Introduction
Het doel van deze methode is het detail een techniek om geheel intact glaslichaam te isoleren, met het glaslichaam kern en cortex intact, van een kadaver oog, met het oog op vitreodynamic analyse. Aangezien het gebied glasachtig fysiologie gegroeid, multidisciplinaire onderzoekers, zoals vloeistofmechanica onderzoekers onderzoeken de fysische en biomechanische eigenschappen van het glasachtige lichaam 1. Hiertoe is het noodzakelijk om detail een techniek om het gehele, intacte glaslichaam isoleren multidisciplinaire onderzoekers bevorderen.
Sebag et al. 2 ea 3 uitgevoerd elegant geheel glasachtige ontledingen menselijke kadaver ogen en vertoonde afbeeldingen van de resultaten. Echter, de techniek niet in detail en leken beschreven niet kunnen de werkwijze zelfstandig repliceren. Andere studies hebben glasvocht van kadaver ogen met eenvoudigere methoden zoals aspiratie of gedeeltelijke dissectie geoogst,beide niet leiden tot een geheel, intact glaslichaam. Gisladottis et al. 4 en Xu et al. 5 onderzoeken permeabiliteit in glasvocht geoogst kadaver ogen. Aangezien echter geen werkwijze voor het glasachtige extractie werd beschreven, werd aangenomen dat zij aangezogen het glasvocht met een spuit. Watts et al. 6 ging nog een stap verder door het beschrijven van een methode voor het isoleren van konijn glasvocht met een chirurgische techniek. Echter, deze werkwijze resulteert in een isolatie van enkel het glasvocht kern en niet het glasvocht cortex. Skeie et al. 7 later organiseerde het glasvocht in 4 unieke regio en elegant beschreven een methode te ontleden uit elk onderdeel voor analyse. Deze techniek echter niet tot een intacte glaslichaam als geheel.
De huidige techniek werd ontwikkeld biofysische experimenten die momenteel alleen worden uitgevoerd kadaver ogen vergemakkelijken. Vorige werkwijzen, zoals beschreven eenbove worden beperkt doordat 1) er geen volledig isoleren van de gehele glaslichaam, 2) geoogst glasachtige kern cortex gehomogeniseerd, 3) glasachtige anatomische structuur niet behouden blijft, of 4) dissectie technieken niet voldoende gedetailleerd voor replicatie door onderzoekers in andere gebieden . Bovendien, vanwege de ondoorzichtigheid van sclera en choroidea, visualisatie van het glasachtige lichaam is beperkt in de intacte oogbol. Dit beperkt de nauwkeurigheid en haalbaarheid van metingen die worden uitgevoerd in het gehele oog. Bovendien kan de anatomische structuren rond het glasachtige de studie van biochemische en fysische eigenschappen van het glasachtige lichaam verwarren.
In de afgelopen jaren heeft het lichaam van glasvocht wetenschap enorm gegroeid en er is reden om te geloven dat het hele glasachtig lichaam heeft andere eigenschappen dan de afzonderlijke delen. Er is een groeiende interesse in het onderzoek naar de fysieke, biomechanische en chemische eigenschappen van het glasvocht van vitreodynamics research, welke toepassingen in de klinische geneeskunde, zoals drug delivery, intravitreale zuurstofvoorziening 8 en vitrectomie heeft. Farmacologische vitreodynamics, die farmacologische middelen gebruikt om het glaslichaam te manipuleren, kan worden gebruikt vitrectomie resultaten 9 verbeteren. Biomechanische eigenschappen worden gebruikt om in glasachtige fluïdumstroming, die kan worden gebruikt om intravitreale technologieën voor medicijnafgifte 10-12 verbeteren. Fysische eigenschappen van verschillende segmenten van het glasachtige cruciaal voor vitreo-retinale zuurstoftransport 13 begrepen. De voorgestelde glasvocht dissectie techniek kan worden gebruikt om verschillende eigenschappen van het intacte glasvocht bestuderen. Het maakt bench-top experimenten worden gedaan op de hele, intacte glasachtig lichaam met een betere visualisatie.
Samenvattend, de huidige werkwijzen voor onderzoek van het glasachtige lichaam ofwel niet voldoende beschreven, of leiden tot een onvolledige isolatie het glasachtige kern en cortex. Daarom is er behoefte aan e voerenxperiments transparante oogmodel met behoud van de anatomie van het glasvocht die bestaat in het kadaver oog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle enucleated ogen werden verkregen van een slachthuis en alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele bioveiligheid wetten.
- Secure verwijderde oog neer op een oppervlak. Doe dit door het plaatsen van het weefsel pennen door het overtollige weefsel rond de ogen en het veiligstellen van het neer in een piepschuim bord.
- Ontleden en los perilimbal bindvlies van het oog.
- Gebruik fijn pincet (0,3 tang) en microscissors (Westcott schaar) om het bindvlies incise aan de limbus en botweg ontleden het van de sclera. Knip de conjunctiva aan de limbus de stompe dissectie door naar verdere dissectie staan.
- Verwijder conjunctiva helemaal rond het oog (360 graden) zoveel sclera mogelijk bloot.
OPMERKING: Het is nuttig om een kleine hoeveelheid bindvlies te verlaten om te vergemakkelijken fixeren van het oog met de chirurgische pennen of een pincet in de rest van de procedure.
- Maak een volledige dikte oogvliesflap langs éénzijde van het oog (scalpel 69).
- Wordt ~ 5 mm sclerale incisie parallel aan de limbus en 3 mm achter de limbus door voorzichtig snijden in de sclera van een scalpel (scalpel 11) tot donkergekleurde choroid zichtbaar. Wees voorzichtig het vaatvlies zelf niet insnijden.
- Zorgvuldig ontleden langs het vlak tussen de sclera en choroidea, hetzij met een schaar (met stompe dissectie) of de scalpel, totdat het mogelijk te vergroten mogelijke ruimte tussen deze weefsels door op de choroidea voorzichtig naar binnen.
- Voeg een sclerale incisie loodrecht op de eerste sclerale incisie met scherpe microscissors, waardoor een T-vormige insnijding.
- Dan blijven bot ontleden in een omtreksrichting wijze als de sclerale weefsel van het onderliggende choroidea verwijderen en duw choroid weg van de sclera zoals hierboven vermeld.
- Vergroot de oogvliesflap als nodig is.
- Voorzichtig blunt ontleden het vaatvlies weg van de sclerahet gehele proces.
- Vergroot de klep tot de incisie gemaakt loodrecht op de limbus bereikt de oogzenuw en incisie gemaakt evenwijdig aan de limbus ten minste een derde van het oog omtrek (45 °).
- Gebruik de oogvliesflap als een bron van hefboomwerking voor het manipuleren van het oog tijdens stompe dissectie. De teller-grip op de flap vergemakkelijkt het stompe dissectie.
- Herhaal de vorige stap anderzijds sclerale flap.
- Knip de sclerale flappen om een groot gebied van choroidea bloot.
- Blijven de incisie gemaakt in stap 3 rond het oog omtrek (360 graden).
- Verwijder het resterende choroid-retina tissue.
- Binnen het blootgestelde gebied, gebruik dan een katoenen-tip zachtjes borstel uit de choroid-retina weefsel overgebleven. Als alternatief, voorzichtig pak het weefsel met een tang en afschilferen van de onderliggende glasachtig lichaam.
- Indien nodig maakt een incisie in de choroid stArting van de oogzenuw. Dan afpellen het vaatvlies voorzichtig aan het netvlies en het glasvocht cortex bloot.
- Verder stompe ontleden choroid weg van de sclera en dan afpellen het vaatvlies aan het geheel, intact glasachtige verkrijgen.
- Gebruik de sclerale rand bevestigd aan de cornea om de hele glaslichaam op de gewenste plaats te positioneren. Op dit punt wordt het glasachtig lichaam aan het voorste sclera en bevestigde lens.
- Stompe ontleden het glasvocht van het inwendige van de sclera rond de lens en het verwijderen van sclera.
- Gebruik een stomp gereedschap om uit de buurt van het glasvocht schep de lens indien nodig. Gebruik het monster voor verschillende vitreodynamic experimenten.
- Leg het monster in een bekerglas met een bekende oppervlakte blootgesteld aan de lucht. Plaats zuurstofgevoelige probe aan de rand van het monster. Gebruik van een micro-manipulator om de sonde naar een bekende afstand (r) in het monster.
- Gebruik Wet van Fick aan de theoretische diffusievergelijking verkrijgen. Met de data verzameld in stap 10.1, het verkrijgen van de experimentele diffusiecoëfficiënt / reactie term etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het protocol tot een goed glasachtige dissectie met de kern en cortex (figuur 3) intact. Dit blijkt uit de resterende delen van het netvlies gehecht aan het glasvocht cortex. Intact hele glasachtig lichaam kan worden gebruikt op verschillende manieren bepaald vitreodynamic experimenten. In ons geval, de diffusiesnelheid van zuurstof in intacte glasvocht en het bijbehorende tijdsconstante onderzocht (Figuur 2). Glasachtig die werd ontleed (kern en cortex) in onze methode werd in een glazen beker met een bekende blootgestelde oppervlak. Dit werd vergeleken met glasachtige dat werd geoogst onder toepassing van een eerder gepubliceerde werkwijze dat slechts isoleert glasachtige kern 6. Alle andere factoren waren consistent in de experimentele en controle groepen gehouden. Het glasachtige oppervlak werd blootgesteld aan lucht die een bekende zuurstofspanning (~ 160 mmHg) heeft. De zuurstof spanning binnen het glasvocht laag was (<10 mmHg). Op basis van de snelheid van VitrEOUS zuurstofverbruik bepaald Shui et al. 14 voor glasachtige in de geltoestand, kunnen we de vergelijking voor 1 dimensionale transport van zuurstof (in steady state of onstabiele formulieren) gebruikt. Door meting van de zuurstofspanning een bekende afstand binnen het glasachtige oppervlak, kunnen proefondervindelijk valideren diffusiecoëfficiënt. De zuurstofspanning werd opgenomen met een zuurstofsonde zoals Oxford, en de foutfrequentie is ± 10%. Een monster werd verzameld elke 30 sec. De aanwezigheid van glasvocht cortex beïnvloedt de diffusiesnelheid van zuurstof in het midden van glasvocht. In aanwezigheid van glasvocht cortex, de diffusie van zuurstof optreedt over een langere tijdsinterval.
De fysische eigenschappen van het glasvocht kern en cortex hebben een impact op gezondheid en ziekte. Bijvoorbeeld, gelokaliseerd aanvullende intraoculaire oxygenatie is voorgesteld als een behandeling voor retinale ischemie 8. Inzicht in de verschillende diffusiecoëfficiënten voor zuurstof door glasvocht cortexkern zal onderzoekers in staat om de werkelijke snelheid van de zuurstof levering aan het netvlies te voorspellen.
Figuur 1:. Dwarsdoorsnede aanzicht van het oog weergeven van relevante anatomische structuren (gemodificeerd van National Eye Institute, National Institutes of Health) Het hoornvlies is de transparante weefsel de voorste grootste gedeelte van het oog vormt en een aanzienlijke deel van het oog optische macht. De limbus is de verbinding van de cornea, sclera en conjunctiva. De sclera loopt vanaf de limbus tot de meest postérieure aspect van het oog waar het de oogzenuw. De conjunctiva is een dun epitheel dat lijnen de buitenkant van het oog en vormt de grens tussen de buitenomgeving en de sclera. De inwendige componenten van het oog uit de voorste oogkamer, lens, iris, ciliaire lichaam, achterste kamer, postérieure holte retina en choroidea. De vitreous kern omvat het centrale gebied van het glasachtige lichaam, in de achterste holte van het oog. De glasvocht cortex ligt rond het glasachtige lichaam en het netvlies wordt bevestigd op meerdere plaatsen waaronder de pars plana, retinale vaten, papil en macula. Het glasvocht basis is een driedimensionaal gebied dat van ~ 2 mm anterieur uitstrekt tot de ora serrata tot 3 mm achter de ora serrata. De choroid is een vasculaire weefsellaag, die tussen de sclera en de retina en levert bloedtoevoer naar de buitenste retina. Het netvlies is het neurosensorische laag van het oog dat het licht zendvermogen van het oog subserves. De sclera is de witte ondoorzichtige laag die grootste deel van de structurele steun voor het oog muur biedt.
Figuur 2:. Perceel van zuurstof spanning van glasvocht tegen de tijd Plot zuurstof spanning in glasvocht kern (groene lijn) in vergelijking met intacte hele vitreous (blauwe lijn). Een zuurstof sensor probe is in het midden van het monster geplaatst en het monster werd blootgesteld aan lucht die een zuurstofspanning van 160 mmHg heeft.
Figuur 3: Voorbeelden van geïsoleerde gehele corpus vitreum. Top beeld is een voorbeeld van het gehele intacte glaslichaam nog aan de sclerale velg. Middle beeld is een voorbeeld van het gehele intacte glasachtige lichaam zonder sclera maar met enige resterende retinaweefsel. Bottom is een voorbeeld van hele, intacte glaslichaam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd tijdens glasachtige dissectie. Stap 3, waardoor een volledige dikte sclerale flap, is cruciaal voor het gehele dissectie. Zorg moet worden genomen om niet tot plaatjes choroid bij het maken van de volledige dikte sclerale flap. De andere belangrijke stap is het ontleden weg de sclera van het vaatvlies. Deze stap moet zorgvuldig worden gedaan om te voorkomen dat het creëren van meerdere gaten in het vaatvlies van waaruit het glasvocht kunnen morsen. Er is een manier om het protocol te wijzigen en nog steeds ontleden intact hele glasvocht. Stap 6 kan worden uitgesteld tot stap 8. De choroid aan het uiteinde kan worden verwijderd na het glasachtige weefsel wordt geplaatst in de gewenste locatie.
De beperking van deze procedure is dat tijdens dissectie, zijn er slechts visuele aanwijzingen om het succes en de nauwkeurigheid van het intacte glasachtige dissectie stellen. Aangezien het glasvocht kern en cortex transparante en niet te onderscheiden met het blote oog, ditkan een uitdaging zijn. Door opmerken van de hechting van de retina op het glasachtig lichaam is het mogelijk te bepalen of een succesvolle ontleding van het glasvocht cortex opgetreden. Anders, farmacologische stoffen, zoals Kenalog, kunnen worden gebruikt om visualisatie 15 van het glasachtige lichaam te verbeteren, maar kan niet gemakkelijk onderscheid kan worden gemaakt tussen glasvocht cortex en glasachtige kern. Een andere beperking van deze techniek is dat het meest effectief is voor de ontleding van glasachtige gel. Menselijke glasvocht een niet-regeneratief weefsel dat vloeibaar ondergaat met de leeftijd. Dit vloeibaar weerhoudt ons helemaal ontleden het geheel, intact glasvocht van het oog. Aldus onze techniek slechts betrekking glasachtige van dieren, zoals koeien, varkens of konijnen, of ogen van jonge mensen die geen significante hoeveelheden vloeibaar hebben. De glasachtige humor in deze dieren de neiging om volledig in een geltoestand.
Echter, op dit moment, is er geen vaste methode, die desc is geweestribed in detail, te ontleden geheel intact glasvocht van kadaver ogen. Momenteel is de enige glasvocht dissectie technieken die goed zijn beschreven omvatten de ontleding van unieke maar afzonderlijke gebieden van het glasachtige lichaam 7 of dissectie van alleen de glasachtige kern 6.
De toepassingen van ontleed intact glasvocht onder gewaardeerd en onderbenut. Chirurgische ervaring met het glaslichaam en klinische, biochemische en histopathologische studies suggereert dat de chemische en structurele eigenschappen van het glasachtige lichaam significant 16,17 kan variëren. Derhalve is het noodzakelijk om de structuur van het gehele glasachtig lichaam behouden de functie van het glasachtige lichaam bij oculaire fysiologie en anatomie te bestuderen. Intact glasvocht kan worden geëxplanteerd een transparante bol voor een betere visualisatie tijdens experimenten. Zij kunnen dan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan mechanische / chemische tests om de metingen van fysische / biomechanische prop verbeterenschappen van het glasvocht. Zo stellen wij voor dat de ontleed gehele intacte glaslichaam kan worden gebruikt in plaats van zoutoplossing, viskeuze substituten of glasvocht kern in de genoemde rheologie experimenten 6,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 forceps | Storz Opthalmics | E1793 | |
| Westcott Tenotomy Scissors Curved Right | Storz Opthalmics | E3320 R | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Scalpel Blade, #11, for #3 Handle | VWR | 470174-844 |
References
- Siggers, J. H., Ethier, C. R.
- Sebag, J. Age-related changes in human vitreous structure. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 225 (2), 89-93 (1987).
- Grignolo, A.
- Gisladottir, S., Loftsson, T., Stefansson, E. Diffusion characteristics of vitreous humour and saline solution follow the Stokes Einstein equation. G Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 (12), 1677-1684 (2009).
- Xu, J., Heys, J. J., Barocas, V. H., Randolph, T. W. Permeability and diffusion in vitreous humor: implications for drug delivery. Pharm Res. 17 (6), 664-669 (2000).
- Watts, F., Tan, L. E., Wilson, C. G., Girkin, J. M., Tassieri, M., Wright, A. J. Investigating the micro-rheology of the vitreous humor using an optically trapped local probe. Journal of Optics. 16 (1), 015301 (2014).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), e2455 (2011).
- Abdallah, W., Ameri, H., et al. Vitreal oxygenation in retinal ischemia reperfusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 1035-1042 (2011).
- Goldenberg, D., Trese, M. Pharmacologic vitreodynamics: what is it? Why is it important. Expert Review of Ophthalmology. 3 (3), 273-277 (2008).
- Choonara, Y. E., Pillay, V., Danckwerts, M. P., Carmichael, T. R., du Toit, L. C. A review of implantable intravitreal drug delivery technologies for the treatment of posterior segment eye diseases. J Pharm Sci. 99 (5), 2219-2239 (2010).
- Balachandran, R. K., Barocas, V. H. Computer modeling of drug delivery to the posterior eye: effect of active transport and loss to choroidal blood flow. Pharm Res. 25 (11), 2685-2696 (2008).
- Smith, C. a, Newson, T. a, et al. A framework for modeling ocular drug transport and flow through the eye using micro-CT. Phys Med Biol. 57 (19), 6295-6307 (2012).
- Quiram, P. A., Leverenz, V. R., Baker, R. M., Dang, L., Giblin, F. J., Trese, M. T. Microplasmin-induced posterior vitreous detachment affects vitreous oxygen levels. Retina. 27 (8), 1090-1096 (2007).
- Shui, Y., Holekamp, N. The gel state of the vitreous and ascorbate-dependent oxygen consumption: relationship to the etiology of nuclear cataracts. Arch Ophthalmol. 127 (4), 475-482 (2009).
- Burk, S. E., Da Mata, A. P., Snyder, M. E., Schneider, S., Osher, R. H., Cionni, R. J. Visualizing vitreous using kenalog suspension. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 645-651 (2003).
- Spaide, R. Visualization of the Posterior Vitreous with Dynamic Focusing and Windowed Averaging Swept Source Optical Coherence Tomography. Am J Ophthalmol. S0002-9394 (14), 00537-00536 (2014).
- Domalpally, A., Gangaputra, S., Danis, R. P. Diseases of the Vitreo-Macular Interface. 21, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. 21-27 (2014).
- Stocchino, R., Repetto, A., Cafferata, C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model. Phys Med Biol. 50 (19), 4729-4743 (2005).
