCLC kan yderligere defineres som enten adenocarcinom eller pladecellekarcinom, baseret på histologi af læsionen. Lung adenocarcinom er den mest almindelige undertype af lungekræft, set i både rygere og ikke-rygere, og er den mest almindelige form for lungekræft for ikke-rygere 10. Molekylære studier af lunge adenocarcinomer har identificeret mutation i multiple onkogener 11. De mest almindelige driver mutationer identificeret i rygere er mutationer i KRAS og BRAF. De mest almindelige mutationer i ikke-rygere er mutationer i EGFR, og rearrangementer involverer generne ALK, RET og ROS1. Lungetumorer er blevet beskrevet med en i-ramme exon 20 insertion i genet ERBB2 (HER2 / neu). Den mest almindelige abnormitet i HER2 / neu er en forstærkning af dette locus i brystcancer, for hvilke en målrettet terapi er tilgængelig (trastuzumab: et humaniseret monoklonalt antistof mod HER2 / neu). HER2 / neu exon 20 indsætning, der er observeret i 2 - 4% af lunge adenocarcimomas 12 har vist delvist svar på kombinationsbehandling med HER2 / neu og mTOR-hæmmere (neratinib og temsirolimus henholdsvis) 13. 
Figur 1:. Liste over Gener Dækket i Panels Bibliotek forberedelse udføres ved hjælp af enten den brugerdefinerede Hæmatologisk Panel (Hem-NGS panel) af 33 gener eller off-the-shelf Amplikon Cancer Panel (Solid-NGS) af 47 gener. Ikke alle de gener eller exons er dækket fuldt ud, da nogle amplikoner kun kan dække visse hotspots. Klik her for at se en større version af dette tal. </ A>
Protocol
Denne protokol omfatter de vigtigste trin i to validerede laboratorie- udviklede test for den genomiske profilering af fast og flydende tumorer hhv. Afprøvningen udføres i laboratoriet sker i overensstemmelse med kravene i det kliniske laboratorium Improvement Ændringer (CLIA) af 1988.
1. DNA ekstraktion fra perifert blod eller knoglemarv
- Undersøg, hvor meget blod eller knoglemarv til at tage baseret på tabel 1.
| Prøve / WBC | Beløb, der skal behandles som 1 ml blod |
| Knoglemarv | 250 pi |
| Blood WBC 12.000 - 50.000 | 1 ml |
| Blood WBC 50.000 - 100.000 | 500 pi |
| Blood WBC 100.000 - 200.000 | 200 pi </ Td> |
| Blood WBC> 200.000 | 100 pi |
| * For Blood WBC <12.000, tage 2 ml blod | |
Tabel 1:. Blood / Bone Marrow bind til Brug kort Da hvide blodlegemer vil variere fra prøve til prøve, er det vanskeligt at angive et specifikt volumen af blod til brug. Derfor skal mængden af blod til brug til assayet bestemmes ved at se på den hvide blodlegemer (WBC) før analysen startes. Selvom mindre blod anvendes, bør det stadig behandles, som om de 1 ml siden volumen af blod anvendes reduceres, fordi antallet af tilstedeværende celler er større end normalt.
- Følg det kommercielt tilgængelige kit protokol til isolering af genomisk DNA.
2. DNA ekstraktion fra formalin-fikseret Paraffin-embedded (FFPE) Tissue
- Baseret påtumor region patologen cirkel på H & E slide, linje op ufarvede dias med guiden H & E slide og skitsere et lignende område for udvinding. For makro-dissektion, proces kun ét eksemplar / patientens sæt dias ad gangen.
- Varm glider på en 45 ° C varme blok til lidt smelte paraffin. Skrab forsigtigt vævet inden for de linjer, der er markeret på dias, ved hjælp af en ny skalpel for hver prøve, der skal udvindes. Placer voks afskrab i det korrekt mærkede 1,5 ml rør. Vær forsigtig, fordi den skrabede voks er meget elektrostatiske og kan springe ud af røret.
- Tilføj 320 ul Afparaffinering løsning for hver fem til seks 5 um sektioner (25-30 um i alt). For eksempel, hvis et rør indeholdende 3 dele af en 10 um roll / krøller vil blive behandlet, så brug 320 pi, men hvis opnåedes 5 sektioner på samme tykkelse derefter bruge 640 pi.
- Vortex kraftigt i mindst 10 sek og udfører aquick centrifugering i en mikrocentrifuge til fjernelse af væv / voks fra siderne og hætte og ind i opløsningen. Inkuber ved 56 ° C i 3 minutter, og derefter inkuberes ved stuetemperatur i 5 -. 10 min.
- Efter RT inkubation tilsættes 180 pi ATL buffer for hver 320 pi Afparaffinering tilsat. Hakke vævet ti gange med en steril mini-pistil under anvendelse af en ny støder i hver prøve. Sikre mod væv fastgjort til støderen, som det kan være meget klæbrig. Vortex suspensionen kraftigt i 3 sek, centrifugeres ved maksimal hastighed i 1 min.
- Tilsæt 10 pi proteinase K til den nedre klar fase. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned for at sikre vævet resuspenderes. Undlad at slynge. Inkuber ved 56 ° C natten over under omrystning ved 400 - 500 omdrejninger.
- Den næste morgen, kontrollere, om vævet er helt opløst (dette er sket, hvis den nederste opløsningen er klar). Hvis den nederste opløsningen ikke er klar, så vortex kraftigt i 3 sek og der centrifugeres ved maksimal hastighed for 1 min. Tilføje en ekstra 5 - 10 pi proteinase K og inkuberes ved 56 ° C i yderligere 30 - 60 min.
- Inkuber ved 90 ° C i 1 time med til at vende formaldehyd tværbinding. Tillad prøver at afkøle til stuetemperatur i 5 - 10 min og derefter kortvarigt centrifugeres hvert rør for at konsolidere væsken.
- Overfør det nedre klar fase i et mærket 1,5 ml rør. Hvis der er flere rør fra de samme patientprøve (såsom tilfældet, hvis flere ruller bliver brugt), rekombinere de nederste faser i et rør på dette tidspunkt. Bemærk: Overførsel af små mængder af Afparaffinering Solution bør ikke forstyrre rensning procedure, men der er en risiko, hvis en stor mængde overføres.
- Tilsæt 2 pi RNase A opløsning. Vortex forsigtigt eller invertsukker 25 gange og hurtig tur i en mikrocentrifuge. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilsæt 200 pi Protein Precipitation Solution. Hvis laver en eller to ruller, bruge 200 pi. Hvis laver tre rolls på én gang, og derefter bruge 400 pi. Vortex kraftigt ved høj hastighed i 30 sek til ensartet blande lysis buffere. Der inkuberes på is i 5 min eller prøverne kan forblive på is i op til en time.
- Centrifuger ved 5000 xg i 5 min. Det udfældede protein bør danne en tæt, hvid pellet. Hæld supernatanten til et mærket 1,5 ml rør, og derefter inkubere prøverne på is i mindst 3 min. Centrifuger ved 5.000 xg i 3 min.
- Tilsæt 200 pi 2-propanol (isopropanol) til hver 180 pi Buffer ATL tilsat tidligere til et mærket 1,5 ml rør (det kan være nødvendigt at anvende en 2 ml rør). For eksempel, hvis gør tre ruller tilsættes 600 pi isopropanol. Tilsæt 1 pi glycogen for hver 180 pi Buffer ATL tilsat tidligere til isopropanol og vend røret flere gange for at blande.
- Derefter tilsættes forsigtigt supernatanten fra Protein Precipitation skridt ind i Isopropanol blandingen. Bland røret ved at vende forsigtigt mindst 50 gange.
- Centrifuger ved maksimal spBehov for 3 min. DNA'et vil være synlige som små hvide pellet i bunden af røret.
- Hæld eller aspireres supernatanten i det relevante affald rør. Hold en separat 1,5 ml affald rør til hver prøve i tilfælde pillen kommer løsnes, så det ikke går tabt eller blandet med spild af andre prøver. Dræn røret på en papirserviet og sikre størstedelen af Isopropanol er fjernet.
- Der tilsættes 300 pi frisk gjort 70% ethanol. Vend røret forsigtigt flere gange for at vaske pelleten. Prøv at sikre pillen kommer løsnede at sikre en mere grundig rengøring.
- Der centrifugeres ved maksimal hastighed i 5 minutter. og derefter forsigtigt fjerne ethanol. Pillen kan være løs, så hæld eller aspirere langsomt og se pellet. Det overskydende ethanol fra indersiden af røret, uden at røre pelleten. Lad prøverne lufttørre 5 - 15 min, være omhyggelig med at ikke forbi tørre prøven.
- Tilføj mellem 25-100 pi DNA Hydration Solution til each prøve baseret på størrelsen af DNA pellet og grundbeløbet for væv. Vortex rørene kraftigt og kortvarigt spinde i en mikrocentrifuge. Der inkuberes i 1 time ved 65 ° C til fuldstændig rehydrere DNA'et.
3. Genomisk DNA Kvalitetskontrol
Bemærk: Der er tre uafhængige trin til DNA kvalitetskontrol (QC). Se tabel 2 for yderligere forklaring på, hvorfor hver QC trin udføres.
| Instrument | Resultat | Tegn | Ideel Range |
| DropSense96 | A260 / A230 | Identifikation af kemiske forureninger (f.eks ethanol) | 1,50-2,2 |
| DropSense96 | A260 / A280 | Identifikation af proteinkontaminanter | 1,60-2,2 |
| DropSense96 | Koncentration | DNA kvantificering | > 1 ng / pl |
| TapeStation | DNA Smør | Bestemmelse af DNA integritet (f.eks nedbrydning / fragmentering af ekstraheret DNA) | 50%> 1.000 bp |
| qubit 2.0 | Koncentration | Mere præcis DNA kvantificering | > 1 ng / pl |
Tabel 2:. DNA QC Forventede resultater Alle disse værdier er taget højde før du kører tillader en prøve for at gå videre til biblioteket forberedelsesfasen.
- Efter fabrikantens protokol, køre 2 pi af det ekstraherede DNA på et fluorometer til opnåelse arbejdskoncentrationen (ng / pl) af prøven.
- Kør 1 - 2 pi af hver prøve på en UV / VIS spektrofotometer at kontrollere kvaliteten af prøven (A260 / A230 og A260 / A280 rotteios) ifølge producentens instruktioner.
- For FFPE prøver: efter fabrikantens anvisninger, køre 1 pi af hver prøve på en mikrofluid gelelektroforese system til at vurdere nedbrydning / fragmentering af DNA'et. Se figur 2 for eksempler.
Figur 2:. Genomisk DNA QC Gel Eksempel Den grønne linie over de lavere bånd er at angive lavere markør. Den ekstra-i rød linje er at angive ca. 1000 bp. Lane A2 repræsenterer fuldt intakt DNA, som man kunne forvente fra frisk tis sue (f.eks perifert blod eller knoglemarv). Lanes B1, C1, D1, B2, C2, E2 er eksempler på gode, intakt FFPE DNA. DNA i lane F2 synes at være intakt, men ved for lav en koncentration. DNA'et i bane G2 er forringet eller fragmenteret og vil ikke fungere i assayet. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 repræsenterer DNA, som falder i den "grå zone", hvilket betyder, at analysen kunne fungere godt, men nogle af de DNA kunne også beskadiget eller tværbundet og derfor vil det ikke klare sig godt i analysen. Klik her for at se et større version af denne figur.
4. Amplikon Bibliotek Forberedelse
- Hybridisering af Oligo Pool og Udvidelse-Ligation af bundet Oligoer
- I Pre-PCR rum, tilføjer den nødvendige mængde af Low EDTA TE, 5 pi af panelets Oligo Tube (f.eks Solid-NGS Panel eller Hem-NGS Panel), og 100-250 ng genomisk DNA til hver tilsvarende godt i en semi-skørt 96 brønd-plade mærket som hybridiseringen (Hyb) plade.
- Tilsæt 40 pi Oligo Hybridisering til sekventering Reagens 1 (OHS1) til hver prøve i HYB plade. Forsigtigt pipette op og ned mindst 5 - 6 gange for at blande. Skift tips efter hver kolonne for at undgåkrydskontaminering.
- Forsegl HYB plade med selvklæbende aluminiumsfolie og centrifuger ved 1000 xg i 30 sek.
- Inkubér HYB plade i den forvarmede hybridisering inkubator ved 95 ° C i 1 min. Indstil temperaturen af hybridiseringen inkubator til 40 ° C. Fortsæt inkubation så længe det tager inkubatoren at falde fra 95 ° C til 40 ° C (~ 90 min). Bemærk: Denne gradvis afkøling er kritisk for korrekt hybridisering.
- Under den sidste 15-20 min af hybridisering inkubation forvask Filter Plate Unit (FPU). Forbered kun brøndene, der skal anvendes i den nuværende assay, dvs. udelukkende anvendes frisk / ubrugte brønde i en tidligere åbnet filterplade, men aldrig genbruge brønde der er blevet anvendt. Bemærk: Dette bør være klart baseret på Kit Antal på filterpladen, angivelsen på filterpladen, og tætningsmidlet anvendes hen over pladen.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, tilsættes 45 ul Stringent Wash 1 (SW1) til hver brønd.
- Hvis resterende væske eksisterer, rotere FPU 180 ° og gentag centrifugen skridt igen i yderligere 3 minutter. Hvis den resterende væske spinder gennem den anden gang, derefter gå videre til næste trin, hvis ikke så kan der være en defekt i filteret plade og den aktuelle plade skal udskiftes.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, tilsættes 45 ul Stringent Wash 1 (SW1) til hver brønd.
- Når hybridisering inkubator er afkølet til 40 ° C, centrifugeres pladen ved 1.000 xg i mindst 30 sekunder ved 20 ° C for at opsamle kondensation. Overfør hele mængden af hver prøve fra HYB pladen på midten af de tilsvarende forvaskede brønde i FPU. Skift tips efter hver kolonne for at undgå krydskontaminering. Dæk FPU og der centrifugeres ved 2.250 xg i 3 min ved 20 ° C.
- Tilføj 45 pi SW1 og der centrifugeres ved 2.250 xg i 3 min ved 20 ° C. Gentag for i alt to vaske. Drej FPU 180 ° og centrifuger igen ved 2250 xg i 3 min helt at fjerne alle SW1.
- Forstiller FPU. Kassér al gennemløbet (indeholdende formamid) i den korrekte affaldsbeholder. Saml FPU bruge en anden MIDI Waste Collection Plate. Tilføj 45 pi Universal buffer 1 (UB1) til hver prøvebrønd og der centrifugeres ved 2.250 xg i 3 min ved 20 ° C. ADVARSEL: Indeholder formamid.
- Tilføj 45 pi Extension Ligation Mix 3 (ELM3) til hver prøve godt på FPU pladen og pipette op og ned 3 gange for at blande. Bemærk: Extension-æggelederne reaktion finder sted på filteret plade membran.
- Forsegl FPU pladen med den selvklæbende aluminiumfolie og inkuberes hele FPU forsamling i en forvarmet 37 ° C inkubator i 45 min.
- Indeksering og PCR-amplifikation
- Alikvot indekserne bliver brugt til de tilsvarende brønde i den indekserede Amplification Plspiste (IAP) ved at arrangere primerne i indekset Plate Fikstur, arrangeret på følgende måde: i5 primer rør (hvide hætter, klar opløsning) lodret, på linje med rækkerne A til H, i7 primer rør (orange hætter, gul opløsning) horisontalt , på linje med søjler 1 til 12. Brug af en p10 multi-kanal pipette, tilsættes 4 pi af i7 primere (gul opløsning) til hver række af IAP og tilsæt 4 ul i5 primere (klar opløsning) til hver kolonne i IAP.
- På is eller en køleblok, forberede PCR Master Mix ved at tilføje 0,5 pi DNA-polymerase 1 (TDP1) til 25 pi PCR Master Mix 2 (PMM2) per prøve. Inverter, hurtigt vortex, og kortvarigt centrifugeres PCR Master Mix at blande.
- Tilføj 22 pi af PCR Master Mix til hver brønd af IAP og pipette op og ned 3 gange for at blande. Skift tips mellem brønde. Hold IAP ved 4 ° C.
- Efter 45 min Extension-ligeringsreaktion (trin 4.1.10), fjern FPU fra inkubatoren og forsigtigt fjerne aluminum folieforsegling. Dæk med låg og centrifugeres ved 2.250 xg i 3 min ved 20 ° C.
- Tilsæt 25 pi 50 mM NaOH til hver prøvebrønd på FPU. Pipettere op og ned mindst 6 gange; sikre pipettespidserne kommer i kontakt med membranen. Skift tips efter hver kolonne. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Overfør prøver elueres fra FPU til IAP som følger:
- Ved hjælp af en p100 multi-kanal pipette sat til 20 pi, pipette NaOH på FPU pladen op og ned mindst 6 gange. Tiltes FPU pladen for at sikre fuldstændig aspiration fra pladen.
- Overfør 20 pi fra FPU til den tilsvarende kolonne i IAP. Forsigtigt pipette op og ned mindst seks gange til grundigt kombinere DNA med PCR Master Mix. Forsegl IAP med selvklæbende film, og der centrifugeres ved 1.000 xg i 1 min ved 20 ° C.
- Bring PCR Plate i Post-PCR Room og indlæse pladen på en termisk cycler. Kør PCR program bestående af en varme denatureringstrin ved 95 ° C i 3 min; efterfulgt af 25 cykler af 95 ° C i 30 sek, 62 ° C i 30 sek, 72 ° C i 60 sek; efterfulgt af en endelig udvidelse ved 72 ° C i 5 minutter; efterbehandling med et hold ved 10 ° C. Hvis ikke fortsættes til næste trin efter afslutningen af PCR, kan pladen forblive på termiske cykler natten over, eller det kan opbevares ved 2 til 8 ° C i op til to dage.
- PCR Oprensning og perle-Based Normalisering
- Fjern de magnetiske rensning perler, Elution Buffer (EBT), og gel-elektroforese reagenser fra 4 ° C køleskab og sted ved stuetemperatur i mindst 20 min før det næste trin.
- Når PCR er udført, centrifugeres ved 1.000 xg i 1 min ved 20 ° C indsamle kondens. Overfør 1 pi af hver PCR-reaktion for at strippe slanger / plade brønde indeholdende 4 pi vand til at fortynde prøverne 1/5. Pipettere op og ned for at blande.
- Tilsæt 2 pi affortyndet PCRed prøver til 2 pi microfluidic-gel buffer. Forsegl strimler / plade. Ryst ved 1800 rpm i mindst 30 sekunder og centrifugeres ved 1.000 xg i 30 sek. Efter fabrikantens protokol, køre blandingen på en mikrofluid gel at vurdere, om biblioteket præparat gav en acceptabel bibliotek (se figur 3).
- Vortex de magnetiske rensning perler, indtil de er godt suspenderet og farven forekommer homogen. Tilføj 45 pi af perlerne til hver prøve.
- Forsegle skiltet med klar klæbende film og ryst pladen ved 1800 rpm i 2 min. Der inkuberes ved stuetemperatur uden omrystning i 10 min.
- Pladen anbringes på en magnetisk stativ. Når supernatanten har ryddet, forsigtigt fjerne og kassere supernatanten. Hvis nogen perler uforvarende bliver suget ind i tips, dispensere perlerne tilbage til pladen, og lad pladen hvile på magnet for 2 min og bekræfter, at supernatanten er ryddet.
- Med pladen på than magnetisk stativ, der tilsættes 200 pi frisk fremstillet 80% ethanol til hver prøvebrønd. Flytte pladen frem og tilbage et par gange. Inkubér pladen på den magnetiske stå i 30 sek. Fjern og kassér supernatanten forsigtigt. Gentag for i alt to vaske.
- Fjerne det overskydende ethanol ved kort centrifugering af pladen ved 1.000 xg til drev ned nogen ethanol på rørsiderne, placere pladen tilbage på den magnetiske stativ, og ved anvendelse af et p10 multi-kanal pipette sat til 10 pi for at fjerne ethanolen. Give perlerne lufttørre 5 - 8 min.
- Ved hjælp af en p100 multi-kanal pipette, tilsættes 30 pi EBT til hver brønd. Pipettere op og ned et par gange for at sikre perlerne kommer fra siden af røret. Forsegle skiltet med klar klæbende film og ryst pladen ved 1800 rpm i 2 min.
- Der inkuberes ved stuetemperatur uden omrystning i 3 min. Hvis der er prøver, hvori perlerne ikke er fuldstændigt resuspenderes forsigtigt pipetteres op og ned for at resuspendere perlerne.
- Pladen anbringes på en magnetisk stativ. Ved hjælp af en P100 multi-kanal pipette 20 pi af supernatanten til et helt nyt plade kaldet biblioteket Normalisering Plate (LNP). Overfør de resterende ~ 10 pi af de enkelte sekventering biblioteker til en separat plade kaldet Resterende Renset-Up Bibliotek Plate (RCLP). Gemme denne plade sammen med den endelige bibliotek prep, da den kan anvendes som en reserve til en anden sekventering køre, hvis det er nødvendigt. Hvis ikke fortsættes til næste trin, kan LNP og RCLP opbevares ved -15 til -25 ° C.
- Energisk vortexes og resuspender Bibliotek Normalisering Beads 1 (LNB 1). Det er afgørende for helt at opblande LNB 1 bead pellet i bunden af røret. Forbered Normalisering Mix, ved at blande 8 ul LNB 1 med 44 pi Bibliotek Normalisering Tilsætningsstoffer 1 (LNA1) per prøve. Energisk vortexes Normalisering Mix for 10 - 20 sek.
ADVARSEL: LNA1 indeholder formamid. - Med intermitterende inversion ennd vortexing af Normalisering Mix, tilsættes 45 ul til hver prøve af LNP. Forsegle skiltet med klar klæbende film og ryst pladen ved 1800 rpm i 30 min. Denne 30 minutters inkubation er kritisk for korrekt bibliotek normalisering som inkuberinger af større eller mindre end 30 min kan påvirke bibliotek repræsentation og klynge tæthed.
- Under 30 min inkubation forberede reagenser til sekventering ved optøning reagenskassetten og Hyb Buffer (HT1) [ADVARSEL: Begge indeholder formamid]. Derudover får is i et senere trin og sikre en varmeblok egnet til 1,5 ml centrifugerør er indstillet til 96 ° C.
- Når 30 min blandingstrinnet er fuldført, bringes LNP på en magnetisk stativ. Når supernatanten har ryddet, så brug en multi-kanal pipette til forsigtigt at fjerne og kassere supernatanten i den relevante affaldsbeholder.
- Fjern LNP fra den magnetiske stå og vaske perlerne med biblioteket Normalisering Wash 1 (LNW1) som følger:
- Tilføj 45pi LNW1 til hver prøvebrønd.
ADVARSEL: Indeholder formamid. Forsegle skiltet med klar klæbende film og ryst pladen ved 1800 rpm i 5 min. Gentag for i alt to vaske. Sørg for at fjerne alle LNW1 efter anden vask.
- Tilføj 45pi LNW1 til hver prøvebrønd.
- Fjern LNP fra den magnetiske stativ og ved hjælp af en multi-kanal pipette, tilsættes 30 pi 0,1 N NaOH (mindre end en uge gammel) til hver brønd til eluering af prøven. Forsegle skiltet med klar klæbende film og ryst pladen ved 1800 rpm i 5 min.
- I løbet af 5 min eluering, tilsættes 30 ul Bibliotek Normalisering Opbevaring buffer 1 (LNS1) til hver brønd for at blive anvendt i en ny plade med navnet opbevaring Plate (SVP).
- Placer LNP på den magnetiske stativ. Når supernatanten har ryddet, overføre 30 pi eluering til LNS1 i stabilitets- og vækstpagten. Skift tips mellem prøver at undgå krydskontaminering.
- Forsegle skiltet med selvklæbende film, og der centrifugeres ved 1.000 xg i mindst 30 sek.
- Tilsæt 51 l af hver prøve, der skal sekventeres til en mærket Pooled Amplikon Library (PAL) 1,5 ml rør. Vortex PAL at blande og kortvarigt spin ned i en mikrocentrifuge.
- Afhængigt af hvad sekventering kemi, der anvendes (V2 eller V3) tilsættes 4 - 10 pi af PAL til 590 - 596 pi HT1. Almindeligvis tilsættes 5,8 pi PAL til 595 pi HT1 for V2 kemi og 8,5 pi PAL til 592 pi HT1 for V3 kemi. Mærk dette rør som Fortyndet Amplikon Library (DAL) rør.
- Vortex DAL og kortvarigt spin ned i en mikrocentrifuge. Inkubér DAL ved 96 ° C i 2 min. Vend DAL røret 3 gange og sætte DAL på is i mindst 5 min, mens de forbereder den sequencer til sekventering. Efter 5 min, DAL er klar til at blive lastet.
- Hvis færdig med stabilitets- og vækstpagten, forsegle pladen med selvklæbende aluminiumsfolie film og mærke det med dato og plade-id. Opbevar den forseglede SVP og PAL ved -15 til -25 ° C.
Figur 3:. Bibliotek Prep QC Gel Eksempel Den grønne linie over de lavere bånd er at angive lavere markør og den lilla linje over den øvre bånd er at angive højere markør. Alt fungerede godt for baner H1, A2, B2, C2, E2, og G2. Biblioteket prep virkede ikke optimalt, for banerne D2, F2, og H2, men resultaterne vil stadig opnås de måske bare ikke har tilstrækkelig dækning. For A3, biblioteket prep knap arbejdede og sandsynligvis denne DNA-prøve var ikke tilstrækkelig til analysen. De nedre bånd over den nederste markering er de ubrugte primere, fordi portionen taget direkte fra PCRed godt. NTC prøve bør kun have den ubrugte primerbånd, og intet andet. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Sekventering
- Sikre en korrekt SampleSheet.csv er foretaget for turen. Se Supplerende Figur 1 for et eksempel.
- Skyl og tør flowcellen og tilsættes 600 pi af DAL til den optøede reagenskassetten.
- Forbered sequencer for sekventering ved at følge vejledningen på skærmen.
6. Data Analysis
- Udfør bioinformatik pipeline. Udnyt in-house, custom designet bioinformatik rørledning til at identificere mutationer, indsættelser, sletninger og amplificeringer 18.
- Efter rørledningen er færdig, skal du kontrollere logfilerne for fejl / advarsel, som enhver væsentlig fejl / advarsler støtte i QC af rørledningen behandling.
- Analyser køre statistik (Tabel 3) for at sikre den sekventeret biblioteket har passeret laboratoriet bestemt QC målinger (figur 4). Manuelt gennemgå hver variant ved at se .bam filer i en genomisk data viewer (f.eks Integrativ Genomics Vivandkande 16 (IGV)).
BEMÆRK: Kun varianter inden den validerede allel-frekvensområdet og over den minimale dybde dækning efter kvalitet filtrering er rapporteret (ved hjælp af Human Genome Variation Societys (lastvogne) nomenklatur). For den endelige rapportering, blev hver exon variant kategoriseret i: patogene, sandsynligvis sygdom forbundet, variant af ukendt signifikans (VUS), sandsynligvis godartet, og godartet. Alle varianter over de rapporterende kriterier af 5% allel frekvens, undtagen de anses godartede varianter og synonyme ændringer, rapporteret.
Figur 4. Oversigt over Kvalitetskontrol Steps for NGS. Kvalitetskontrol af hvert trin i processen er nødvendig for at sikre sekventering vil give resultater sådanne, at før og efter sekventering metrikker betragtes. Relevante model behandling er afgørende for høj kvalitet DNA. Blod ogknoglemarv i uhensigtsmæssige fikseringsmidler kan give kvalitet DNA lav. Upassende fiksering af solide tumorer prøver kan nedbryde DNA (fx fiksering i B5). DNA kvalitet bør vurderes for protein og RNA forurening med spektrofotometriske midler, og nøjagtigt vurderet for mængden og integritet DNA. Sekventeringsresultaterne metrics skal bestemmes empirisk i sekventering laboratorium og følges for hver sekventeringsreaktionen og hver prøve. Forud for indberetning af sekventering resultater for hver prøve skal vurderes for dækning, dybde og tilstrækkelige præstation af positive og negative kontroller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Case 1 - Hem-NGS Panel
Den DNA ekstraheret fra leukæmiske perifert blod var af tilstrækkelig kvalitet og mængde (176 ng / pl) for Hem-NGS Panel. Den samlede gennemsnitlige dybde af dækningen var 4,933x (over den mindste gennemsnitlige dybde af dækning af 1.000 x). Yderligere run statistikker er i tabel 3. Af de 8 regioner under 250X dækning, 3 var på grund af forkert trimning af primerne (dvs. blev primersekvensen ikke ordentligt fjernet på grund af sekventeringsfejl), 1 var en kendt artefakt af assayet, og de andre 4 var delvise regioner af exoner af forskellige gener uden indberetningspligtige varianter. Selvom vores kliniske protokol kun omfatter rapportering varianter er omfattet af mindst 250 læser, læser alle data med mindst 100 importeres til databasen til gennemgang.
Databehandling from den bioinformatik pipeline opdaget tre anmeldelsespligtige, sygdom-associerede mutationer; en missense mutation i FLT3, en missense mutation i IDH2, og et rammeskift mutation i NPM1. De exoniske varianter med deres allelfrekvenserne er beskrevet i tabel 4. En fælles mutation i FLT3 er FLT3 Intern tandem dobbeltarbejde (ITD), som ikke automatisk kaldt af vores pipeline og kræver en visuel inspektion af exon 14. Visuel inspektion af exon 14 af FLT3 viste ingen indsættelse eller dobbeltarbejde i de indsendte prøve. Den FLT3 I836del var på 1% allel frekvens og er ikke medtaget i den endelige rapport, fordi den faldt under den validerede minimum allel frekvens på 5%. Denne mutation er ikke på samme DNA-molekyle som FLT3 D835Y ændring (dvs. observeret i samme amplicon region, men ikke i "cis" i nogen af sekventering læser), og det blev kun observeret ved manuel gennemgang af .bam files, når verificere p.D835Y forandring. De lavere allel frekvenser af de to FLT3 mutationer antyder disse mutationer kan repræsentere heterogenitet og / eller klonal evolution; imidlertid kunne forskellen skyldes analysens ydeevne for at amplikon eller et enkeltstrenget (SNP) nær eller overlappende primersekvensen der påvirkede amplifikationen af denne allel.
Hæm-NGS Panel resultater for Case 1 med AML identificeret mutationer i FLT3, IDH2, og NPM1, er tre almindeligt muterede gener i AML. Mutationer i FLT3 observeret i ~ 25% af voksne patienter med AML (COSMIC database 17) og er enten intern tandemduplikationer (ITD) eller missense mutationer i tyrosinkinasedomæne. FLT3-ITD'erne er de mere almindelige mutation og er forbundet med dårlig respons på standard kemoterapi, mens den prognostiske betydning af FLT3 kinase domain punktmutationer, som det ses i denne AML patient, har en uklar indvirkning på prognosen 14. Isocitratdehydrogenase 2 (NADP +), mitokondrie (IDH2) er et gen, som koder for en epigenetisk modifikator, der er almindeligt muteret i AML. Mutationer i epigenetiske modifikatorer er forholdsvis almindelige i AML, med mutationer i IDH1 og DNMT3A repræsenterer andre mutationer i denne klasse af gener, der fører til gen-dysregulering. Mutationer i genet for nucleophosmin (NPM1) er en af de mest almindelige erhvervede mutationer i AML og anses generelt for at være en god prognostisk faktor (i fravær af en FLT3 - ITD).
Co-mutationer af NPM1 og IDH2 er blevet beskrevet i litteraturen som en gunstig prognostisk indikator 5, med en 3-årig overordnet overlevelse på 89%. Dette repræsenterer en væsentlig overlevelsesfordel i forhold til den samlede 3-års overlevelsevildtype NPM1 og IDH2 på 31%. For eksempel, standard-pleje praksis omfatter mutation analyse for NPM 1 og FLT3-ITD mutationer. I dette scenario ville påvisning af kun en NPM1 mutation ikke passende stratificere patient for risiko, da de sekundære mutationer kan være gunstige (f.eks IDH2) eller ugunstige (f.eks TET2), reducerer tilliden til lindring af en knoglemarvstransplantation.
Case 2 - Solid-NGS Panel
DNA ekstraheret fra FFPE væv var af tilstrækkelig kvalitet og mængde for Solid-NGS Panel, med en koncentration på 252 ng / pl og kun 4% af DNA under 1.000 basepar (bp). Efter dataanalyse den gennemsnitlige dybde af dækningen var 9167 læser (langt over vores minimum dybde cutoff på 1.000 læser) uden regioner under 250 read dybde. Yderligere QC målinger er shown i tabel 3.
Oplysninger, der behandles gennem bioinformatik rørledning opdaget to sygdom-associerede mutationer: en i-frame indsættelse i exon 20 i ErbB2 (HER2 / neu) og en missense mutation i TP53. Alle exoniske varianter med deres allelfrekvenserne er repræsenteret i tabel 5. Indsættelsen i ERBB2 faktisk repræsenterer en tandem duplikeres (HER2 / neu) sekvens, som afspejles i nomenklaturen. Identifikation og bekræftelse af i-frame indsættelse kræves manuel gennemgang af sekventering læser gennem IGV. Påvisningen af mutation frekvenser på mere end 50%, som det ses for både TP53 og Her2 / neu mutationer antyder tab af heterozygositet (LOH) begivenhed (se diskussionen).
De Solid-NGS Panel resultater for Case 2 med lungeadenokarcinom fundne mutationer in ERBB2 (HER2 / neu) og TP53, to gener ikke almindeligvis testet for som en del af den nuværende standard-of-care for patienter med lungecancer. HER2 / neu koder for en tyrosinkinasereceptor svarer til et andet almindeligt muterede gen i lungekræft, EGFR . Aktivering HER2 / neu exon 20 indrykninger observeres i 2 - 4% af lunge adenokarcinomer, tegner sig for størstedelen af HER2 / neu mutationer observeret i lungekræft, og ses typisk i tumorer uden mutationer i andre driver gener såsom EGFR og ALK 12 . Der er flere linjer af beviser potentiale for forskellige behandlingsmuligheder for patienter med aktivering HER2 / neu indsættelser, herunder delvis respons på kombinationsbehandling med HER2 / neu og mTOR-hæmmere 13 og betydelig sygdomskontrol med det monoklonale antistof Trastuzumab i forbindelse med kemoterapi 15. Opdage en TP53 ændring er ikke uncommon i cancer, men på dette tidspunkt er der ingen anbefalingsrapporter terapier.
| Case 1 | Case 2 | |
| Samlet Start Læser | 2.215.926 | 2.129.110 |
| Procentdel af Læser Mapping | 98,42% | 98,29% |
| Andel af Læser på Target | 99.01% | 97,29% |
| Andel af Læser på Target Efter Filter | 97,60% | 95,45% |
| Procentdel af Brugbar Læser | 94,87% | 91,79% |
| Procentdel af Baser over 250 x Dækning | 98,40% | 100% |
| Procentdel af Baser enBove 1000 x Dækning | 95,90% | 99,70% |
| Dækning Nedenfor 250X - Amplikon Number | 8 | 0 |
Tabel 3:. Sequencing Run QC Metrics Dette er et sammendrag af de vigtigste køre statistik, ikke inklusive den gennemsnitlige dækning, der anvendes til data for at fastslå, om et bibliotek prep prøve er bestået QC. Hele processen er en succes, hvis alle procenter er over 90%, men det er muligt, med fremførsel af SW1 eller UB1 i FPU vaske trin eller primer krydstale, at have lavere "Percent på Target" i intervallet 80 - 90%. Hvis 'Percent kortlagt "er for lavt, vil der indikerer en kontaminering af bakterier eller andet DNA, som alle prøver bør tilpasse til menneske. Når en af disse specifikationer er under 80%, er prøven markeret til yderligere gennemgang at hjælpe med at bestemme, hvordan proceed og forbedre processen.
Tabel 4:.. Case 1 Resultater opdaget patogene, sygdom forbundet, variant af ukendt signifikans (VUS), og sandsynligvis godartede exoniske varianter over de rapporterende kriterier af 5% allel frekvens er vist Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 5:.. Case 2 Resultater opdaget patogene, sygdom forbundet, variant af ukendt signifikans (VUS), og sandsynligvis godartede exoniske varianter over de rapporterende kriterier af 5% allel frekvens er anført Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende Figur 1: Et eksempel på en amplikon-baserede SampleSheet.csv. Dette ark formidler til sequencer hvad kemi til at køre (i dette tilfælde Amplikon), hvad workflow (f.eks GenerateFastq), hvad Ansøgning og Assay (f.eks FastqOnly), hvor mange baser (eller læser) til sekvens (i dette tilfælde 186 bp x 186 bp), og endelig hvilke prøver er knyttet til bestemte indekser (i dette tilfælde dobbelte indeksering). De dele, der er fremhævet med gult kan ændres til hvad forsøgslederen ønsker, men i dette tilfælde laboratoriet bruger disse parametre. Klik her for at downloade dette tal.
Discussion
Da de to NGS prøver beskrevet i dette håndskrift tilbydes klinisk, den vigtigste praktiske overvejelse er kvalitetskontrol. Konkret skal tæt overvejelse betales til kvaliteten og mængden af ekstraheret DNA. Dette er især vigtigt for FFPE prøver, som ofte er meget nedbrudt med variabel DNA udbytte. En isopropanol nedbør metode blev udviklet for at maksimere DNA udbytte fra FFPE prøver som kolonne-baserede metoder viste sig at nogle gange føre til DNA klipning med begrænsede elueringsvolumener. , Det meste af tiden, når en prøve giver for lav koncentration eller er for nedbrudt til assayet, er det derfor mest sandsynligt på grund af det væv størrelse, type eller fiksering og ikke ekstraktionsprocessen. For blod / knoglemarv prøver, hvis der er et udtræk fiasko, er det normalt på grund af en prøve bliver hemodilute (dvs. ikke at have tilstrækkeligt antal hvide blodlegemer eller tumorceller i denne lodtrækning) eller kemo ablerede.
. Nt "> Under validering, bør etableres cutoffs for accepten af DNA kvalitet og kvantitet Den anbefalede effekt på 100 - 250 ng bruges ofte i analysen, men hvis DNA er god, så lavere input mængder kan blive en succes. Desuden, hvis DNA er dårlig (dvs. mængden af amplificerbare DNA er mindre end 100 - 250 ng) derefter højere input mængder kan forbedre kvaliteten af sekventeringsresultaterne (eftersom mængden af amplificerbare DNA vil nå den anbefalede input) . Metrics for DNA kvalitet og mængde bør anvendes på hver prøve før fremme DNA i biblioteket forberedelse. Disse prøver i en "gråzone" (se figur 2) bør køres skøn laboratoriets direktør eller repræsentant. i øjeblikket det bedste måde at forudsige, om DNA'et ikke vil klare sig godt i løbet sekventering er at udføre en qPCR-baseret assay der muliggør kvantificering og kvalitetsvurdering af indført DNA. Denne fremgangsmåde løser bioavailability af forskellig størrelse fragmenter i prøven, gennem amplifikation af forskellig størrelse fragmenter (f.eks 100 bp, 150 bp, 200 bp og 300 bp) og sammenligning udbytte.I øjeblikket bibliotek forberedelse involverer et stort antal manuelle trin, hvor et fejltrin på et af flere tidspunkter kan forårsage biblioteket til enten fejle eller være af dårlig kvalitet. Den mikrofluid gelanalyse er den eneste QC skridt for at kontrollere et bibliotek prep problem før sekventering. Derfor er der flere kritiske trin, hvor ekstra mindfulness kan øge sandsynligheden for en vellykket reaktion. Det er bydende nødvendigt at sikre korrekt prøven og oligonucleotidpulje anvendes til hver prøve. Sikring og ordentligt optage at hver prøve indeholder én af 96 unikke kombinationer af dobbelt-indekseret PCR primerpar reducerer chancen for en prøve mix op. Det er også vigtigt at sikre filterpladen (FPU) dræner korrekt; hvis det ikke dræne korrekt dette kan forårsage extension-ligering trin af præparatet biblioteket til at udføre suboptimalt og føre til dårlige kvalitet sekventeringsdata. Efter bibliotek QC, er det afgørende at sikre, at LNB 1 perlerne er fuldt resuspenderet og at LNB 1 / LNA1 opløsningen blandes godt før tilsætning det til prøverne som den koncentration af denne blanding anvendes til at bestemme molariteten af biblioteket. Endelig, hvis vulsten elueringstrin fører til en suboptimal mængde af biblioteket eluering fra perlerne det vil falde klyngedannelse tæthed og muligvis forårsage biblioteket til ikke opnå tilstrækkelig gennemsnitlig dækning. Omvendt vil et overskud af biblioteket føre til dårligere kvalitet læser. Derfor er det vigtigt at være konsekvent på perle-baserede normalisering skridt for at sikre optimal sammenlægning og klyngedannelse af bibliotekerne på sequencer.
Udover biblioteket forberedelse, er det vigtigt at validere en bioinformatik rørledning, som vil frembringe nøjagtige mutation opkald fra de rå, de-multiplex fastq filer. At vælge enskræddersyet løsning kan være tidskrævende, da der er mange open source og kommercielt tilgængelige aligners, variant opkaldere og NGS softwarepakker, at man ville have til at finkæmme igennem. Brugerdefinerede algoritmer bliver nødt til at være designet til at udtrække vigtige statistikker ydeevne, identificere unikke tilbagevendende mutationer, der undgik mest open source-værktøjer, og bestemme kopi nummer status over hver af loci. Under valideringsprocessen af en bioinformatik rørledning, er det vigtigt at bestemme de indberetningspligtige cutoffs for varianter der opfylder eller overstiger både en dybde på mindst dækning efter kvalitet filtrering (fx mindst 250 læser) og et minimum allel frekvens (f.eks 4 %). Da dette en multiplekset amplicon-baseret assay, er det vigtigt at bestemme den minimale gennemsnitlige dybde dækning (fx 1.000 x), at biblioteket skal opnå at kunne få den laveste udfører amplikon til dybde på mindst læser. Desuden den multipleksede natur af assayet gør cABrug off target effekter og disse "artefakter" bliver nødt til at blive opdaget og fuldt undersøgt før lanceringen. En anden vigtig begrænsning for beskrevne assay er et behov for prøver til at indeholde mere end 10% tumor for at opnå den validerede minimum allel frekvens.
Påvisningen af lav frekvens, 1%, FLT3 insertioner er bevis for, at manuel gennemgang er stadig ønskelig i denne proces. Selv med en allel frekvens cut-off på 5%, nogle vigtige mutationer måske savnet og dermed manuel gennemgang vil være afgørende for at fastslå disse varianter. For FLT3-ITD, er visuel inspektion af exon 14 udført for alle AML-patienter for at sikre et lavt niveau eller store indsættelse / duplikering går ikke ubemærket hen. Desuden HER2 exon 20 indrykninger, som normalt er ved siden primersekvensen, brug manuel indgriben. Trods en robust bioinformatik rørledning, kunne nogle varianter gå overset som er lige karakter af at have en hård cutoff for de fleste statistik nævnt ovenfor. Bedre bioinformatik vil være behov for at afhjælpe dette problem, som vil bedre bibliotek forberedelse og / eller sekventering metoder, fordi det er mere fordelagtigt at have god datakvalitet endnu lavere cutoffs der indeholder færre artefakter og falske positiver.
Påvisningen og fortolkning af allelfrekvenserne kan være vanskelig på grund af vanskeligheden i tumor procent bestemmelse og amplifikation forspænding af nogle områder af genomet. Desuden kan detekteres allelfrekvenser over 50%, som observeret i tilfælde 2. Dette tolkes som et tab af heterozygositet (LOH) begivenhed, enten som følge af tab af den normale allel, hvilket fører til den tilsyneladende stigning af mutant læser, en forstærkning af den mutante allel (f.eks 2-mutant og en normal kopi) eller andre mekanismer. Disse mekanismer kan belyses ved anvendelse af matrix komparativ genomisk hybridisering (aCGH 19) og / eller en SNP genotyping array. 20.
De nuværende mål berigelse metoder stole på heldags procedurer for enten ineffektive hybrid indfangning eller multiplex PCR-teknikker, der resulterer i behovet for mere sekventering dækning af en enkelt prøve og mere forbi mål sekventering læser. Yderligere applikationer til NGS molekylær onkologi forventes i den nærmeste fremtid vil omfatte nemmere bibliotek fremstillingsmetoder, der kan være fuldt automatiserbar og være i stand til at behandle prøver med meget lave mængder af input-DNA (dvs. mindre end 1 ng) samt prøver med meget nedbrudt DNA. For at imødegå disse udfordringer, vil de fleste metoder formentlig være PCR, enten være en flertrins PCR tilgang eller et massivt-parallel singleplex PCR tilgang. Desuden har molekylær barcoding af individuelle amplikoner blevet vist at dramatisk reducere baggrunden sekventering støj og vil tillade kontrol af prøver med lavere andele af tumorceller for at opnå lavere allelfrekvenserne og bevæge sig i retning opfange Cirkulationing tumorceller.
Påvisning af sygdomsfremkaldende mutationer i cancer prøver har været standard for pleje i årtier. Historisk set blev gener ofte testet sekventielt, ét gen / exon ad gangen, med identifikationen af en mutation, der fører til enden af testsekvens. Fremkomsten af NGS har tilladt for en mindre forudindtaget tilgang til sekventering af flere gener associeret med mange cancere parallelt føre til identifikation af multiple mutationer, der er forbundet med neoplasi. Den kliniske anvendelighed af NGS til påvisning af somatiske mutationer i cancer er stadig tydeligere. Faktisk NGS-baseret analyse af tumor prøver repræsenterer et nyt paradigme, der udfordrer traditionelle, enkelt gen test, men den kliniske anvendelighed er meget klar. Kliniske laboratorier i dag har den spændende mulighed for at gifte omhyggelig metodevalidering og test fortolkning med anvendelsen af denne kraftfulde teknologi.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende bistand fra Daniel Wild til læsning af manuskriptet og bistand i produktionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5365 | |
| Genomic DNA Reagents | Agilent Technology | 5067-5366 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technology | 5067-5585 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technology | G2965A | |
| TapeStation Analysis Software | Agilent Technology | A.01.04 or higher | |
| 96-well Tube Storage Racks | Any Vendor | ||
| 15/50 ml Tube Rack | Any Vendor | ||
| 96-well Plate Rack | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 0.5–2.5 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 1–10 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 2–20 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 10–100 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 20–200 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, single-channel, 100–1,000 μl | Any Vendor | ||
| Serological Pipettor | Any Vendor | ||
| Vortexer | Any Vendor | ||
| Ice bucket | Any Vendor | ||
| Microcentrifuge (for tubes and strip tubes) | Any Vendor | ||
| Freezer, -20 °C | Any Vendor | ||
| 4 °C Refrigerator | Any Vendor | ||
| Water or Bead Bath | Any Vendor | ||
| Incubator (37 °C) | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 1 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 5 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 10 ml | Any Vendor | ||
| Serological Pipettes, 25 ml | Any Vendor | ||
| Gloves | Any Vendor | ||
| Razor Blades/Scaples | Any Vendor | ||
| KimWipes | Any Vendor | ||
| 15 ml Conical Tube | Any Vendor | ||
| 50 ml Conical Tube | Any Vendor | ||
| Paper Towels | Any Vendor | ||
| 200 proof Ethanol | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
| 25 ml Reservoirs | Any Vendor | ||
| 10 N NaOH | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 1 – 10 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 10 – 100 μl | Any Vendor | ||
| Pipette, 8-channel, 20 – 300 μl | Any Vendor | ||
| Ice Bucket | Any Vendor | ||
| Water Squirt Bottle | Any Vendor | ||
| Alcohol Squirt Bottle | Any Vendor | ||
| Lens Cleaning Paper | Any Vendor | ||
| Plates, 96-well PCR, Semi-Skirted | Any Vendor | ||
| Tube strips, 8-well, 0.2 ml | Any Vendor | ||
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| BioShake IQ or 3000-T elm | Bulldog Bio/Q.Instruments | 1808-0506/ 1808-0517 | |
| DropPlate96 S - LabChipDS | Caliper | 128876 | |
| DropPlate96 D - LabChipDS | Caliper | 132848 | |
| DropSense96 | Caliper (Trinean) | ||
| DropQuant Software | Caliper (Trinean) | ||
| Plate Sealing Film | Denville | B1212-5S | |
| Aluminum Seal Foil | Denville | B1212-6S | |
| Nuclease-Free, Pure Water System | EMD Millipore | ||
| 5424 centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 | Both 15 ml tube and plate rotators, preferably a centrifuge that can go up to 2,500 x g. |
| Safe-Lock Tube 1.5 ml, Natural | Eppendorf | 22431021 | |
| 5 ml Tube, DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108310 | |
| 5430R Centrifuge | Eppendorf | 022620645 | Any plate rotator centrifuge will work |
| Hybex Microsample Incubator | Fisher Scientific | 1057-30-0 | |
| Hybex 0.2 ml Tube Block | Fisher Scientific | 1057-31-0 | |
| TruSeq Amplicon – Cancer Panel | Illumina | FC-130-1008 | 96 reactions |
| TruSeq Custom Amplicon | Illumina | PE-940-1011 | 96 reactions |
| TruSeq Custom Amplicon Index Kit | Illumina | FC-130-1003 | 96 Indices, 384 Samples |
| MiSeq Reagent Kit v3, 500 Cycles | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Kit v2, 300 Cycles | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles | Illumina | MS-102-2003 | |
| Experiment Manager | Illumina | 1.3 or higher | |
| MiSeq Reporter | Illumina | 2.0 or higher | |
| Sequencing Analysis Viewer | Illumina | 1.8 or higher | |
| TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit | Illumina | FC-130-1007 | |
| MiSeq v2 | Illumina | SY-410-1003 | |
| TruSeq Custom Amplicon Filter Plate | Illumina | FC-130-1006 | |
| Index Adapter Replacement Caps | Illumina | 11294657 | |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit 0.5 ml Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | |
| DynaMa6-96 Magnetic Stand, Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | |
| GeneAmp PCR System 9700 (gold/silver block) | Life Technologies | N8050200 | |
| Gentra Puregene Blood Kit | Qiagen | 158489 | |
| Deparaffinization Solution (16 ml) | Qiagen | 19093 | |
| Buffer ATL (4 x 50ml) | Qiagen | 939011 | |
| Protein Precipitation Solution (50 ml) | Qiagen | 158910 | |
| DNA Hydration Solution (100 ml) | Qiagen | 158914 | |
| Glycogen Solution (500 μl) | Qiagen | 158930 | |
| Qiagen Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| Rnase (5 ml) | Qiagen | 158924 | |
| Nuclease-Free Water (10 x 50 ml) | Qiagen | 129114 | |
| Pestles | USA Scientific | 1415-5390 | |
| TipOne RPT 10 µl elongated filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips). | USA Scientific | 1180-3810 | |
| TipOne RPT 100 µl natural, beveled filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1840 | |
| TipOne RPT 200 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-8810 | |
| TipOne RPT 20 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1810 | |
| TipOne RPT 1,000 μl natural, graduated XL filter pipet tips in | USA Scientific | 1182-1830 |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Campbell, P. J., et al. The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).
- Frampton, G. M., et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).
- Patel, J. P., et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).
- Forbes, S. A., et al. COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).
- Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies. Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).
- Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use. Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).
- Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. Molecular genetics in acute myeloid leukemia. Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).
- Subramanian, J., Govindan, R. Lung cancer in "Never-smokers": a unique entity. Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).
- Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma. Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).
- Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).
- Gandhi, L., et al. Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors. J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).
- Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients. Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).
- Mazières, J., et al. Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives. J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).
- Robinson, J. T., et al.
- Forbes, S. A., et al. COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).
- Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets. Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).
- Haraksingh, R. R., et al. Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms. PLoS ONE. 6 (11), e27859 (2011).
- de Leeuw, N., et al. SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control. Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).
